基于酶解及美拉德反应的植物源肉味调味料及其制备方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种基于酶解及美拉德反应的植物源肉味调味料及其制备方法。

背景技术：

2.生物酶解技术通过酶催化反应使底物分解，具有反应条件温和，反应效率高，专一性强等特点，传统的物质提取采用高温或有机溶剂提取，提取效率低，且大部分物质活性物质容易遭到破坏，增加成本的同时，影响原料的后续利用。相比之下，生物酶解技术通过选择合适的酶种类、酶解温度、酶解时间以及ph等，能够高效降解底物同时最大程度保持物质活性。另外，酶的本质为蛋白质，酶解完成后通过灭酶工艺将其分解，对原料无毒无害，在食品工业中十分适用。
3.随着社会的发展，食品工业迅速发展，人们对食品调味料的要求也日益增加，向健康、营养、口感等方向发展。美拉德反应是广泛存在于食品工业中的一种非酶褐变反应，受到底物种类及浓度、反应温度、反应时间、ph值等的影响，反应时间太短，不能形成足够的风味物质使成品风味较淡；时间太长则容易反应过度，导致过度焦糖化反应导致苦味，使产品整体风味变差。反应温度过高，会使营养成分遭到破坏，甚至产生致癌物质，对食品安全造成影响；反应温度过低，会导致反应速度减慢，增加加工成本的同时，也会影响风味物质的形成，达不到预期效果，因此控制美拉德反应的温度及时间以保证最终反应物的风味是十分必要的。
4.目前市场上的肉味调味料多以动物源水解蛋白、动物加工副产物等为原料进行制备，对于追求肉味而又不食用动物源产品的素食主义者，以及不添加动物源成分的素(仿)肉制品存在一定的使用限制，因此开发一种风味丰富、肉味浓郁且适合各类人及产品的植物源肉味调味料是十分有意义的。

技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种基于生物酶解及美拉德反应的植物源肉味调味料及其制备方法。
6.为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种基于酶解及美拉德反应的植物源肉味调味料的制备方法，包括以下步骤：
7.1)取100份复合植物蛋白原料，加入500-1500份水，搅拌均匀；
8.2)将步骤1)所得悬浊液调节ph至7.0-8.5，加入1-2份蛋白酶及2-4份风味蛋白酶，50-60℃下酶解3-5h；所述蛋白酶选自木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等中的至少一种，优选木瓜蛋白酶；
9.3)将步骤2)所得酶解液沸水浴10-15min灭酶，再放入冰浴冷却降温；
10.4)将步骤3)所得酶解完成液8000rpm离心10-15min，过滤后保留上清液，用10-12kda柱子进行超滤；
11.5)取100份步骤4)所得超滤液，加入氨基酸1-2份、维生素1-2份、糖3-5份、核苷酸1-2份和酵母提取物1-2份，加热发生美拉德反应，反应结束后立即冰浴冷却降温；
12.6)取步骤5)所得美拉德反应产物100份，加入0.5-1.5份白砂糖和食盐的混合物，所述混合物中白砂糖和食盐按等质量比混合，冷冻干燥，得到基于生物酶解及美拉德反应的植物源肉味调味料。
13.本发明中，所述份为重量份。
14.优选地，所述复合植物蛋白原料包括大豆蛋白40-60％、小麦蛋白20-30％及大米蛋白20-30％，它们的质量百分数之和为100％。
15.优选地，所述氨基酸为半胱氨酸。
16.所述维生素为硫胺素。
17.优选地，所述糖由木糖和葡萄糖混合而成，其中木糖20-30％，葡萄糖70-80％，它们的质量百分数之和为100％。
18.优选地，所述核苷酸由5
’‑
鸟苷酸(gmp)和5
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肌苷酸(imp)按等质量比混合而成。
