初级纤毛调控生物节律及其相关应用

1.本发明涉及生物技术领域，具体初级纤毛调控生物节律及其相关应用。

背景技术：

2.初级纤毛是一个存在于绝大多数哺乳动物细胞表面的不运动的微管状结构。这个类似天线的细胞器可以整合来自于外界的机械、物理、化学等刺激进而传递到细胞内部，在胚胎发育早期扮演着重要的角。
3.生物的睡眠/觉醒、进食等行为以及各种生理、生化、代谢过程遵循着大约24小时的节律性变化，俗称生物钟，生物钟与人体正常生理功能密切相关。研究表明，生物节律与个体睡眠、饮食、认知、情绪、行为、代谢等诸多生理指标密切相关，影响个体的核心体温、肌肉力量、柔韧性、细胞损伤和氧化应激水平、以及各种激素的分泌过程，关系到整个机体的协调有序发挥效能并与环境相适应，如果正常的生物节律被打乱，会导致机体心理和生理功能的异常，同时会引起机体各个组织器官的功能紊乱。对于人类而言，生物钟的改变会引发很多问题，如睡眠障碍、抑郁、代谢紊乱、衰老、血液疾病、糖尿病以及肥胖症等。昼夜节律系统在调节人体生理学方面起着至关重要的作用，最近的研究进一步揭示了昼夜节律的破坏与睡眠障碍、癌症、免疫能力下降、肥胖、阿尔茨海默病和衰老的关系。越来越多的研究证据显示，倒班工作者和夜间工作者患肿瘤、心血管疾病、代谢综合征的概率极大，目前还没有公认的方案。
4.目前，尚未有纤毛参与调控生物节律的相关报道。
5.fty720是近几年新开发的一种免疫抑制剂，该药选择性减少外周循环淋巴细胞数，显著延长实验动物移植器官的生存，同时并不损害对病毒的免疫应答及免疫记忆功能，毒副作用低，并且与csa、fk506、rad等临床一线免疫抑制药物显示出良好的协同作用，在肾移植病人的一期临床试用效果良好，临床应用前景广阔。

技术实现要素：

6.本发明首次揭示了丘脑区视交叉神经上核(scn)的初级纤毛具有显著的昼夜节律性变化；特异性敲除scn区域的纤毛直接导致小鼠节律异常，具体表现为小鼠行为学节律周期延长、倒时差适应能力增强；我们发现一种溶血磷脂s1p(1-磷酸鞘鞍醇)及其相关药物fty720能调控纤毛发生，并且验证该药物对脑组织节律的影响，实验结果发现：影响纤毛发生的药物fty720能够直接破坏脑组织的生物节律。
7.本发明所提供的纤毛发生调控剂为节律紊乱导致的特殊疾病提供了潜在的方案。
8.应用
9.一方面，本发明提供了纤毛发生调控剂在调节纤毛发生、调节生物节律、生物节律相关疾病中的应用；
10.更具体地，纤毛发生调控剂在制备调节纤毛发生、调节生物节律、生物节律相
关疾病的产品的应用。
11.优选地，所述调控剂包括抑制剂；所述调节包括促进纤毛发生或抑制纤毛发生。
12.本发明所述“生物节律相关疾病”包括睡眠障碍、时差调整、抑郁、代谢紊乱、衰老、血液疾病、糖尿病以及肥胖症等。
13.本发明所述“纤毛”在结构和功能上分为动纤毛和静纤毛；优选地，本发明所述调控纤毛发生针对的是静纤毛(在本发明中亦称为“初级纤毛”)。
14.优选地，所述调节生物节律具体表现包括使倒时差适应能力增强(提高对光周期改变的适应能力)；示例性的，所述倒时差适应能力强可以表现为在光照周期、光照强度、氧气浓度等环境因素变化的情况下，相对于对照可以在更少的时间内适应新的环境因素；所述更少的时间可以是对照时间的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、六分之一或更少的时间。
15.优选地，本发明具体实施例的光周期改变是提前/延后8小时。
16.优选地，术语“光周期”在本发明中亦称为“光照周期”，在标准光照周期下，24小时中光照12小时、黑暗12小时，例如：早7点开灯、晚7点关灯，光照强度50lux。
17.优选地，所述纤毛发生调控剂包括fty720、s1p、ki16425、lpa、ly294002、wortmannin、aktiiv、pia23、gsk690693、perifosine、pha-680632、tubacin等及其药学上可接受的盐、纤毛发生基因的调控剂。
18.本发明所述“fty720”即fingolimod，可翻译为芬戈莫德；fty720是近几年新开发的一种免疫抑制剂，它是由中药冬虫夏草提取物中具有免疫抑制作用的成分isp-i改造而成的具有；毒副作用小的优点。本发明提供了其在调节生物节律中的新应用。fty720的结构式如下：
