(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910494180.6
(22)申请日 2019.06.09
(71)申请人 福建医科大学
地址 350004 福建省福州市台江区交通路
88号
(72)发明人 陈伟 何少斌 胡爱玲 邓豪华
彭花萍
(74)专利代理机构 福州智理专利代理有限公司
35208
代理人 王义星
(51)Int.Cl.
G01N 21/31(2006.01)
G01N 21/64(2006.01)
C01G 3/02(2006.01)
B82Y 30/00(2011.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开一种纳米氧化铜的抗坏血酸氧
酸氧化生成脱氢抗坏血酸，在强酸、强碱或高温
下均能保持其抗坏血酸氧化模拟酶活性。利用紫
外分光光度法分别研究温度、pH及反应时间对纳
米氧化铜作为抗坏血酸氧化酶的影响。纳米氧化
铜作为抗坏血酸氧化酶的稳态动力学参数与天
然的抗坏血氧化酶相当，并且纳米氧化铜作为抗
坏血酸氧化酶的稳定性明显强于天然的抗坏血
氧化酶。利用除氧实验和荧光分析方法验证纳米
氧化铜作为抗坏血酸氧化酶催化抗坏血酸氧化
的机理。该材料的抗坏血酸氧化模拟酶的活性在
纳米酶、纳米技术和仿生技术领域显示出较为诱
人的应用前景。权利要求书2页 说明书6页 附图7页CN 110196234 A 2019.09.03
C N 110196234
A
1.一种纳米氧化铜具有抗坏血酸氧化模拟酶的活性，在有氧环境下能高效催化抗坏血酸氧化生成脱氢抗坏血酸，在强酸、强碱或高温下均能保持其抗坏血酸氧化模拟酶活性；其特征是在氧气的存在下，纳米氧化铜能催化抗坏血酸氧化生成脱氢抗坏血酸；在45℃条件水浴温度下，向3.45 mL pH 7.0，200 mM的磷酸盐缓冲液中加入50 µL浓度为40 mg/L的纳米氧化铜和0.5 mL浓度为1 mM的抗坏血酸，反应6分钟后，用紫外分光光度计测定紫外可见吸收光谱及波长265 nm的吸光度。
2.根据权利要求1所述的一种纳米氧化铜具有抗坏血酸氧化模拟酶的活性，其特征是在有氧环境下能高效催化抗坏血酸氧化生成脱氢抗坏血酸，此反应体系的反应温度为45℃，pH 值为7.0及反应时间为6分钟。
3.根据权利要求1所述的一种纳米氧化铜具有抗坏血酸氧化模拟酶的活性，其特征是在有氧环境下可高效催化抗坏血酸氧化生成脱氢抗坏血酸；在通氮气20分钟后，在45℃条件水浴温度下，向3.45 mL pH 7.0，
200 mM的磷酸盐缓冲液中加入50 µL的40 mg/L的纳米氧化铜和0.5 mL浓度为1 mM的抗坏血酸，反应6分钟后，用紫外分光光度计测定紫外可见吸收光谱及波长265 nm的吸光度发现并未发生明显下降，说明抗坏血酸在氮气或无氧的体系中无法被纳米氧化铜催化氧化；仅在氧气及纳米氧化铜同时存在下，波长265 nm的吸光度才会明显下降，说明纳米氧化铜催化抗坏血酸的氧化还原过程。
4.根据权利要求1所述的一种纳米氧化铜具有抗坏血酸氧化模拟酶的活性，其特征是在有氧环境下可高效催化抗坏血酸氧化生成脱氢抗坏血酸，抗坏血酸的消耗能用紫外分光光度计测定紫外可见吸收光谱及波长265 nm的吸光度。
5.根据权利要求1所述的一种纳米氧化铜具有抗坏血酸氧化模拟酶的活性，其特征是在有氧环境下可高效催化抗坏血酸氧化生成脱氢抗坏血酸；通过米氏方程拟合，能得出纳米氧化铜对抗坏血酸的米氏常数K m=0.1302 mM，最大反应速率v max=9.9×10-7 M/s。
6.根据权利要求1所述的一种纳米氧化铜具有抗坏血酸氧化模拟酶的活性，其特征是在有氧环境下可高效催化抗坏血酸氧化生成脱氢抗坏血酸，在强酸、强碱或高温下均能保持其抗坏血酸氧化模拟酶活性；通过改变外界的条件，将纳米氧化铜放置在不同温度或pH 一小时，比较其抗坏血酸氧化酶活性，发现纳米氧化铜非常稳定，耐高温，强酸强碱条件，而天然抗坏血酸氧化酶不能够耐高温，强酸强碱条件。
7.根据权利要求1所述的一种纳米氧化铜具有抗坏血酸氧化模拟酶的活性，其特征是在有氧环境下可高效