19.步骤5)中，加热温度为90-110℃，反应时间为4-7h。
20.第二方面，本发明提供按照所述方法制备的植物源肉味调味料。
21.借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
22.(一)本发明提供基于生物酶解反应，优选木瓜蛋白酶及风味水解酶进行复合酶解，控制反应温度及ph值，酶解复合植物蛋白，提高酶解效率的同时反应条件简单易控制。
23.(二)本发明优选大豆蛋白、小麦蛋白、大米蛋白复配作为酶解底物，原料来源广泛易获得，弥补了单一植物蛋白中氨基酸组成的缺陷，使酶解液中氨基酸组成与动物源性食品更加接近，制成的调味料类肉风味更显著。
24.(三)本发明采用90-110℃进行4-7h美拉德反应，在确保美拉德反应充分进行的同时，避免由于温度过高导致的不良风味的产生。
25.(四)本发明优选半胱氨酸、核苷酸、硫胺素、酵母提取物等与植物蛋白酶解液一同进行美拉德反应，生成吡嗪、呋喃、噻吩及含硫化合物成分，使最终调味料类肉风味更加浓郁协调，能够添加到各类食品中使用，补充产品风味，增加鲜味及类肉风味。
附图说明
26.图1为本发明植物源肉味调味料制备流程图。
27.图2为本发明较佳实施例中植物源肉味调味料感官评价结果。
28.图3为本发明较佳实施例中所制备的植物源肉味调味料成品外观。
29.图4为本发明实施例1中制备的植物源肉味调味料gc-ms总离子流图。
30.图5为本发明实施例4中蛋白酶的优化实验结果。
具体实施方式
31.本发明提供一种基于生物酶解及美拉德反应的植物源肉味调味料及其制备方法，该制作方法简单，条件易控制，原料成本低，所制得的纯植物源肉味调味料风味丰富、肉味浓郁，适用于添加到各种食品中。
32.本发明采用如下技术方案：
33.本发明提供一种基于生物酶解及美拉德反应的植物源肉味调味料的制备方法，所述方法包括以下步骤：
34.1)取100份复合植物蛋白原料，加入500-1500份水，搅拌均匀；
35.2)将步骤1)所得悬浊液调节ph至7.0-8.5，加入1-2份木瓜蛋白酶及2-4份风味蛋白酶，50-60℃下复合酶解3-5h；
36.3)将步骤2)所得酶解液沸水浴10-15min灭酶，再放入冰浴冷却降温；
37.4)将步骤3)所得酶解完成液8000rpm离心10-15min，过滤后保留上清液，用10kda柱子进行超滤；
38.5)取100份步骤4)所得超滤液，加入氨基酸1-2份，维生素1-2份，糖3-5份，核苷酸1-2份，酵母提取物1-2份，加热反应，加热结束后立即冰浴冷却降温；
39.6)取步骤5)所得溶液100份，加入0.5-1.5份白砂糖和食盐(质量比为1:1)，冷冻干燥后得到基于生物酶解及美拉德反应的植物源肉味调味料。
40.步骤1)中，所述复合植物蛋白原料包括大豆蛋白40-60％、小麦蛋白20-30％及大米蛋白20-30％。它们的质量百分数之和为100％。大豆蛋白是优质的植物蛋白之一，其氨基酸组成与动物蛋白最为相似且来源广泛，成本较低，大豆蛋白中蛋氨酸是第一限制氨基酸，与小麦蛋白、大米蛋白等谷物蛋白复配为酶解底物，弥补单一植物蛋白氨基酸组成的缺陷，使酶解液中氨基酸组成与动物源性食品更加接近，制成的调味料类肉风味更显著。
41.步骤5)中，所述氨基酸为半胱氨酸，维生素为硫胺素，糖为木糖及葡萄糖(其中木糖20-30％，葡萄糖70-80％，它们的质量百分数之和为100％)，核苷酸为5
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鸟苷酸(gmp)及5
