(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201580039261.7
(22)申请日 2015.06.01
(30)优先权数据
2014902155 2014.06.05 AU
(85)PCT国际申请进入国家阶段日
2017.01.18
(86)PCT国际申请的申请数据
PCT/AU2015/050297 2015.06.01
(87)PCT国际申请的公布数据
WO2015/184498 EN 2015.12.10
地址 澳大利亚新南威尔士
(72)发明人 苏珊·彼得森 罗恩·贝克
(74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限公司 11227代理人 郑斌 彭鲲鹏(51)Int.Cl.C12Q 1/68(2006.01)G01N 33/48(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明一般地涉及用于评估核酸甲基化(特
别是DNA和RNA甲基化)的方法。
更具体地，本发明涉及以改善的灵敏度定性或定量评估部分甲基 方法可用于一系列应用，所述应用包括但不限于
病症的诊断或以DNA或RNA甲基化变化为特征的
发育表型的监测。
权利要求书3页 说明书32页序列表21页 附图3页CN 106687600 A 2017.05.17
C N 106687600
A
1.用于检测目的核酸靶标的胞嘧啶甲基化的方法，其中所述核酸靶标的特征可在于部分胞嘧啶甲基化的区域，所述方法包括：
(i)使核酸样品与修饰未甲基化胞嘧啶残基的试剂接触；
(ii)使步骤(i)所述核酸样品的DNA形式与以下接触：
(a)设计成扩增经修饰的部分胞嘧啶甲基化区域的一种或更多种完全或部分甲基化形式的正向和反向引物；和
(b)导向所述部分胞嘧啶甲基化区域的一种或更多种探针，其中所述一种或更多种探针能够作为整体与所述区域处的至少两种不同的甲基化模式杂交，并且其中所述探针并入有检测手段； (iii)扩增步骤(ii)所述的DNA样品，其中所述引物沿着所述目的靶标的延伸实现了所述经杂交探针的检测；和
(iv)定性或定量地分析步骤(iii)的检测输出。
2.用于在患者中诊断或监测病症的方法，所述病症的特征在于调节目的核酸靶标的胞嘧啶甲基化，并且所述靶标的特征在于部分甲基化的区域，所述方法包括：
(i)使来自所述患者的核酸样品与修饰未甲基化胞嘧啶残基的试剂接触；
(ii)使步骤(i)所述核酸样品的DNA形式与以下接触：
(a)设计成扩增经修饰基因的一种或更多种完全或部分甲基化形式的正向和反向引物；和
(b)导向所述部分胞嘧啶甲基化区域的一种或更多种探针，其中所述一种或更多种探针作为整体与所述区域处的至少两种不同的甲基化模式杂交，并且其中所述探针并入有检测手段；
(iii)扩增步骤(ii)所述的DNA样品，其中所述引物沿着所述目的靶标的延伸实现了所述经杂交探针的检测；和
(iv)定性或定量分析步骤(iii)的检测输出。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述病症是肿瘤病症。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述目的核酸靶标是DNA基因或RNA基因或基因区域。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述DNA是基因组DNA。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的方法，其中所述基因区域是启动子区。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中所述基因是哺乳动物基因。
8.根据权利要求4至7中任一项所述的方法，其中所述基因是大肠肿瘤标志物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述大肠肿瘤标志物是基因BCAT1、IKZF1、IRF4、GRASP、CAHM、SOX21、SLC6A15、NPY、ST8SIA1、ZSCAN18、COL4A2、DLX5、FGF5、FOXF1、FOXI2或SDC2；其中所述基因包含转录起始位点上游5kb。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述基因是IKZF1。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述方法包括在IKZF1基因的Chr7：50304323-50304349、Chr7：50303300-50304923或Chr7：50399869-50400702区域中的一个或更多个处检测甲基化。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述试剂将未甲基化胞嘧啶残基修