[0019][0020]
本发明所述“药学上可接受盐”在被施用的量和浓度下是无毒的。在不阻止fty720发挥生理效应的情况下，通过改变fty720的物理特性，这样的盐的制备可以便于药理学应用。
[0021]
优选地，所述药学上可接受的盐可以是酸加成盐、碱加成盐。
[0022]
优选地，所述酸加成盐包括但不限于fty720的盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、磷酸盐、硫酸盐、硝酸盐、乙磺酸盐、甲苯磺酸盐、苯磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐和水杨酸盐、丙二酸盐、己二酸盐、己酸盐、精氨酸盐、富马酸盐、烟酸盐、邻苯二甲酸盐或草酸盐中的任意一种或至少两种的组合。
[0023]
优选地，所述碱加成盐包括但不限于fty720的赖氨酸或组胺酸组成的盐。
[0024]
优选地，所述纤毛发生基因包括ift88、ift20。
[0025]
优选地，所述抑制剂包括sirna干扰技术、crispr技术、talen技术、zfn技术、cre-loxp基因重组技术等基因编辑技术所使用的试剂。
[0026]
优选地，所述抑制剂是cre-loxp基因重组技术等基因编辑技术所使用的试剂。
[0027]
优选地，所述应用是在体外发生的；
[0028]
优选地，所述应用是非目的的。
[0029]
优选地，所述产品包括药物组合物。
[0030]
优选地，所述药物组合物可以通过任何给药方式而给与，例如：口服或肠胃外方式。
[0031]
优选地，所述肠胃外方式包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射或皮下注射。
[0032]
优选地，所述药物组合物可以是纤毛发生调控剂与药学上可接受的赋形剂按常规方法制成的丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、混悬剂、注射剂、微球或脂质体。
[0033]
方法
[0034]
另一方面，本发明提供了一种调控纤毛发生、调节生物节律的方法，所述方法包括施用纤毛发生调控剂。
[0035]
另一方面，本发明提供了一种调控纤毛发生、调节生物节律的组合物，所述组合物中含有纤毛发生调控剂。
[0036]
另一方面，本发明提供了一种生物节律相关疾病的方法，所述方法包括施用本发明所述纤毛发生调控剂。
[0037]
另一方面，本发明提供了一种生物节律相关疾病的药物组合物，所述组合物中含有纤毛发生调控剂。
[0038]
优选地，所述方法是在体外或体内发生的。
[0039]
更优选地，所述方法是在体外针对细胞进行的。
[0040]
优选地，所述方法还可以是在受试者体内进行的。
[0041]
本文中使用的术语“受试者”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿类动物等，其将成为本发明所述方法的特定接受者。
[0042]
优选地，所述啮齿类动物包括丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)动物。
[0043]
动物模型
[0044]
另一方面，本发明提供了一种生物节律异常的动物模型的构建方法，所述方法包括敲除ift88或ift20；
[0045]
更具体地，所述方法特异性敲除scn区的ift88或ift20；也就是，所述动物模型的scn区纤毛特异性缺失，而其他区域的纤毛正常。
[0046]
优选地，所述其他区域包括大脑海马区(海马区，可简称为hippo)、下丘脑室旁核(pvn)、小脑、及身体器官(例如肾、肺、肝脏等)。
[0047]
优选地，所述动物模型(或称为模型动物)包括所有动物；
[0048]
优选地，所述动物模型包括非人哺乳动物。
[0049]
优选地，所述非人哺乳动物包括猩猩、猴、马、牛、羊、猪、驴、骆驼、狗、兔、猫、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。
[0050]