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肌苷酸(imp)，质量比为1:1。氨基酸与呈味核苷酸混合使用时，由于协同作用能够显著提高鲜味，而半胱氨酸和硫胺素均为挥发性风味物质重要前体物质，在后续美拉德反应中有助于生成更多类肉风味物质。
42.步骤5)中，加热反应温度为90-110℃，反应时间为4-7h。此条件下反应能够保证美拉德反应充分发生的同时，避免焦糖化产生苦味等不良风味。
43.本发明植物源肉味调味料制备流程图见图1。
44.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
45.本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100ml溶液中含有溶质的克数。
46.以下实施例中使用的木瓜蛋白酶购自沧州夏盛酶生物技术有限公司，酶活单位100 000u/g。
47.风味蛋白酶购自诺维信生物有限公司，酶活单位500lapu/g。
48.ph调节剂为抗坏血酸及碳酸氢钠水溶液。
49.酵母提取物购自安琪酵母股份有限公司。
50.实施例1基于生物酶解及美拉德反应的植物源肉味调味料的制备方法
51.本实施例提供一种基于生物酶解及美拉德反应的植物源肉味调味料及其制备方法，所述方法包括以下步骤：
52.1)取100份复合植物蛋白原料，加入1000份水，搅拌均匀；
53.2)将步骤1)所得悬浊液调节ph至7.5，加入1份木瓜蛋白酶及3份风味蛋白酶，55℃
下复合酶解4h；
54.3)将步骤2)所得酶解液沸水浴10min灭酶，再放入冰浴冷却降温；
55.4)将步骤3)所得酶解完成液8000rpm离心15min，过滤后保留上清液，用10kda柱子进行超滤；
56.5)取100份步骤4)所得超滤液，加入半胱氨酸1.5份，硫胺素1.5份，木糖1份，葡萄糖3份，5
’‑
鸟苷酸(gmp)1份，5
’‑
肌苷酸(imp)1份，酵母提取物1.5份，100℃加热反应5h，加热结束后立即冰浴冷却降温；
57.6)取步骤5)所得溶液100份，加入0.5份白砂糖，0.5份食盐，冷冻干燥后得到基于生物酶解及美拉德反应的植物源肉味调味料。
58.步骤1)中，所述复合植物蛋白原料包括大豆蛋白50％、小麦蛋白25％及大米蛋白25％。
59.实施例2基于生物酶解及美拉德反应的植物源肉味调味料的制备方法
60.本实施例提供一种基于生物酶解及美拉德反应的植物源肉味调味料及其制备方法，所述方法包括以下步骤：
61.1)取100份复合植物蛋白原料，加入1500份水，搅拌均匀；
62.2)将步骤1)所得悬浊液调节ph至7.5，加入1.5份木瓜蛋白酶及4份风味蛋白酶，55℃下复合酶解5h；
63.3)将步骤2)所得酶解液沸水浴15min灭酶，再放入冰浴冷却降温；
64.4)将步骤3)所得酶解完成液8000rpm离心15min，过滤后保留上清液，用10kda柱子进行超滤；
65.5)取100份步骤4)所得超滤液，加入半胱氨酸2份，硫胺素2份，木糖1份，葡萄糖4份，5
’‑
鸟苷酸(gmp)1份，5
’‑
肌苷酸(imp)1份，酵母提取物2份，110℃加热反应4h，加热结束后立即冰浴冷却降温；
66.6)取步骤5)所得溶液100份，加入0.75份白砂糖，0.75份食盐，冷冻干燥后得到基于生物酶解及美拉德反应的植物源肉味调味料。
67.步骤1)中，所述复合植物蛋白原料包括大豆蛋白55％、小麦蛋白25％及大米蛋白20％。
68.实施例3基于生物酶解及美拉德反应的植物源肉味调味料的制备方法
69.本实施例提供一种基于生物酶解及美拉德反应的植物源肉味调味料及其制备方法，所述方法包括以下步骤：
70.1)取100份复合植物蛋白原料，加入800份水，搅拌均匀；
71.2)将步骤1)所得悬浊液调节ph至7.5，加入1份木瓜蛋白酶及2份风味蛋白酶，55℃下复合酶解3h；
72.3)将步骤2)所得酶解液沸水浴10min灭酶，再放入冰浴冷却降温；