饰为尿嘧啶。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述试剂是亚硫酸氢盐。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述亚硫酸氢盐是亚硫酸氢钠或亚硫酸氢铵。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述引物是甲基化特异性引物。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述探针是水解探针。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述探针作为整体与所述区域处的所有完全和部分甲基化模式杂交。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述基因是IKZF1，并且所述引物组包括包含以下一种或更多种的引物：
(i)SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4序列或实质相似的序列；
(ii)SEQ ID NO：49-62和SEQ ID NO：63-76序列或实质相似的序列；或者
(iii)SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：78序列或实质相似的序列。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述基因是IKZF1，并且所述探针组包括包含以下一
种或更多种的探针：
(i)SEQ ID NO：5-12序列或实质相似的序列；
(ii)SEQ ID NO：19序列或实质相似的序列；
(iii)SEQ ID NO：20序列或实质相似的序列；或者
(iv)SEQ ID NO：23-30序列或实质相似的序列。
20.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述基因是IKZF1，所述方法涉及扩增经亚硫酸氢盐转变的作为SEQ ID NO：1区域之互补物的DNA链，并且所述引物组包括包含SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48序列之一或两者或实质相似序列的引物。
21.根据权利要求1至17或20中任一项所述的方法，其中所述基因是IKZF1，所述方法涉及扩增经亚硫酸氢盐转变的作为SEQ ID NO：1区域之互补物的DNA链，并且所述探针组包括包含以下的一种或更多种的探针：
(i)SEQ ID NO：21序列或实质相似的序列；
(ii)SEQ ID NO：22序列或实质相似的序列；
(iii)SEQ ID NO：31-38序列或实质相似的序列；和/或SEQ ID NO：39-46序列或实质相似的序列。
22.用于检测目的核酸靶标区域的胞嘧啶甲基化的诊断试剂盒，所述试剂盒包含：
(i)设计成扩增DNA形式的所述部分胞嘧啶甲基化的核酸区域的一种或更多种完全或部分甲基化形式的正向和反向引物，其中未甲基化胞嘧啶残基已经被扩增；和(ii)导向所述部分胞嘧啶甲基化区域的一种或更多种探针，所述探针能够作为整体与至少两种不同的甲基化模式杂交。
23.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述引物是甲基化特异性引物。
24.根据权利要求22或23中任一项所述的试剂盒，其中所述探针是水解探针。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的试剂盒，其中所述探针作为整体与所述区域的所有完全和部分甲基化模式杂交。
26.根据权利要求22至25中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒另外包含修饰未甲基化胞嘧啶残基的试剂。
27.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述试剂是亚硫酸氢盐。
28.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述亚硫酸氢盐是亚硫酸氢钠或亚硫酸氢铵。
29.根据权利要求22至28中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒另外包含实现DNA扩增和/或检测的试剂。
30.根据权利要求22至29中任一项所述的试剂盒，其中所述目的核酸靶标是BCAT1、IKZF1、IRF4、GRASP、CAHM、SOX21、SLC6A15、NPY、ST8SIA1、ZSCAN18、COL4A2、DLX5、FGF5、FOXF1、FOXI2或SDC2。
31.根据权利要求22至30中任一项所述的试剂盒，其中所述目的核酸靶标是IKZF1。
32.根据权利要求31所述的试剂盒，其中所述引物和探针导向在IKZF1基因的Chr7：50304323-50304349、Chr7∶50303300-50304923或Chr7：50399869-50400702区域的一个或更多个处检测甲基化。