优选地，所述动物模型是小鼠。
[0051]
优选地，所述敲除所使用的方法包括以下任意一种：sirna干扰技术、crispr技术、
talen技术、zfn技术、cre-loxp基因重组技术等；
[0052]
优选地，所述方法包括以下步骤：
[0053]
1)获得scn区特异表达cre的动物模型；
[0054]
2)获得ift88-loxp或ift20-loxp的动物模型；所述ift88-loxp即在ift88的编码基因或部分编码基因的两端各含有一个loxp序列；所述ift20-loxp即在ift20的编码基因或部分编码基因的两端各含有一个loxp序列；
[0055]
3)将1)和2)的动物模型进行交配。
[0056]
优选地，所述步骤3)所得到的动物模型还需要进行多代繁殖。
[0057]
优选地，术语“下丘脑视交叉上核”、“scn(suprachiasmatic nucleus)”“视交叉上核”“丘脑区视交叉上核”皆为相同含义，可互换使用。scn是哺乳动物昼夜节律调节系统的中枢结构，产生和调节睡眠—觉醒、激素、代谢和生殖等众多生物节律；一方面，scn具有自主性昼夜节律如电生理特性、糖的利用和蛋白质合成等；另一方面，scn接受整合外环境的光信息，使生物的内在节律与外环境同步。
[0058]
另一方面，本发明提供了上述生物节律异常的动物模型的构建方法所构建的动物模型及其应用。
[0059]
优选地，所述应用包括研究纤毛功能、纤毛对生物节律的调节机理中的应用。
[0060]
检测纤毛数量
[0061]
另一方面，本发明提供了检测纤毛数量的方法，所述方法包括检测纤毛发生基因的表达量。
[0062]
优选地，所述纤毛发生基因包括ift88、ift20。
[0063]
优选地，所述纤毛数量还可以以携带有纤毛的细胞的比例来体现。
[0064]
优选地，所述表达量是蛋白的表达量。
[0065]
更优选地，所述方法是检测scn区的纤毛发生基因的表达量。
[0066]
所述纤毛发生基因的表达量降低时、携带有纤毛的细胞比例降低。
附图说明
[0067]
图1是标准的光照周期下scn区纤毛的检测结果图；图1a是固定切片染代表性结果图，图1b是scn区纤毛数量及cry1表达量统计结果图，图1c为scn区纤毛长度统计结果图。
[0068]
图2是scn区纤毛缺陷的小鼠的蛋白表达量和纤毛检测结果图；图2a是western blot检测ift88的敲除效果，图2b是western blot检测ift20的敲除效果，图2c为scn区纤毛检测结果，图2d为其他区域纤毛检测结果。
[0069]
图3是scn区纤毛缺陷的小鼠的生物节律变化图；图3a为标准光照周期(ld)驯化两周后，置于持续黑暗环境(dd)的跑轮行为代表性结果；图3b为图3a在dd环境下运动周期的统计结果；图3c改变光照时间表时，小鼠的跑轮行为代表性结果；图3d是图3c的相位移动统计结果；图3e是图3c的相位移动50％时间统计结果图。图中小鼠跑轮行为用黑标记表示，白背景和灰背景分别代表光照与黑暗。
[0070]
图4是小鼠睡眠行为代表性结果图。图4a是改变光照周期时的小鼠睡眠行为结果图，图4b是实时荧光定量pcr显示睡眠相关基因变化结果。
[0071]
图5是施用fty720后纤毛和节律变化的检测结果图；图4a是纤毛发生代表图，图5b
为5a的统计结果，图5c为fty720调控纤毛发生统计结果，图5d是scn区节律基因震荡性变化；图5d为5c的统计结果。
具体实施方式
[0072]
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0073]
本发明所使用的材料和试剂
[0074]
1、per2::luc小鼠：为北京生命科学研究所张二荃老师赠送。即为记载于“ju et al.chemical perturbations reveal that ruvbl2 regulates the circadian phase in mammals.sci.transl.med.12,eaba0769(2020)”一文中，公众可从申请人处获得，尽可用于重复本发明实验使用，不得他用；ift88-loxp小鼠购自jackson lab，货号为022409；ift20-loxp小鼠购自jackson lab，货号为012565；nms-cre小鼠购自jackson lab，货号为027205。