73.4)将步骤3)所得酶解完成液8000rpm离心10min，过滤后保留上清液，用10kda柱子进行超滤；
74.5)取100份步骤4)所得超滤液，加入半胱氨酸1份，硫胺素1份，木糖0.8份，葡萄糖2.5份，5
’‑
鸟苷酸(gmp)0.5份，5
’‑
肌苷酸(imp)0.5份，酵母提取物1份，90℃加热反应7h，加热结束后立即冰浴冷却降温；
75.6)取步骤5)所得溶液100份，加入0.5份白砂糖，0.5份食盐，冷冻干燥后得到基于生物酶解及美拉德反应的植物源肉味调味料。
76.步骤1)中，所述复合植物蛋白原料包括大豆蛋白55％、小麦蛋白20％及大米蛋白25％。
77.对比例1
78.与实施例1相比，区别在于酶解底物为单一植物蛋白，基于生物酶解及美拉德反应制备调味料，具体方法包括以下步骤：
79.1)取100份大豆蛋白，加入1000份水，搅拌均匀；
80.2)将步骤1)所得悬浊液调节ph至7.5，加入1份木瓜蛋白酶及3份风味蛋白酶，55℃下复合酶解4h；
81.3)将步骤2)所得酶解液沸水浴10min灭酶，再放入冰浴冷却降温；
82.4)将步骤3)所得酶解完成液8000rpm离心15min，过滤后保留上清液，用10kda柱子进行超滤；
83.5)取100份步骤4)所得超滤液，加入半胱氨酸1.5份，硫胺素1.5份，木糖1份，葡萄糖3份，5
’‑
鸟苷酸(gmp)1份，5
’‑
肌苷酸(imp)1份，酵母提取物1.5份，100℃加热反应5h，加热结束后立即冰浴冷却降温；
84.6)取步骤5)所得溶液100份，加入0.5份白砂糖，0.5份食盐，冷冻干燥后得对比例调味料1。
85.对比例2
86.与实施例1相比，区别在于美拉德反应温度高，时间较短，对比例调味料2的制备包括以下步骤：
87.1)取100份复合植物蛋白原料，加入1000份水，搅拌均匀；
88.2)将步骤1)所得悬浊液调节ph至7.5，加入1份木瓜蛋白酶及3份风味蛋白酶，55℃下复合酶解4h；
89.3)将步骤2)所得酶解液沸水浴10min灭酶，再放入冰浴冷却降温；
90.4)将步骤3)所得酶解完成液8000rpm离心15min，过滤后保留上清液，用10kda柱子进行超滤；
91.5)取100份步骤4)所得超滤液，加入半胱氨酸1.5份，硫胺素1.5份，木糖1份，葡萄糖3份，5
’‑
鸟苷酸(gmp)1份，5
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肌苷酸(imp)1份，酵母提取物1.5份，130℃加热反应1.5h，加热结束后立即冰浴冷却降温；
92.6)取步骤5)所得溶液100份，加入0.5份白砂糖，0.5份食盐，冷冻干燥后得对比例调味料1。
93.步骤1)中，所述复合植物蛋白原料包括大豆蛋白50％、小麦蛋白25％及大米蛋白25％。
94.对比例3
95.与实施例1相比，区别在于美拉德反应原料仅加入单糖，不额外添加复配的氨基酸、核苷酸、维生素、酵母提取物等配料，对比例调味料3的制备包括以下步骤：
96.1)取100份复合植物蛋白原料，加入1000份水，搅拌均匀；
97.2)将步骤1)所得悬浊液调节ph至7.5，加入1份木瓜蛋白酶及3份风味蛋白酶，55℃
下复合酶解4h；
98.3)将步骤2)所得酶解液沸水浴10min灭酶，再放入冰浴冷却降温；
99.4)将步骤3)所得酶解完成液8000rpm离心15min，过滤后保留上清液，用10kda柱子进行超滤；
100.5)取100份步骤4)所得超滤液，木糖1份，葡萄糖3份，100℃加热反应5h，加热结束后立即冰浴冷却降温；
101.6)3步骤5)所得溶液100份，加入0.5份白砂糖，0.5份食盐，冷冻干燥后得对比例调味料3。
102.步骤1)中，所述复合植物蛋白原料包括大豆蛋白50％、小麦蛋白25％及大米蛋白25％。
