(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910664772.8
(22)申请日 2019.07.23
(71)申请人 江南大学
地址 214000 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大
道1800号
(72)发明人 康振 陈坚 堵国成 韦朝宝
王丽
(74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权
代理有限公司 23211
代理人 彭素琴
(51)Int.Cl.
C12N 1/21(2006.01)
C12N 15/75(2006.01)
C12P 13/04(2006.01)
C12R 1/125(2006.01)
C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称
建方法
(57)摘要
本发明公开了一种发酵合成麦角硫因的工
程菌株及其构建方法，属于生物工程技术领域。
本发明以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为宿主，以枯
草芽孢杆菌、大肠杆菌与酿酒酵母的三穿梭质粒
在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌引入不同来源egtABCDE基因簇进行异源表达。实现
生物合成麦角硫因。然后对egtABCDE基因簇进行
优化表达，包括密码子优化、启动子优化和不同
组合表达，同时优化培养基及添加的甲硫氨酸、
组氨酸甜菜碱、组氨酸、半胱氨酸，经过优化表达
和优化培养条件，实现了高效生物合成麦角硫
因。本发明为微生物系统高效发酵制备麦角硫因
奠定了基础，
适合于工业化生产应用。权利要求书1页 说明书7页序列表11页 附图2页CN 110358719 A 2019.10.22
C N 110358719
A
1.一种发酵合成麦角硫因的工程菌株，其特征在于，以大肠杆菌或枯草芽孢杆菌为宿主，异源表达egtABCDE基因簇，或，表达氨基酸序列如k或l所示的蛋白质，所述egtABCDE基因簇的氨基酸序列如e、f、g、h、i或j任一所示。
2.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述大肠杆菌包括大肠杆菌MG1655，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌W3110或大肠杆菌BL21。
3.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌168、枯草芽孢杆菌W600或枯草芽孢杆菌W800。
4.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述egtABCDE基因簇核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、a、b、c或d任一所示。
5.根据权利要求1-4任一所述的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株的表达载体包括pEBS。
6.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，编码序列k的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
7.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，编码序列l的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
8.一种生产麦角硫因的方法，其特征在于，应用权利要求1-7任一所述的工程菌株进行发酵。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，将工程菌株接种至发酵培养基，在35-38℃发酵40-60h，在培养8-12h时添加甲硫氨酸、组氨酸甜菜碱、组氨酸、半胱氨酸，添加的甲硫氨酸终浓度2-8g/L，添加的组氨酸甜菜碱终浓度10-15g/L，添加的组氨酸终浓度15-20g/L，添加的半胱氨酸终浓度15-20g/L。
10.权利要求1-7任一所述的工程菌在制备麦角硫因或含麦角硫因的产品中的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 110358719 A
一种发酵合成麦角硫因的工程菌株及其构建方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种发酵合成麦角硫因的工程菌株及其构建方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
[0002]麦角硫因是一种稀有的天然手性组氨酸衍生类硫醇化合物，具有独特的生物学功能和药理活性。它不仅具很强的有抗氧化活性：可以清除经自由基、过氧亚硝基、次氯酸、鳌合二价金属离子、激活抗氧化物酶、抑制超氧化物歧化酶等，而且也具有抗炎作用和保护细胞作用，在医药、食品、保健品和化妆品及生物技术等领域具有广泛的应用前景和市场前景。