[0075]
2、试剂
[0076]
表1、本发明所使用的试剂
[0077]
试剂厂商货号aciii抗体santa cruz公司sc-588ift88抗体proteintech公司3967-1-apift20抗体proteintech公司13615-1-apα-tubulin抗体mbl公司pm054goat anti-rabbit alexa fluor 488抗体thermo fisher scientific公司a11034luciferinpromega公司e1602dna染料hoechstinvitrogen公司h35704％多聚甲醛macgene公司p1110封片剂mounting medium中杉金桥公司zli-9556dmem培养基、hbss缓冲液gibco公司防脱玻片、组织包埋剂oct日本sakura公司 [0078]
通用实验方法
[0079]
1.western blot检测敲除效果
[0080]
收集纤毛缺陷小鼠的不同组织，研磨成单细胞并提取细胞全蛋白进行western blot实验以检测敲除效果。
[0081]
(1)sds-page胶配制：根据所要检测的蛋白质的分子量大小，配置相应浓度的胶；
[0082]
(2)上样：每孔上样30μg蛋白；
[0083]
(3)电泳：浓缩胶，恒压80v；分离胶，恒压120v。溴酚蓝前沿跑至胶边缘下胶；
[0084]
(4)转印：转印所需滤纸(每块胶4张)、纤维垫、硝酸纤维素膜、sds-page胶放入1
×
transfer buffer平衡10分钟。(pvdf，为疏水性膜，使用前需特殊处理：甲醇浸湿约10s)。将制备好的转印三明治放入转印电极盒(注意正负极)，加入转印缓冲液和冰盒开始转印。转印过程中整个转印槽置于冰浴中，400ma转印2小时；
[0085]
(5)封闭：转印结束后，将转印三明治取出，用镊子将转印好的硝酸纤维素膜放入
事先配制好的封闭液(5％脱脂牛奶)中，室温孵育封闭1小时；
[0086]
(6)一抗：分别用ift88、ift20、α-tubulin一抗进行孵育，4℃过夜，之后用tbst洗膜3次，每次5分钟；
[0087]
(7)二抗：用一抗对应的二抗进行孵育，室温孵育1小时，之后用tbst洗膜三次，每次5分钟；
[0088]
(8)显影：洗好的硝酸纤维素膜取出，尽量沥干膜上所带的tbst，正面朝上放于保鲜膜上，将事先分别取出的等量ecl试剂a、b液混匀，逐滴铺于膜上，进行显影；
[0089]
2.小鼠组织冰冻切片制作
[0090]
固定：将分离后组织置于4％多聚甲醛中，4℃过夜；
[0091]
洗涤：pbs洗涤2次；
[0092]
脱水：30％蔗糖(pbs配制)4℃过夜至组织沉入底部；
[0093]
包埋：选取合适组织大小的组织包埋盒，加入oct，缓慢倒入液氮，待其冷凝为固体状，置于-80℃冰箱保存；
[0094]
切片：按冰冻切片标准流程操作进行切片，厚度10μm，-80℃冰箱保存。
[0095]
3.冰冻切片的免疫荧光
[0096]
溶解oct：切片取出，迅速置于冰pbs中，室温放置10-15分钟；
[0097]
画圈：在切片上组织外围，用疏水笔画好疏水圈；
[0098]
封闭：3％bsa(0.1％pbst配制)室温1小时；
[0099]
一抗：弃封闭液，滴加一抗(ac3或arl13b)4℃过夜；
[0100]
洗涤：pbs洗三次，每次5分钟；
[0101]
二抗：滴加二抗(如alexa fluor 488)室温1小时，避光；
[0102]
洗涤：pbs洗三次，每次5分钟，避光；
[0103]
染核：hoechst配制浓度为1：1000，pbs配制，避光；
[0104]
洗涤：pbs洗三次，每次5分钟，避光；
[0105]
封片：滴取封片剂，将盖玻片盖于组织上，避光晾干，4℃留存；
[0106]
成像：待组织切片晾干后，用zeiss lsm 880显微镜拍摄图像。
[0107]
4.rnascope多通道荧光染
[0108]
烤片：在60℃干燥烤箱中烤片1小时。
[0109]
脱蜡：