103.植物源肉味调味料感官评价及植物源肉味调味料中肉特征风味物质含量比较：
104.某种蛋白质中各种必需氨基酸的构成比例称为氨基酸模式，几种物质的氨基酸模式如表1所示，与人体及肉制品氨基酸模式相比，大豆蛋白中第一限制氨基酸为蛋氨酸，谷物蛋白中第一限制氨基酸为赖氨酸，第二限制氨基酸为苏氨酸，限制氨基酸的存在影响其营养价值。本发明中将大豆蛋白、小麦蛋白及大米蛋白进行复配，弥补了单一蛋白氨基酸组成的不足，时酶解液中氨基酸组成与肉制品更加接近，制成的调味料类肉风味更显著。
105.表1几种物质的氨基酸模式
106.氨基酸成人猪瘦肉牛肉大豆蛋白小麦蛋白大米蛋白异亮氨酸4.03.43.23.52.62.9亮氨酸7.06.35.65.34.45.0赖氨酸5.55.75.84.21.31.9蛋氨酸+半胱氨酸3.52.52.81.22.82.3苯丙氨酸+酪氨酸6.06.04.95.85.15.4苏氨酸4.03.53.02.81.61.9缬氨酸5.03.93.23.42.83.5氨酸1.01.01.01.01.01.0
107.注：表中数据是根据蛋白质中必需氨基酸含量，以含量最少的氨酸为1，计算出的其他氨基酸的相应比值。
108.对实施例1-3及对比例1-3共6款调味料进行感官评价，由10名食品专业技术人员，经过相关培训后对调味料进行感官评价，感官评价结果实行10分制原则，根据喜好程度采取分段式打分，评价人员对随机编号的6种调味料各自打分，互不打扰，具体评分标准如表2所示，感官评价结果取平均值，结果如图2所示。
109.表2植物源肉味调味料感官评价标准
110.[0111][0112]
根据感官评价测定结果，本发明提供的基于生物酶解及美拉德反应的植物源肉味调味料的制备方法，所制得的植物源肉味调味料(实施例1-3制备的植物源肉味调味料成品见图3)香气浓郁，具有肉香味，且滋味好，咸淡适中，鲜味浓郁，气味、滋味及整体风味得分都显著高于对比例。对比例1以单一大豆蛋白作为酶解底物，氨基酸组成存在缺陷，导致制成的调味料类肉风味与实施例相比显著不足，整体风味不佳；对比例2中美拉德反应温度高、时间短，导致美拉德反应未能完全反应，且高温使还原糖部分焦糖化，导致调味料略有苦味，但整体感官评价得分高于对比例1及对比例3；对比例3中，酶解后的超滤液中仅加入单糖，而实施例中优选复配配料，半胱氨酸及硫胺素在美拉德反应中生成呋喃、吡嗪、噻唑和含硫化合物等，是类肉风味的重要来源，而核苷酸及酵母提取物的加入为调味料提供更为浓郁的鲜味，使整体风味更佳。
[0113]
将所制得的调味料进行气相谱-质谱联用分析(gc-ms)，实施例1总离子流图如图4所示，实施例及对比例中肉主要特征风味物质含量如表3所示。
[0114]
表3植物源肉味调味料中肉特征风味物质含量对比(μg/kg)
[0115][0116]
样品中检出的挥发性风味物质包括酯类、醇类、醛酮类、酸类、杂环类等物质，其中酮类、吡嗪、呋喃、噻吩等化合物，是肉制品中的主要特征风味。如表3所示，3种实施例中均检出肉特征风味物质，且含量相差不大。对比例1使用单一蛋白做为底物，蛋氨酸的缺乏使二甲基二硫化合物、二甲基三硫、噻吩、吡嗪等含硫化合物含量有所降低，肉特征风味含量
相较实施例下降；对比例2反应温度高，时间短，生成的肉特征风味化合物种类与实施例相同，但含量略有减少，同时检测出苦味美拉德反应产物5-羟甲基糠醛；对比例3仅加入单糖，不额外添加复配的氨基酸、核苷酸、硫胺素、酵母提取物等配料，导致对比例3中检测出的肉特征风味物质种类和含量均最低。
[0117]
综上所述，本发明提供的基于生物酶解及美拉德反应的植物源肉味调味料及其制备方法，使用复合纯植物蛋白作为生物酶解底物，不添加任何动物源性成分，保证反应充分发生的同时避免不良风味的产生，同时优选多种配料进行复配，与酶解液进行美拉德反应，制作方法简单，条件易控制，原料成本低，所制得的植物源肉味调味料风味丰富、肉味浓郁，适用于添加到各种食品中使用。