催化抗坏血酸氧化生成脱氢抗坏血酸；在EP管中分别加入50 µL浓度为40 mg/L的纳米氧化铜、0.45 mL pH 7.0，200 mM的磷酸盐缓冲液和0.5 mL的抗坏血酸；将混合液置于45 °C恒温反应6分钟后，向其中加入2.5 mL pH 5.0，200 mM的磷酸盐缓冲液、0.5 ml浓度为2 mM的邻苯二胺，30 °C温浴反应20分钟后测定其在425 nm处的激发波长为350 nm的荧光强度；纳米氧化铜作为抗坏血酸氧化酶催化抗坏血酸生成的产物能与邻苯二胺生成蓝荧光产物，证明纳米氧化铜作为抗坏血酸氧化模拟酶能催化抗坏血酸氧化生成脱氢抗坏血酸。
8.根据权利要求1-7任一所述的一种纳米氧化铜具有抗坏血酸氧化模拟酶的活性，其特征是纳米氧化铜由下述方法制备的：取醋酸铜溶液和冰醋酸加入到装有冷凝管的三颈瓶中，搅拌加热至沸腾，快速加入氢氧化钠溶液，加完后，继续搅拌后，得到黑氧化铜，将反应得到的黑氧化铜立即离心，用无水乙醇洗涤，减压干燥，即得纳米氧化铜粉体，将纳米
氧化铜粉体分散于二次蒸馏水中得到棕纳米氧化铜胶体溶液。
9.根据权利要求8所述的一种纳米氧化铜具有抗坏血酸氧化模拟酶的活性，其特征是纳米氧化铜具体由下述步骤制备的：（1）取0.02 mol/L的醋酸铜溶液150 ml和0.5 ml冰醋酸加入到装有冷凝管的三颈瓶中，搅拌加热至沸腾；（2）快速加入0.04 g/ml的氢氧化钠溶液10 ml，加完后继续搅拌5分钟，得到褐氧化铜沉淀；（3）将反应得到的黑氧化铜沉淀离心，用无水乙醇洗涤三次，减压干燥，即得直径为6 nm的纳米氧化铜粉体，将纳米氧化铜粉体分散于二次蒸馏水中得到棕纳米氧化铜胶体溶液。
纳米氧化铜的抗坏血酸氧化模拟酶活性
技术领域
[0001]本发明属于纳米技术和仿生技术领域，具体的说是一种纳米氧化铜具有抗坏血酸氧化模拟酶的活性，在有氧环境下可高效催化抗坏血酸氧化生成脱氢抗坏血酸，在强酸、强碱及高温下均能保持其抗坏血酸氧化模拟酶活性。
背景技术
[0002]天然酶具有高催化效率及底物专一性等特点，然而，由于天然酶的化学本质是蛋白质，在酸、碱、热等复杂的非生理环境中容易发生结构变化而失活。纳米酶是一类既有纳米材料的独特性能，又有催化功能的人工模拟酶。与天然酶相比，纳米酶的催化效率较高，同时还具备对酸、碱和热稳定，又有稳定、经济、可回收等优势特点，鉴于上述，纳米酶的应用研究也已经拓展到生物、农业、医学及环境治理等多个领域，逐渐形成纳米酶研究新领域。
[0003]抗坏血酸氧化酶是一种含铜的酶，在有氧环境下，能催化抗坏血酸氧化生成脱氢抗坏血酸，并且能够与其它氧化还原反应相偶联起到末端氧化酶的作用，具有抗衰老等作用，在植物体内的物质代谢中具有重要的作用。然而，与众多天然酶相似，抗坏血酸氧化酶容易受到多种因素的影响而失去活性，在实际应用中对其相关实验的操作条件较为苛刻，使其应用受到了极大的限制。
[0004]自从过氧化物纳米酶被报道以来，尽管越来越多的纳米酶被陆续发明及报道，但对于纳米材料的抗坏血酸氧化模拟酶活性仍有待研究和开发。基于上述纳米酶的优点，探究纳米材料的抗坏血酸氧化模拟酶活性具有重要的意义，且可用于构建不同的检测方法或应用于未来未知的领域。
[0005]本发明首次发现纳米氧化铜具有优秀的抗坏血酸氧化模拟酶活性，在有氧环境下，能够高效催化抗坏血酸氧化生成脱氢抗坏血酸。采用紫外分光光度法分别研究温度、pH 及反应时间对纳米氧化铜作为抗坏血酸氧化模拟酶的影响，利用除氧实验和氧化产物验证纳米氧化铜作为抗坏血酸氧化模拟酶催化抗坏血酸氧化的机理，分析纳米氧化铜作为抗坏血酸氧化模拟酶的稳态动力学参数，并测试纳米氧化铜作为抗坏血酸氧化模拟酶的稳定性。本发明公开了纳米氧化铜的抗坏血酸氧化模拟酶活性，在纳米酶、纳米技术和仿生技术领域显示出诱人的应用前景。
发明内容
[0006]本发明的目的是提供一种纳米氧化铜具有抗坏血酸氧化模拟酶的活性，在有氧环境下可高效催化抗坏血酸氧化生成脱氢抗坏血酸，在强酸、强碱及高温下均能保持其抗坏血酸氧化模拟酶活性。
