(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811088112.1
(22)申请日 2018.09.18
(71)申请人 山东商业职业技术学院
地址 250100 山东省济南市历城区山东济
南旅游路4516号
(72)发明人 杜国辉 姜冬峰 王春慧 刘永慧
徐翠翠 张学娜 齐沙沙
(74)专利代理机构 济南舜昊专利代理事务所
(特殊普通合伙) 37249
代理人 宋玉霞
(51)Int.Cl.
G01N 30/02(2006.01)
G01N 30/06(2006.01)
G01N 30/14(2006.01)
G01N 30/72(2006.01)
(54)发明名称
法
(57)摘要
本发明属于兽药残留量测定的技术领域，特
别是涉及鸡蛋中甲硝唑及其代谢物残留量的测
具体是使用有机溶液提取样品中甲硝唑及羟基甲硝唑，通过液液萃取去除脂类，利用
PRIME HLB固相萃取柱进一步去除提取液中干扰
物，最后采用超高效液相-质谱/质谱联用仪
（HPLC/MS/MS）检测。结果表明：本发明方法中甲
硝唑的保留时间为0.64 min，羟基甲硝唑的保留
时间为0.82 min，线性范围在0.5ng/ml -100ng/
ml，检出限为0.5μg/kg，回收率80-
110%。权利要求书1页 说明书4页 附图2页CN 109254090 A 2019.01.22
C N 109254090
A
1.鸡蛋中甲硝唑及其代谢物残留量的测定方法，具体步骤如下：
（1）提取：样品2-5g，于50 ml离心管中，加乙腈5-20 mL，加入无水硫酸钠1-5g，涡旋混匀，6000-10
000转/分，离心5-10min；取上层溶液，加入5-20 mL正己烷，涡旋，6000-10000转/分，离心5-10min ，下层溶液待净化；
（2）净化：取上述步骤（1）得到的下层溶液2-5mL，加载到PRIME HLB固相萃取柱（200mg，6cc ），保持一秒一滴流速，收集全部流出液；
（3）浓缩：取1-4mL上述步骤（2）得到的流出液氮气吹干，加入1.0mL 0.1%甲酸水-甲醇，溶解残渣，过0.2μm微孔滤膜，上HPLC/MS/MS测试；
（4）测定：采用液相谱法进行检测，其中谱柱为Acq μity BEH C18（2.1mm*5mm，1.7μm ），柱温：30-40℃，进样量：1μl；流动相：溶剂A为0.1%甲酸水，溶剂B为乙腈，梯度洗脱，鸡蛋中甲硝唑及羟基甲硝唑最低检出均为浓度为0.5μg/kg。
2.根据权利要求1所述的鸡蛋中甲硝唑及其代谢物残留量的测定方法，其特征在于，甲硝唑及其代谢物，涉及甲硝唑及羟基甲硝唑。
3.根据权利要求1所述的鸡蛋中甲硝唑及其代谢物残留量的测定方法，其特征在于，步骤（3）中，甲酸水和甲醇的体积比为50：50。
4.根据权利要求1所述的鸡蛋中甲硝唑及其代谢物残留量的测定方法，其特征在于，质谱条件：离子源：
ESI(+)；毛细管电压：3.0KV；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：450℃；锥孔反吹气流量：50L/h；脱溶剂气流量：800 L/h，检测方式为多反应监测模式扫描（MRM ）。
5.根据权利要求1所述的鸡蛋中甲硝唑及其代谢物残留量的测定方法，其特征在于，步骤（4）中，柱温：35℃。
权 利 要 求 书1/1页CN 109254090 A
鸡蛋中甲硝唑及其代谢物残留量的测定方法
技术领域
[0001]本发明属于兽药残留量测定的技术领域，特别是涉及鸡蛋中甲硝唑及其代谢物残留量的测定方法。
背景技术
[0002]甲硝唑属于硝基咪唑类药物，在农业生产中，常作为驱除动物体内寄生虫的药物，加入动物饲料后，造成鸡蛋中甲硝唑的残留。由于甲硝唑对人体有多种毒副作用，尤其是具有潜在致癌性和致遗传性变异作用，而且甲硝唑进入人体后能快速分布于全身，因此对鸡蛋中甲硝唑及其代谢产物残留的检验非
常必要。我国农业部193号公告，要求不得用于鸡蛋。目前甲硝唑及其代谢物含量测定方法大多采用液相谱法或液相谱串联质谱法，国家现行的标准方法中采用固相萃取法、GPC法进行样品预处理或采用内标法定量，过程繁琐，成本较高。
发明内容
[0003]为了解决目前甲硝唑及代谢产物检测的过程繁琐、成本较高的问题，本发明提供了一种使用超高效液相-质谱/质谱联用仪（HPLC/MS/MS）法测定鸡蛋中甲硝唑及其代谢物残留量的方法。具体是使用有机溶液提取样品中甲硝唑及羟基甲硝唑，通过液液萃取去除脂类，利用PRIME HLB固相萃取柱进一步去除提取液中干扰物，最后采用超高效液相-质谱/质谱联用仪（HPLC/MS/MS）检测。结果表明：本发明方法中甲硝唑的保留时间为0.64 min，羟基甲硝唑的保留时间为0.82 min，线性范围在0.5ng/ml-100ng/ml，检出限为0.5μg/kg，回收率80-110%。