[0110]
1.在通风橱内准备两个装有新鲜二甲苯的清洗剂皿和两个盛有100％乙醇的染缸；
[0111]
2.将载玻片放入载玻片架，并浸没在第一个盛有二甲苯的皿中，在二甲苯中室温孵育5分钟，不时地上下移动载玻片架；
[0112]
3.取出载玻片架，立即放入第二个盛有二甲苯的染缸中，室温孵育5分钟，不时地上下移动载玻片架；
[0113]
4.立即放入盛有100％乙醇的皿中，室温孵育2分钟，不时地上下移动载玻片架。
[0114]
5.然后立即放入第二个盛有100％乙醇的皿中，室温孵育2分钟，不时地上下移动载玻片架，在室温下风干载玻片至完全干燥。
[0115]
预处理：将已脱蜡的载玻片放置在hybez
tm
载玻片架上，滴加约5-8滴rnascope双氧
rnascope多通道荧光二代hrpc1，完全覆盖整张切片，将放有载玻片的载玻片架放入hybez
tm
杂交炉在40℃下孵育15分钟，用1x清洗缓冲液洗涤载玻片，在室温下洗涤2分钟，用新鲜1x清洗缓冲液重复此步骤；去除载玻片上多余的液体，滴加40μl稀释的plus fluorescein，置于40℃杂交炉孵育30分钟，用1x清洗缓冲液洗涤载玻片，在室温下洗涤2分钟，用新鲜1x清洗缓冲液重复此步骤；去除载玻片上多余的液体，滴加20μl rnascope多通道荧光二代hrp阻断剂，置于40℃杂交炉孵育15分钟，用1x清洗缓冲液洗涤载玻片，在室温下洗涤2分钟，用新鲜1x清洗缓冲液重复此步骤。
[0131]
抗体染：参照冰冻切片的免疫荧光部分。
[0132]
5.小鼠scn脑组织切片分离与培养
[0133]
1.小鼠scn脑组织切片分离
[0134]
a.对8-10周的小鼠进行麻醉，当小鼠失去知觉，但尚未停止了呼吸时，用剪刀迅速断头；
[0135]
b.用剪刀摘掉小鼠眼睛，以防止后续过程视神经激活，进一步破坏scn；
[0136]
c.用剪刀沿着两侧剪开小鼠颅骨，剔除所有的骨骼，直到嗅球中可以看出。避免挤压大脑，防止损害腹侧的scn；
[0137]
d.使用解剖剪刀剪掉嗅球和视神经连接处，确保视神经完全被切掉；
[0138]
e.倒扣头部，让完整的大脑掉到充满装有预冷hbss缓冲液(1
×
hbss，10mm hepes，4.5mm nahco3，1％penicillin-streptomycin)的10cm培养皿中，保持大脑在hbss 30-60秒，以确保冷却大脑；
[0139]
f.用勺子将大脑转移至一个新的培养皿中，用无菌手术刀片切掉小脑；
[0140]
g.在vibratome振动切片机的切割平台上涂上强力胶；
[0141]
h.用无菌滤纸小心擦掉大脑切口处多余的hbss；
[0142]
i.切口朝下，将脑组织固定在切割平台上，转移至切割台上，并倒入预冷的hbss缓冲液；
[0143]
j.为了快速达到scn区域，800μm厚度快速切割，在开始达到下丘脑时降低速度，在看到视交叉神经时降低至300μm厚度继续切割；
[0144]
k.当scn变得可视化之后，300μm切割该层，用软刷将脑切片转移至装有预冷hbss缓冲液的培养皿中，在显微镜下观察scn区；
[0145]
l.在体视显微镜下切割scn区，去掉视交叉神经(oc)，分离出1
×
1mm极小区域的scn脑片。
[0146]
2.scn脑组织切片体外培养
[0147]
a.将分离出的scn转移至millicell插入式细胞培养皿中培养；
[0148]
b.添加dmem培养基1.2ml(添加100μm luciferin，1％b27无血清添加剂，1％penicillin-streptomycin)，放入lymicycle仪中记录。
[0149]
6.纤毛缺陷小鼠倒时差实验
[0150]
a.将8周龄的雌性小鼠单独放于配有自主跑轮的笼子里，给予充足的食物以及饮用水；
[0151]
b.12小时光照：12小时黑暗(早07：00开灯，晚19：00关灯)的光照周期驯化小鼠14天，并且记录小鼠的运动情况；
[0152]
c.在第15天，提前开灯8小时，模拟倒时差条件(晚23：00开灯，早11：00关灯)，评价小鼠适应新光周期的时间长短；
[0153]
d.在新的光周期下记录14天之后，调整光周期至原来的时间(早07：00开灯，晚19：00关灯)，评价小鼠适应原来光周期的时间长短。
