(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710147775.5
(22)申请日 2017.03.14
(83)生物保藏信息
CGMCC NO.12899 2016.08.23
(71)申请人 中国疾病预防控制中心传染病预防
控制所
地址 102206 北京市昌平区昌百路155号
(72)发明人 孙丽娜 徐建国 李振军
(74)专利代理机构 北京市众天律师事务所
11478
代理人 李新军
(51)Int.Cl.
C12N 1/20(2006.01)
A23L 33/135(2016.01)
A61K 35/744(2015.01)
A61P 1/02(2006.01)C12R 1/46(2006.01) (54)发明名称
用
(57)摘要
株的保藏号为CGMCC NO.12899，保藏日期为2016
年8月23日，保藏分类命名为唾液链球菌
(Streptococcus Salivarius)，保藏单位为中国
微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地
址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学
院微生物研究所。所述菌株能够明显抑制口臭标
准菌株具核梭菌的挥发性硫化物的产生。本发明
还公开了上述菌株在制备去除口臭药物中的应
用，在去除口臭，构建有益的口腔微生态环境效
的微生态制剂制备上具有广泛的应用前景和价
值。权利要求书1页 说明书7页序列表1页 附图3页CN 107058175 A 2017.08.18
C N 107058175
A
1.一种口腔益生菌菌株，所述菌株的保藏号为CGMCC NO.12899，保藏日期为2016年8月23日，保藏分类命名为唾液链球菌，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.一种唾液链球菌，其特征在于，所述菌株的16S rRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求1或2所述的菌株在制备去除口臭药物中的应用。
4.根据权利要求1或2所述的菌株在制备食品和/或保健品中的应用。
5.一种含有权利要求1或2所述的菌株的组合物。
6.根据权利要求5所述的组合物，所述组合物被制备为漱口液制剂、雾化剂、胶囊或者含片。
权 利 要 求 书1/1页CN 107058175 A
唾液链球菌及在制备去除口臭药物中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种益生菌及其应用，属于微生物领域。
背景技术
[0002]口臭是指呼吸时出现臭味的一种症状，是一种常见疾病，中国人的患病率在22％到50％以上不等。口臭患者不敢与他人近距离交往，从而产生自卑心理，影响正常的人际、情感交流，令人十分苦恼。口臭主要由口腔内细菌，尤其是由聚集在舌后1/3的革兰阴性厌氧菌发酵产生的挥发性硫化物(Volatile Sulphur Compound，VSC)所引起。研究表明，VSC 主要由牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、中间普雷沃菌和具核梭杆菌等细菌产生。Kazor等运用P C R对健康者和口臭者口腔内细菌进行分析，发现口臭患者中具核梭杆菌(Fusobacterium periodonticum)等检出率较健康者高，说明这些细菌普遍存在于口臭患者口中；而唾液链球菌(Streptococcus salivarius，S.salivarius)、粘滑罗氏菌(Rothiamucilaginosa)和一种优杆菌在健康者口腔中检出率高，而在口臭者中检出率明显低于健康者。此结果提示，口臭与口腔菌生态失调有关，产臭菌在口腔中过度增殖，影响了口腔正常菌如唾液链球菌的生长。 [0003]已知口臭最基本的原理是减少产臭菌数量，降低VSC的浓度。目前方法主要有两种：1)机械方法，包括清洁舌体、牙周洁治、清洁牙间隙及必要的刷牙和漱口等；2)生物化学方法，主要是指使用各种抗菌剂来抑制产臭菌的增殖，包括使用氯己定、金属离子和西吡氯铵等。这些方法能短期改善