[0003]麦角硫因在1909年首次从麦角菌中分离得到，在放线菌、蓝细菌和裂殖酵母、部分蕈菌、链霉菌、分枝杆菌等微生物中也能合成，而其他细菌物种如：枯草芽抱杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌与链球菌等不能合成。麦角硫因也不能被动物和植物生物合成，但可被植物和动物吸收与积累，并广泛分布于哺乳动物的细胞和组织中。麦角硫因在人生理学中是至关重要的，人必须从膳食来源中获取，并在在特定组织和细胞诸如肝、肾、中枢神经系统和红细胞中积累。目前可通过化学合成法、提取法以及生物发酵合成法生产麦角硫因。化学方法合成左旋的麦角硫因十分困难，产品的安全性难以保证，合成原料昂贵，合成成本高，未达到预期的产量；提取法生产麦角硫因时也存在很多困难，如原料来源不足、原料中麦角硫因的含量仍然很低且提取成本高、有药物残留等，随着分子生物学及代谢工程等生物科学的快速发展，生物发酵合成法生产麦角硫因成为最具有潜力的生产方法。
[0004]然而，现有的报道中，通过构建基因工程菌生产麦角硫因的方法，其效果并不理想。如用来自耻垢分枝杆菌的egt基因在大肠杆菌中进行异源表达。将基因簇中的基因拆分连接到多个质粒中，再将质粒转化进大肠杆菌中，优化表达重组酶来提高麦角硫因产量，尽管如此，摇瓶产量仅有24mg/L(Osawa R,
Kamide T,Satoh Y,et al.Heterologous and High Production of Ergothioneine in Escherichia coli[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry,2017,66(5):1191-1196.)。
[0005]因此，提供一种能够实现高效生物合成麦角硫因的方法，对于工业生产麦角硫因具有重要的应用价值。
发明内容
[0006]本发明的第一个目的是提供一种发酵合成麦角硫因的工程菌株，是以大肠杆菌或枯草芽孢杆菌为宿主，异源表达egtABCDE基因簇，或，表达氨基酸序列如k或l所示的蛋白质，所述egtABCDE基因簇的氨基酸序列如e、f、g、h、i或j任一所示。
[0007]在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌包括大肠杆菌MG1655，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌W3110或大肠杆菌BL21。
[0008]在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌168，枯草芽孢
杆菌W600或枯草芽孢杆菌W800。
[0009]在本发明的一种实施方式中，所述egtABCDE基因簇来源为Mycobacterium avium subsp.paratub
erculosis str.k10，Mycolicibacter icosiumassiliensis strain 8WA6，Mycobacterium colombiense CECT 3035，Mycobacterium marinum E11，Mycobacterium sp.KMS或Mycobacteroides salmoniphilum。
[0010]在本发明的一种实施方式中，所述egtABCDE基因簇核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、a、b、c或d任一所示。编码序列k的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。编码序列l 的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0011]在本发明的一种实施方式中，所述工程菌株的表达载体为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌与酿酒酵母的三穿梭质粒p E B S(构建方法见Y a n g S,L i u Q,Z h a n g Y,e t al.Construction and Characterization of Broad-spectrum Promoters for Synthetic Biology.[J].Acs Synthetic Biology,2017,7(1):287-291.)。
[0012]本发明的第二个目的是提供一种生产麦角硫因的方法，应用了上述的工程菌株进行发酵。
[0013]在本发明的一种实施方式中，将工程菌株接种至发酵培养基，在35-38℃发酵40-60h，根据需要在培养8-12h时添加甲硫氨酸、组氨酸甜菜碱、组氨酸、半胱氨酸，添加的甲硫氨酸终浓度2-8g/L，添加的组氨酸甜菜碱终浓度10-15g/L，添加的组氨酸终浓度15-20g/L，添加的半胱氨酸终浓度15-20g/L。
[0014]所使用的发酵培养基组分为(g/L)：酵母粉2.5，蛋白胨5.0，Na2HPO4 6.78，KH2PO4 3.0，NaCl 0.5，NH4Cl 1.0，MgSO4·7H2O 0.5，CaCl2 0.015，葡萄糖40；FeCl2·6H2O 0.013.5；MnCl2·4H2O，0.001；ZnCl2，0.0017；CuCl2·2H2O，0.00043。
[0015]本发明的第三个目的是提供上述的工程菌在制备麦角硫因或含麦角硫因的产品中的应用。
[0016]本发明的有益效果：