[0154]
实施例1、中枢scn区纤毛呈现明显节律性变化
[0155]
成年雌鼠(6-8周)在标准的光照周期下(早上7:00开灯，晚上19:00关灯，光照强度为50lux)培养两周后，每隔4h麻醉断头取小鼠脑组织样品，zt0为早上7:00，zt12为晚上19:00，每组3-4只小鼠。
[0156]
图1a为脑组织经固定切片染代表性结果，其中acⅲ是初级纤毛标志物，cry1为核心节律基因，作为对照；图1b为scn区纤毛数量及cry1表达量统计结果；图1c为scn区纤毛长度统计结果。以上石蜡切片荧光染结果显示，丘脑区视交叉神经上核scn区初级纤毛不管是数量还是长度，都呈现明显的节律性变化，具体变化为白天逐渐减少，晚上逐渐增多，该变化规律与节律基因cry1变化规律刚好相反。
[0157]
实施例2、构建丘脑区视交叉神经上核scn特异纤毛缺陷小鼠
[0158]
nms-cre为scn区特异表达cre工具鼠，ift88和ift20为参与纤毛发生的重要调控蛋白，通过将nms-cre小鼠分别与ift88-loxp、ift20-loxp小鼠交配，经过多代繁殖后得到nms-ift88
–
/
–
与nms-ift20
–
/
–
小鼠。
[0159]
图2a和2b为western blot检测ift88与ift20敲除效果；图2c为scn区纤毛检测结果；图2d为其他区域纤毛检测结果，其中scn代表视交叉神经上核，pvn代表下丘脑室旁核。以上结果说明成功构建了丘脑区视交叉神经上核scn特异纤毛缺陷的小鼠模型。
[0160]
实施例3、scn区纤毛缺陷小鼠生物节律紊乱
[0161]
8周龄成年雌鼠被单独置于装有跑轮笼的柜子中饲养，采用clocklab(actimetrics)实时记录并分析小鼠的跑轮行为。
[0162]
图3a为对照小鼠与scn区纤毛缺陷小鼠经标准光照周期(ld)驯化两周后，置于持续黑暗环境(dd)跑轮行为代表性结果；图3b为对照小鼠与scn区纤毛缺陷小鼠在持续黑暗环境中跑轮行为周期统计结果；以上结果证明，在光照周期异常(持续黑暗)的情况下，模型小鼠运动周期延长。
[0163]
图3c为小鼠经标准光照周期(早上7:00开灯，晚上19:00关灯)驯化两周后，将光照日程提前8h(晚上23:00开灯，上午11:00关灯)，观察15天后再将光照日程回复初始状态，对应小鼠跑轮行为代表性结果；图3d和3e为对照小鼠与scn区纤毛缺陷小鼠倒时差实验中相位移动统计结果。以上结果证明，在光照周期异常(光照日程提前8h)的情况下，模型小鼠可以在短时间(1-2天)内迅速适应改变后的光照周期。
[0164]
实施例4、scn区纤毛缺陷小鼠在光照周期改变中的睡眠监测
[0165]
与上述一致，采用clocklab实时记录小鼠在光照周期改变中的跑轮行为，使用clocklab analysis软件分析小鼠睡眠行为(根据小鼠运动行为的强弱判断小鼠是否处于睡眠状态)，图中小鼠睡眠行为用黑标记表示，白背景和灰背景分别代表光照与黑暗；图4b为实时荧光定量pcr显示对应小鼠睡眠相关基因变化结果。
[0166]
以上结果显示，在光照周期改变后，scn区纤毛缺陷小鼠睡眠行为得到改善，可以更快的适应新的光照周期。
[0167]
实施例5、纤毛调控药物fty720影响节律基因震荡性变化过程
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图5a左为s1p(1-磷酸鞘鞍醇)抑制饥饿环境诱导htert-rpe1细胞(人视网膜素上皮细胞)纤毛发生代表图；图5a右为5a左统计结果；图5b为s1p拮抗剂fty720诱导正常培养环境rpe1细胞纤毛发生统计结果；图5c为fty720在组织水平影响scn区节律基因震荡性变化结果，箭头代表换液加药时间，per2::luc小鼠是用于观察核心节律基因per2表达量震荡性变化工具鼠；图5d为图5c中对节律基因per2震荡性变化周期统计结果。以上结果表明，纤毛发生调控药物有可能应用于调节机体生物节律、生物节律相关疾病。

技术特征：