[0007]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种纳米氧化铜具有抗坏血酸氧化模拟酶的活性，在有氧环境下能高效催化抗坏血酸氧化生成脱氢抗坏血酸，在强酸、强碱或高温下均能保持其抗坏血酸氧化模拟酶活性；其特
征是在氧气的存在下，纳米氧化铜能催化抗坏血酸氧化生成脱氢抗坏血酸；在45℃条件水浴温度下，向3.45 mL pH 7.0，200 mM的磷酸盐缓冲液中加入50 µL浓度为40 mg/L的纳米氧化铜和0.5 mL浓度为1 mM的抗坏血酸，反应6分钟后，用紫外分光光度计测定紫外可见吸收光谱及波长265 nm的吸光度。
[0008]所述的一种纳米氧化铜具有抗坏血酸氧化模拟酶的活性，其特征是在有氧环境下能高效催化抗坏血酸氧化生成脱氢抗坏血酸，此反应体系的反应温度为45℃，pH 值为7.0及反应时间为6分钟。
[0009]所述的一种纳米氧化铜具有抗坏血酸氧化模拟酶的活性，其特征是在有氧环境下可高效催化抗坏血酸氧化生成脱氢抗坏血酸；在通氮气20分钟后，在45℃条件水浴温度下，向3.45 mL pH 7.0，200 mM的磷酸盐缓冲液中加入50 µL的40 mg/L的纳米氧化铜和0.5 mL 浓度为1 mM的抗坏血酸，反应6分钟后，用紫外分光光度计测定紫外可见吸收光谱及波长265 nm的吸光度发现并未发生明显下降，说明抗坏血酸在氮气或无氧的体系中无法被纳米氧化铜催化氧化；仅在氧气及纳米氧化铜同时存在下，波长265 nm的吸光度才会明显下降，说明纳米氧化铜催化抗坏血酸的氧化还原过程。
[0010]所述的一种纳米氧化铜具有抗坏血酸氧化模拟酶的活性，其特征是在有氧环境下可高效催化抗坏血酸氧化生成脱氢抗坏血酸，抗坏血酸的消耗能用紫外分光光度计测定紫外可见吸收光谱及波长265 nm的吸光度。
[0011]所述的一种纳米氧化铜具有抗坏血酸氧化模拟酶的活性，其特征是在有氧环境下可高效催化抗坏
血酸氧化生成脱氢抗坏血酸；通过米氏方程拟合，能得出纳米氧化铜对抗坏血酸的米氏常数K m=0.1302 mM，最大反应速率v max=9.9×10-7 M/s。
[0012]所述的一种纳米氧化铜具有抗坏血酸氧化模拟酶的活性，其特征是在有氧环境下可高效催化抗坏血酸氧化生成脱氢抗坏血酸，在强酸、强碱或高温下均能保持其抗坏血酸氧化模拟酶活性；通过改变外界的条件，将纳米氧化铜放置在不同温度或pH一小时，比较其抗坏血酸氧化酶活性，发现纳米氧化铜非常稳定，耐高温，强酸强碱条件，而天然抗坏血酸氧化酶不能够耐高温，强酸强碱条件。
[0013]所述的一种纳米氧化铜具有抗坏血酸氧化模拟酶的活性，其特征是在有氧环境下可高效催化抗坏血酸氧化生成脱氢抗坏血酸；在EP管中分别加入50 µL浓度为40 mg/L的纳米氧化铜、0.45 mL pH 7.0，200 mM的磷酸盐缓冲液和0.5 mL的抗坏血酸；将混合液置于45 °C恒温反应6分钟后，向其中加入2.5 mL pH 5.0，200 mM的磷酸盐缓冲液、0.5 ml浓度为2 mM的邻苯二胺，30 °C温浴反应20分钟后测定其在425 nm处的激发波长为350 nm的荧光强度；纳米氧化铜作为抗坏血酸氧化酶催化抗坏血酸生成的产物能与邻苯二胺生成蓝荧光产物，证明纳米氧化铜作为抗坏血酸氧化模拟酶能催化抗坏血酸氧化生成脱氢抗坏血酸。[0014]所述的一种纳米氧化铜具有抗坏血酸氧化模拟酶的活性，其特征是纳米氧化铜由下述方法制备的：取醋酸铜溶液和冰醋酸加入到装有冷凝管的三颈瓶中，搅拌加热至沸腾，快速加入氢氧化钠溶液，加完后，继续搅拌后，得到黑氧化铜，将反应得到的黑氧化铜立即离心，用无水乙醇洗涤，减压干燥，即得纳米氧化铜粉体，将纳米氧化铜粉体分散于二次蒸馏水中得到棕纳米氧化铜胶
体溶液。
[0015]所述的一种纳米氧化铜具有抗坏血酸氧化模拟酶的活性，其特征是纳米氧化铜具体由下述步骤制备的：（1）取0.02 mol/L的醋酸铜溶液150 ml和0.5 ml冰醋酸加入到装有
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