33.根据权利要求31或32中任一项所述的试剂盒，其中所述引物组包括包含以下一种或更多种的引物：
(i)SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4序列或实质相似的序列；
(ii)SEQ ID NO：49-62和SEQ ID NO：63-76序列或实质相似的序列；或者
(iii)SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：78序列或实质相似的序列。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的试剂盒，其中所述探针组包括包含以下一种或更多种的探针：
(i)SEQ ID NO：5-12序列或实质相似的序列；
(ii)SEQ ID NO：19序列或实质相似的序列；
(iii)SEQ ID NO：20序列或实质相似的序列；或者
(iv)SEQ ID NO：23-30序列或实质相似的序列。
35.根据权利要求31至32中任一项所述的试剂盒，其中所述基因是IKZF1，所述方法涉及扩增经亚硫酸氢盐转变的作为SEQ ID NO：1区域之互补物的DNA链，并且所述引物组包括包含SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48序列之一或两者或实质相似序列的引物。
36.根据权利要求31至32或35中任一项所述的试剂盒，其中所述基因是IKZF1，所述方法涉及扩增经亚硫酸氢盐转变的作为SEQ ID NO：1区域之互补物的DNA链，并且所述探针组包括包含以下的一种或更多种的探针：
(i)SEQ ID NO：21序列或实质相似的序列；
(ii)SEQ ID NO：22序列或实质相似的序列；
(iii)SEQ ID NO：31-38序列或实质相似的序列；和/或SEQ ID NO：39-46序列或实质相似的序列。
用于甲基化分析的方法技术领域
[0001]本发明一般地涉及用于评估核酸甲基化(特别是DNA和RNA甲基化)的方法。更具体地，本发明涉及以改善的灵敏度定性或定量评估部分甲基化的DNA或RNA的胞嘧啶甲基化的方法。本发明的方法可用于一系列应用，所述应用包括但不限于病症的诊断或以DNA或RNA 甲基化变化为特征的发育表型的监测。
背景技术
[0002]在本说明书中对任何现有出版物(或从其得到的信息)或任何已知的事物的引用不是并且不应被视为认可或承认或任何形式的暗示：该先前出版物(或从其获得的信息)或已知事物形成本说明书涉及的领域中的公知常识的一部分。
[0003]本说明书中作者提及的出版物的书目细节在说明书结尾以字母顺序汇总。
[0004]DNA甲基化是哺乳动物中研究最密集的表观遗传修饰之一，其是指在胞嘧啶(C)或腺嘌呤核苷酸处添加甲基(CH 3)。甲基可以添加到胞嘧啶碱基的第五个碳原子或腺嘌呤碱基的第六个氮原子处。
[0005]DNA甲基化在动物细胞中的基因调节中起作用。不仅活性基因转录和低甲基化(hypo-methylation)之间有相关性，而且转染实验显示甲基部分的存在抑制体内基因表达。此外，可以通过用5-氮杂胞苷(一种有效的去甲基化试剂)处理细胞诱导基因活化。甲基化似乎通过影响DNA与染质蛋白和特异性转录因子的相互作用来影响基因表达。尽管甲基化模式在体细胞中非常稳定，但早期胚胎的特征在于DNA甲基化的大的改变。
[0006]因此DNA甲基化对健康生长和发育至关重要，并且与多种过程如基因组印记、致癌作用和重复元件的抑制相关。它还能够抑制逆转录病毒基因以及已经进入并可能损害宿主的其他潜在危险的DNA序列的表达。此外，DNA甲基化在癌症的发展中起重要作用，并且是基因转录的关键调节子。研究表明，具有含有高浓度5-甲基胞嘧啶之启动子区的基因是转录沉默的。
[0007]在哺乳动物中所有CpG中的60％至90％被甲基化。甲基化的胞嘧啶残基随时间自发地脱氨基以形成T残基；因此甲基化的CpG二核苷酸稳定地脱氨基成为TpG二核苷酸，这通过人类基因组中CpG二核苷酸的低存在(它们仅以预期频率的21％出现)来证明。CpG通常分组在称为CpG岛的簇中，其通常存在于许多基因的5’调节区域中。
[0008]随着监测DNA甲基化水平的诊断效用的证据越来越多，用于可靠和准确地评估DNA 甲基化的手段变得越来越重要。目前，甲基化特异性PCR 是用于检测经亚硫酸氢盐(bisulphite)转变的DNA中的甲基化
DNA的常用方法。在该方法中，PCR寡核苷酸引物探查胞嘧啶-磷酸二酯-鸟嘌呤[CpG]位点中的甲基化胞嘧啶残基。MethyLight PCR是实时PCR变体，其除了甲基化特异性引物之外，还使用5’-3’水解探针来探查甲基化的CpG位点，从而使得能够进行定量。
[0009]最近，RNA也显示含有甲基化的胞嘧啶残基以及甲基化的腺嘌呤残基(Liu和Jia，2014；J Genet Genomics.41(1)：21-33)。虽然甲基化胞嘧啶在RNA中的生物学作用尚不清
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