1.纤毛发生调控剂以下任意一种的应用：1)调控纤毛发生；2)制备调节生物节律的产品；3)制备生物节律相关疾病的产品；优选地，所述生物节律相关疾病包括睡眠障碍、时差调整、抑郁、代谢紊乱、衰老、血液疾病、糖尿病以及肥胖症。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纤毛发生调控剂包括fty720、s1p、ki16425、lpa、ly294002、wortmannin、aktiiv、pia23、gsk690693、perifosine、pha-680632、tubacin及其药学上可接受的盐、纤毛发生基因的调控剂；优选地，所诉纤毛调控剂为fty720；优选地，所述纤毛发生基因包括ift88、ift20。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的盐包括酸加成盐、碱加成盐；优选地，所述酸加成盐包括但不限于fty720的盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、磷酸盐、硫酸盐、硝酸盐、乙磺酸盐、甲苯磺酸盐、苯磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐和水杨酸盐、丙二酸盐、己二酸盐、己酸盐、精氨酸盐、富马酸盐、烟酸盐、邻苯二甲酸盐或草酸盐；优选地，所述碱加成盐包括但不限于fty720的锂盐、钠盐、钾盐、钡盐、钙盐、镁盐、铝盐、铁盐、亚铁盐、铜盐、锌盐，或fty720与吗啉、二乙胺、三乙胺、异丙胺、三甲胺、赖氨酸或组胺酸组成的盐。4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述调控剂包括sirna干扰技术、crispr技术、talen技术、zfn技术、cre-loxp基因重组技术中任意一种所使用的试剂；优选地，所述调控剂是cre-loxp基因重组技术所使用的试剂。5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括药物组合物；优选地，所述药物组合物的给药方式包括口服或肠胃外方式；优选地，所述肠胃外方式包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射或皮下注射。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物组合物是纤毛发生调控剂与药学上可接受的赋形剂按常规方法制成的丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、混悬剂、注射剂、微球或脂质体。7.一种在体外调控纤毛发生的方法，所述方法包括施用纤毛发生调控剂；优选地，所述纤毛发生调控剂包括fty720及其药学上可接受的盐、纤毛发生基因的调控剂；优选地，所述纤毛发生基因包括ift88、ift20。8.一种生物节律异常的动物模型的构建方法，所述方法包括特异性敲除模型动物scn区的ift88或ift20；优选地，所述模型动物包括非人哺乳动物；优选地，所述非人哺乳动物包括猩猩、猴、马、牛、羊、猪、驴、骆驼、狗、兔、猫、大鼠、小鼠、鱼、鸟等；优选地，所述动物模型是小鼠；
优选地，所述方法包括以下步骤：1)获得scn区特异表达cre的动物模型；2)获得ift88-loxp或ift20-loxp的动物模型；3)将1)和2)的动物模型进行交配。9.权利要求8所述的方法所构建的动物模型，或其在研究纤毛功能、纤毛对生物节律的调节机理中的应用。10.检测纤毛数量的方法，所述方法包括检测纤毛发生基因的表达量，所述纤毛发生基因包括ift88、ift20。

技术总结

本发明涉及生物技术领域，具体初级纤毛调控生物节律及其相关应用。具体地，本发明提供了纤毛发生调控剂在调节纤毛发生、制备调节生物节律的产品、制备生物节律相关疾病的产品中的应用；优选地，所述纤毛发生调控剂包括FTY720、S1P、Ki16425、LPA、LY294002、Wortmannin、AKTiIV、PIA23、GSK690693、Perifosine、PHA-680632、Tubacin及其药学上可接受的盐、纤毛发生基因的调控剂。纤毛发生基因的调控剂。纤毛发生基因的调控剂。