[0017]本发明以大肠杆菌或枯草芽孢杆菌为宿主，以枯草芽孢杆菌、大肠杆菌与酿酒酵母的三穿梭质粒pEBS为表达载体，在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌引入不同来源egtABCDE基因簇进行异源表达。实现生物合成麦角硫因。然后对egtABCDE基因簇进行优化表达，包括密码子优化、启动子优化和不同组合表达，可分别获得一株产麦角硫因较佳的大肠杆菌与枯草芽孢杆菌重组菌，经过优化表达和优化培养条件，实现了高效生物合成麦角硫因。本发明能够使大肠杆菌重组菌在摇瓶上培养60h麦角硫因积累量高达437.6mg/L，枯草芽孢杆菌重组菌在摇瓶上培养60h麦角硫因积累量高达568.4mg/L，在工业上具有潜在而广泛的应用价值。
附图说明
[0018]图1：pEBS-egtABCDE及egtABCDE基因簇所含基因不同组合优化表达的构建示意图。
[0019]图2：异源表达不同来源egtABCDE基因簇的大肠杆菌重组菌在摇瓶上培养60h后麦角硫因积累量。
[0020]图3：异源表达不同来源egtABCDE基因簇的枯草芽孢杆菌重组菌在摇瓶上培养60h
后麦角硫因积累量。
[0021]图4：egtABCDE基因簇所含基因不同组合优化表达的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌重组菌在摇瓶上培养60h后麦角硫因积累量。
具体实施方式
[0022]一、实施例涉及的核苷酸序列信息
[0023](1)序列a信息为来源于Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis str.k10的egtABCDE基因簇核苷酸序列，NCBI编号：AE016958.1(322465to 327878)，序列(a)编码的氨基酸序列为序列e；
[0024](2)SEQ ID NO.1序列信息为来源于Mycolicibacter icosiumassiliensis strain 8WA6的egtABCDE基因簇核苷酸序列，SEQ ID NO.1编码的氨基酸序列为序列f；[0025](3)序列b信息为来源于Mycobacterium colombiense CECT 3035的egtABCDE基因簇核苷酸序列，NCBI编号：CP020821.1(3701114to 3706623)，序列b编码的氨基酸序列为序列g；
[0026](4)序列c信息为来源于Mycobacterium marinum E11的egtABCDE基因簇核苷酸序列，NCBI编号：HG917972.2(6005272to 6010682)，序列c编码的氨基酸序列为序列h；[0027](5)序列(d)信息为来源于Mycobacterium sp.KMS的egtABCDE基因簇核苷酸序列，NCBI编号：CP000518.1(5206948to 521
2322)，序列d编码的氨基酸序列为序列i；
[0028](6)SEQ ID NO.2序列信息为Mycobacteroides salmoniphilum strain D16Q15的egtABCDE基因簇核苷酸序列，SEQ ID NO.2编码的氨基酸序列为序列j；
[0029](7)SEQ ID NO.3序列信息为基因簇BACDE核苷酸序列，SEQ ID NO.3编码的氨基酸序列为序列k；
[0030](8)SEQ ID NO.4序列信息为基因簇BA-PBSX-CDE核苷酸序列，SEQ ID NO.4编码的氨基酸序列为序列l。
[0031]二、表达系统的构建
[0032]分别以Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis str.k10基因组、Mycolicibacter icosiumassiliensis strain 8WA6基因组、Mycobacterium colombiense CECT 3035基因组、Mycobacterium marinum E11基因组、Mycobacterium sp.KMS基因组和Mycobacteroides salmoniphilum基因组为模板，通过PCR扩增egtABCDE基因簇DNA片段，使用的引物分别是egtABCDE(mp)-F/egtABCDE(mp)-R、egtABCDE(mi)-F/egtABCDE(mi)-R、egtABCDE(mc)-F/egtABCDE(mc)-R、egtABCDE(mm)-F/egtABCDE(mm)-R、egtABCDE(mk)-F/ egtABCDE(mk)-R、e
gtABCDE(ms)-F/egtABCDE(ms)-R，将所得的PCR产物与pEBS(使用引物pEBS-F/pEBS-R扩增)骨架组装以产生pEBS-egtABCDE(mp)、pEBS-egtABCDE(mi)、pEBS-egtABCDE(mc)、pEBS-egtABCDE(mm)、pEBS-egtABCDE(mk)和pEBS-egtABCDE(ms)。以Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis str.k10基因组为模板，通过PCR扩增得到egtB(使用引物B(1)-F/B(1)-R扩增)、egtA(使用引物A(2)-F/A(2)-R扩增)、egtC(使用引物C(3)-F/C(3)-R扩增)、egtD(使用引物D(4)-F/D(4)-R扩增)、egtE(使用引物E(5)-F/E (5)-R扩增)基因的DNA片段，将所得的PCR产物与pEBS(使用引物pEBS-F/pEBS-R扩增)骨架组装以产生pEBS-BACDE。以pEBS-BACDE为模板，使用引物P BSX-F/P BSX-R通过PCR扩增启动子
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