[0004]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
鸡蛋中甲硝唑及其代谢物残留量的测定方法，具体步骤如下：
（1）提取：样品2-5g，于50 ml离心管中，加乙腈5-20 mL，加入无水硫酸钠1-5g，涡旋混匀，6000-10000转/分，离心5-10min；取上层溶液，加入5-20 mL正己烷，涡旋，6000-10000转/分，离心5-10min，下层溶液待净化；
（2）净化：取上述步骤（1）得到的下层溶液2-5mL，加载到PRIME HLB固相萃取柱（200mg，6cc），保持一秒一滴流速，收集全部流出液；
（3）浓缩：取1-4mL上述步骤（2）得到的流出液氮气吹干，加入1.0mL 0.1%甲酸水-甲醇，溶解残渣，过0.2μm微孔滤膜，上HPLC/MS/MS测试；
（4）测定：采用液相谱法进行检测，其中谱柱为Acqμity BEH C18（2.1mm*5mm，1.7μm），柱温：30-40℃，进样量：1μl；流动相：溶剂A为0.1%甲酸水，溶剂B为乙腈，梯度洗脱，鸡蛋中甲硝唑及羟基甲硝唑最低检出均为浓度为0.5μg/kg。
[0005]本发明中，甲硝唑及其代谢物，涉及甲硝唑及羟基甲硝唑。
[0006]作为优选，步骤（3）中，甲酸水和甲醇的体积比为50：50。
[0007]作为优选，质谱条件：离子源：ESI(+)；毛细管电压：3.0KV；离子源温度：150℃；脱
溶剂气温度：450℃；锥孔反吹气流量：50L/h；脱溶剂气流量：800 L/h，检测方式为多反应监测模式扫描（MRM）。
[0008]作为优选，步骤（4）中，柱温：35℃。
[0009]本发明的有益效果为：
本发明方法可以有效避免样品中的基质干扰，获得良好的效果。本发明的鸡蛋中甲硝唑及羟基甲硝唑残留量的测定方法具有较高的准确度、精密度和灵敏度，操作简单快捷，回收率高，杂质干扰小，可以有效的测量甲硝唑及羟基甲硝唑在鸡蛋中的含量。
[0010]总之，本发明的检测鸡蛋中甲硝唑及其代谢物羟基甲硝唑残留量的方法，无需内标，无需空白基质进行工作曲线的校正，操作简单、准确、精密度高、定量检出限可达0.5μg/ kg。
附图说明
[0011]图1为鸡蛋对照；
图 2为鸡蛋中甲硝唑添加图；
图3 为鸡蛋中羟基甲硝唑添加图。
具体实施方式
[0012]为了更充分的解释本发明的方案，提供鸡蛋中甲硝唑及羟基甲硝唑残留的测定方法的实施实例。这些实施实例仅仅是解释，而不是限制本发明的范围。其中所用的原料均有市售。
[0013]、试验材料
试剂与材料：乙腈，纯水（millipore公司），PRIME HLB（200mg, 6CCwaters 公司）。[0014]标准品：甲硝唑，羟基甲硝唑。
[0015]仪器：Acqμity UPLC超高效液相谱仪（Waters公司），TQS串联四极杆质谱仪（Waters公司），固相萃取仪（Waters公司），高速分散机，氮吹仪。
[0016]、试验方法
提取：样品5g，于50 ml离心管中，加乙腈10 mL，加入无水硫酸钠5g，涡旋混匀，8000转/分，离心5min。取上层溶液，加入10 mL正己烷，涡旋，8000转/分，离心5min，下层溶液待净化。
[0017]净化：取上述溶液2-5mL，加载到PRIME HLB固相萃取柱，保持一秒一滴流速，收集流出液。
[0018]、仪器分析条件
3.1 HPLC条件
谱柱为Acqμity BEH C18（2.1mm*5mm，1.7μm），柱温：35℃，进样量1μl。流动相：溶剂A 为0.1%甲酸水，溶剂B为乙腈，梯度洗脱。
[0019]表1 HPLC梯度洗脱程序
3.2 质谱条件
离子源：ESI(+)；毛细管电压：3.0KV；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：450℃；锥孔反吹气流量：50L/h；脱溶剂气流量：800 L/h，检测方式为多反应监测模式扫描（MRM）。[0020]表2质谱条件
4、方法的最低检出浓度
应用上述方法操作，在鸡蛋中分别添加甲硝唑、羟基甲硝唑标准品，添加浓度为0.5μg/ kg。以仪器3倍信噪比S/N设定为仪器检出限。计算得鸡蛋中甲硝唑及羟基甲硝唑的最低检出浓度为0.5μg/kg。
[0021]、方法的回收率和相对标准偏差
在鸡蛋中分别添加甲硝唑、羟基甲硝唑标准品，添加浓度为0.5μg/kg、1.0 μg/kg和5.0 μg/kg，重复5次，试验结果见表3。试验表明，回收率符合兽药检测要求，证明了该方法有较好的回收率和重复性。
[0022]表3 甲硝唑、羟基甲硝唑添加回收试验
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议