[0118]
实施例4蛋白酶的优化
[0119]
可选择的蛋白酶包括：木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶。
[0120]
木瓜蛋白酶购于沧州夏盛酶生物技术有限公司，酶活为100000u/g。
[0121]
alcalase碱性蛋白酶购于诺维信生物科技有限公司，酶活为2.4au/g。
[0122]
胰蛋白酶购于沧州夏盛酶生物技术有限公司，酶活40000u/g。
[0123]
胃蛋白酶购于沧州夏盛酶生物技术有限公司，酶活12000u/g。
[0124]
在四种蛋白酶的适宜温度及适宜ph条件下，对底物(即复合植物蛋白原料，包括大豆蛋白50％、小麦蛋白25％及大米蛋白25％)进行酶解(具体方法同实施例1)，以蛋白水解度(dh)为指标，水解度随时间的变化如图5所示。
[0125]
根据实验结果，底物水解度随着酶解时间的增加而增加，其中木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶水解效果优于其他两种蛋白酶，且随着酶解时间的推移，水解度逐渐趋于稳定，考虑到成本控制等问题，优选木瓜蛋白酶对底物进行酶解，时间为3-5h。
[0126]
木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶均为内切肽酶，风味蛋白酶为内切和外切蛋白酶，两者复合使用，提升底物酶解效率，为后续美拉德反应提供更多反应物。
[0127]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：

1.一种基于酶解及美拉德反应的植物源肉味调味料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取100份复合植物蛋白原料，加入500-1500份水，搅拌均匀；2)将步骤1)所得悬浊液调节ph至7.0-8.5，加入1-2份木瓜蛋白酶及2-4份风味蛋白酶，50-60℃下酶解3-5h；3)将步骤2)所得酶解液沸水浴10-15min灭酶，再放入冰浴冷却降温；4)将步骤3)所得酶解完成液8000rpm离心10-15min，过滤后保留上清液，用10-12kda柱子进行超滤；5)取100份步骤4)所得超滤液，加入氨基酸1-2份、维生素1-2份、糖3-5份、核苷酸1-2份和酵母提取物1-2份，加热发生美拉德反应，反应结束后立即冰浴冷却降温；6)取步骤5)所得美拉德反应产物100份，加入0.5-1.5份白砂糖和食盐的混合物，所述混合物中白砂糖和食盐按等质量比混合，冷冻干燥即得；所述份为重量份；所述复合植物蛋白原料包括大豆蛋白40-60％、小麦蛋白20-30％及大米蛋白20-30％，它们的质量百分数之和为100％；步骤5)中，所述氨基酸为半胱氨酸；所述维生素为硫胺素；所述糖由木糖和葡萄糖混合而成，其中木糖20-30％，葡萄糖70-80％，它们的质量百分数之和为100％；所述核苷酸由5
’‑
鸟苷酸和5
’‑
肌苷酸按等质量比混合而成；步骤5)中，加热温度为90-110℃，反应时间为4-7h。2.按照权利要求1所述方法制备的植物源肉味调味料。

技术总结

本发明公开了一种基于酶解及美拉德反应的植物源肉味调味料及其制备方法，先基于生物酶解技术酶解复合植物蛋白得到蛋白酶解液，经过灭酶及纯化处理后，按照比例加入氨基酸、维生素、单糖以及酵母提取物，再经过美拉德反应获得风味中间体，加入配料后经过冷冻干燥得到调味料。该调味料原料均为纯植物源，不含任何动物源性成分，但能提供类肉风味，香气浓郁自然，可在各类需要提升肉类风味的产品中广泛应用。用。