口臭，但长期疗效欠佳。而且使用生物化学方法因含有抗菌剂，长期使用还会导致口腔菌失调。口臭后，各种细菌重新在口腔内定植、生长、增殖，一旦产臭菌重新增殖为口腔中优势菌，口臭即可复发，故有效地恢复口腔内菌正常的生态平衡是口臭的关键。很多学者报道了口臭及VSCs水平可以通过刷牙、刷舌苔等而降低，但是这些方法持续时间短暂，停止使用后口臭会反弹。使用含有抗菌成分的漱口水在一段时间内可有效降低口臭程度，但长期使用会产生耐药性及口腔内菌失调，并且停药后口腔内的产臭菌将会重新聚集产生口臭。因此，近年来很多学者开始探索更有效地预防及口臭的方法，其中采用益生菌进行口臭的已逐渐成为研究的热点。[0004]1907年，乌克兰生物学家、诺贝尔奖获得者Elie Metchnikoff首次提出益生菌的概念。WHO对益生菌的定义是以适当剂量服用时，对宿主(人或动物)健康有益的活体微生物制剂。益生菌包括双歧杆菌族、乳酸杆菌族和链球菌族等。2001年，Henker等人首次报道了应用大肠杆菌(E.Coli，Nissle 1917)成功口臭的病例，此外食窦魏斯氏菌(Weissella Cibaria)，体外实验发现能有效地抑制具核梭杆菌的增值和抑制VSCs产量，并且对于牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体、洛氏普雷沃菌也有部分的抑制作用。唾液链球菌(Streptococcus salivarius，S.salivarius)是在健康人舌背细菌中数量最多的细菌，也是最早定植于口腔黏膜表面的细菌，S.salivarius K12是唾液链球菌的一个亚种，是Tagg等从健康儿童口腔中分离提取到的。近年国外将这种细菌作为益生菌直接用于口腔链球菌性咽峡炎及口臭，取得了较满意疗效。研究人员提出S.salivarius K12可以作为
口臭中一种有效的辅助手段，但是，需要长期阶段性地摄入含有S.salivarius K12的制剂才能起到抑制口腔产臭菌的作用。此外，唾液乳酸杆菌(Lactobacillus Salivarius，L.Salivarius)属是目前最为广泛使用的益生菌发酵菌种，有研究指出，口服含有L.Salivarius WB21益生菌的制剂，可以明显改善吸烟者的牙周健康状况，同时减少牙周病患者口腔内龈上菌斑中的牙周致病菌，如牙龈卟啉单胞菌，中间普氏菌等，对于牙周健康有一定的益处，其抑菌作用与L.Salivarius产生过氧化氢、乳酸等细菌素抑制致病菌之间相互作用有关。Meurman提出乳杆菌还能刺激免疫细胞分泌炎症和抗炎细胞因子，调节粘膜免疫，来抑制口臭。
[0005]对益生菌的应用开拓了口腔医学的一个新领域，但是益生菌在口腔疾病干预中的作用研究刚开始，我们需要更了解口腔细菌微生物的种类和分布特征。
发明内容
[0006]基于上述目的，本发明首先提供了一种口腔益生菌菌株，所述菌株的保藏号为CGMCC NO.12899，保藏日期为2016年8月23日，保藏分类命名为唾液链球菌(Streptococcus Salivarius)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，：100101。
[0007]其次，本发明还提供了一种唾液链球菌(Streptococcus Salivarius)，所述菌株的16S rRNA的序列
如SEQ ID NO：1所示。
[0008]再次，本发明提供了上述的菌株在制备去除口臭药物中的应用。
[0009]又次，本发明提供了上述的菌株在制备食品和/或保健品中的应用。
[0010]最后，本发明提供了一种含有上述菌株的组合物。
[0011]在一个优选的技术方案中，所述组合物被制备为漱口液制剂雾化剂、胶囊或者含片。
[0012]本发明通过选取250例无口臭的儿童，从唾液取样，进行菌的分离和鉴定以及分子遗传学分析。出无口臭的儿童的优势菌，分离国人口内能抑制口臭的天然存在的益生菌，体外验证其对口臭菌具有显著的抑制作用，能够弥补现有技术在口臭上的不足，从而更好地解决口臭患者的需求。这为将来研发针对我国口臭患者的有效微生态制剂，去除口臭，构建有益的口腔微生态环境，具有广泛的应用前景和价值。
