(19)中华人民共和国国家知识产权局
| (12)发明专利说明书 | |
| (10)申请公布号 CN 103088090 A (43)申请公布日 2013.05.08 |
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(21)申请号 CN201310065854.3
(22)申请日 2013.03.01
(71)申请人 南京工业大学
地址 210009 江苏省南京市新模范马路5号
(72)发明人 应汉杰 季雯燕 谢婧婧 孙梧进 陈勇 陈晓春 吴菁岚
(74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所(普通合伙)
代理人 肖明芳
(51)Int.CI
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的N-乙酰葡萄糖胺异构酶在催化合成N-乙酰甘露糖胺中的应用。即以氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的N-乙酰葡萄糖胺异构酶为催化剂，以N-乙酰葡萄糖胺为底物，制备N-乙酰甘露糖胺。本发明首次将氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的N-乙酰葡萄糖胺异构酶应用于N-乙酰甘露糖胺制备中，取得很好的效果。 | |
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法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1.一种氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的N-乙酰葡萄糖胺异构酶在催化N-乙酰 葡萄糖胺合成N-乙酰甘露糖胺中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以氨基酸序列如SEQ ID NO：2所 示的N-乙酰葡萄糖胺异构酶为催化剂，以N-乙酰葡萄糖胺为底物，不需要ATP作为辅 因子，制备N-乙酰甘露糖胺。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，表达基因序列如SEQ ID NO：1所 示的重组菌，经过破碎与镍柱纯化后，将纯酶与N-乙酰葡萄糖胺在缓冲液中反应得到 N-乙酰甘露糖胺。 4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，基因序列如SEQ ID NO：1所示的 重组菌的构建方法如下：以Prochlorococcus marinus str.MIT9215基因组为模板扩增出 N-乙酰葡萄糖胺异构酶的基因并连接到pET-28a载体上，再将重组质粒转化入E.coli Rosetta(DE3)中。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，重组菌的表达方法如下：培养重组 菌至OD<sub>600</sub>=0.8时添加0.5mM IPTG，在15℃、220rpm条件下诱导12h。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，镍柱纯化条件为：60mM咪唑溶液 洗脱杂蛋白，500mM咪唑溶液洗脱纯酶。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，纯酶与N-乙酰葡萄糖胺的反应比为 0.2-20U的纯酶与50-200mM N-乙酰葡萄糖胺反应。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的缓冲液为pH7～8.5的磷酸缓 冲液或pH7～8.5的Tris-HCl缓冲液。
9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，纯酶与N-乙酰葡萄糖胺在缓冲液中 反应
条件为：温度35～38℃，反应时间0.2～2h。
10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，纯酶与N-乙酰葡萄糖胺在缓冲液中 反应条件为：温度37℃，反应时间0.5h。
说 明 书
<p>技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种N-乙酰葡萄糖胺异构酶(N-acetylglucosamine 2-epimerase，AGE)的应用，尤其涉及一种来自海藻Prochlorococcus marinus str.MIT 9215中的N-乙酰葡萄糖胺异构酶（PmAGE）在以N-乙酰葡萄糖胺 （N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc）为底物生产N-乙酰甘露糖胺 （N-acetyl-D-mannosamine,ManNAc）中的应用。
背景技术
N-乙酰甘露糖胺（N-acetyl-D-mannosamine,ManNAc）是一种重要的中间体，可用 于
抗流感药物前体及婴幼儿奶粉添加剂N-乙酰神经氨酸（N-acetyl-D-neuraminic acid, Neu5Ac）的合成。
以N-乙酰葡萄糖胺（N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc）为底物用于合成ManNAc， 再以ManNAc和丙酮酸为底物经N-乙酰神经氨酸缩合酶（N-acetylneuraminic acid lyase, Nal）催化合成N-乙酰神经氨酸是目前最主要的合成Neu5Ac的途径。而把廉价的底物 GlcNAc经异构反应生成其昂贵的同分异构体ManNAc是两步反应中的关键步骤。
迄今为止关于催化GlcNAc合成ManNAc的反应已有许多报道。概括起来主要有化 学法和生物催化法。
化学催化法是在强碱性的条件下将GlcNAc异构成ManNAc，但是该方法对下游的 底物及酶具有强烈的降解作用，因而不适合大规模应用[1]。
生物催化法采用AGE在温和的条件下催化GlaNAc生成ManNAc，因而避免了化 学法中强碱对下游反应的抑制作用。但是AGE只存在在自然界极少的几个物种中。目 前报道的AGE主要集中在哺乳动物，如猪[2]、人[3]、老鼠[4]；以及淡水藻，如 Synechocystis sp.
PCC6803[5]和Anabaena sp.CH1[6]中；以及卵形拟杆菌Bacteroides ovatus ATCC8483[7]中。这些AGE的共同的特点是需要ATP作为激活剂。全细胞催化 法可以克服反应体系中添加ATP的需要[8]，但其缺陷是细胞膜降低了底物的传质造成 反应速率降低，而且全细胞催化剂无法长期稳定地重复利用。与此相反，通过酶的固定 化方式进行ManNAc生产可以克服底物的传质作用而且酶可以长期重复利用，但是却需 要添加高成本的ATP[9]。本专利中研究的AGE可以在不需要添加ATP的情况下表现出 很高的酶活，从而很好地解决了酶催化法合成ManNAc中的瓶颈。
本专利中涉及到的N-乙酰葡萄糖胺异构酶（PmAGE）是AGE的一种，其包含384 个氨基酸，其在Genbank中的收录号为YP_001484631.1， （bi.v/protein/YP_001484631.1），其氨基酸序列如SEQ ID NO： 2所示。编码该蛋白的基因含有1155bp碱基，其在Genbank中的收录号为NC_009840.1， (bi.v/nuccore/NC_009840.1?report=genbank&from=1224454&to=1 225608)，其基因序列如SEQ ID NO：1所示。至今未发现PmAGE用于ManNAc合成 的报道。
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