附图说明
[0013]图1.优势菌的16s rDNA的PCR产物电泳图谱；
[0014]图2.具核梭菌和优势唾液链球菌的共聚作用观察图；
[0015]图3.优势唾液链球菌抑制硫化氢产生的结果观察图；
[0016]图4.具核梭菌单独培养液硫化氢和甲硫醇HPLC检测图；
[0017]图5.优势唾液链球菌和具核梭菌共聚后硫化氢和甲硫醇HPLC检测图
具体实施方式
[0018]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
[0019]实施例1菌株的筛选
[0020]实施目标：通过从250例无口臭儿童的唾液中分离口腔优势菌，进行分解含硫化合物的检测，寻可抑制口臭的天然细菌。
[0021]实施方案：
[0022](1)采样：4-7岁，无口臭，无口腔疾病的正常儿童250例，无家族遗传疾病，无全身系统疾病，无长期服药史。在唾液采集前，均向学校及家长讲明实验目的及过程，并获得同意。儿童在早餐后2h内不
能进食、喝饮料。用15ml无菌样品收集管，在不外界刺激唾液分泌的情况下，自然留取唾液约2ml，每个样品分三管，分别用于PCR鉴定，细菌培养及保存。[0023](2)分离培养：将所有样品进行分离培养，用PBS对样品稀释，均匀的涂布于脑心浸液BHI培养皿，置于37℃，5％CO2培养箱进行培养。
[0024](3)基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)鉴定：
[0025]样品处理方法：将基质溶于含有0.1％(V/V)甲酸和0.01mol L18-crown-6的1∶1∶1水、甲醇、乙腈溶液(基质溶剂)中，革兰氏阳性菌用CMBT基质，革兰氏阴性菌用CHCA基质。将基质溶液于混匀器上震荡混匀获得基质的饱和溶液。标准肽与CHCA饱和溶液等比例混合获得标准肽溶液。挑取细菌菌苔涂布于96孔样品板上，每一种细菌涂12孔，占样品板的一行。自然晾干1h后，用基质溶液覆盖菌苔，用标准肽溶液覆盖校准孔，每孔1μl。晾干5min后进样。
[0026](4)16s RNA鉴定
[0027]1)DNA提取
[0028]采用QIAamp DNA mini kit提取细菌DNA，步骤严格按照说明书操作。
[0029]2)PCR扩增
[0030]扩增反应体系：扩增体积(50μL)：Premix EX TaqTM25μL，模板DNA 10μL，引物各1μL，ddH20 13μL。扩增条件：94℃10min；(94℃30s，58℃30s，72℃1.5min)×30循环；72℃10min；4℃保存。
[0031]引物序列：
[0032]D88:GAGAGTTTGATYMTGGCTCAG
[0033]E94:GAAGGAGGTGWTCCARCCGCA；
[0034]3)纯化PCR产物
[0035]取5μL PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳(120V，30min)，凝胶成像仪判定结果。取40μL PCR产物用QIAquick PCR purification kit纯化PCR产物。
[0036]4)测序及其结果分析
[0037]测序采用ABI 3730DNA测序仪，测序试剂为Bigdye terminator V3.1(上海生物工程技术服务有限公司完成测序)。采用DNASTARLasergeneV7.1进行序列拼接，将低质量测序序列切除，然后将拼接好的序列直接在NCBI的BLAST进行序列比对分析，核苷酸序列大于99％的相似度，被视为特异的细菌种类。
[0038](5)具核梭菌培养
[0039]采用国际上通用的产生硫化氢复合物的口臭标准菌株F.nucleatum，购自美国菌种保藏中心(ATCC)，菌号ATCC 10953。具核梭菌采用BHI脑心浸液(Difco enriched with yeast extract 0.5％,haemin 5mg/mL,menadione 1mg/mL)，在厌氧培养箱(85％N2,10％
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