(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010581182.1
(22)申请日 2020.06.23
(71)申请人 厦门大学
地址 361000 福建省厦门市思明南路422号
(72)发明人 袁吉锋 陈玉芬
(74)专利代理机构 厦门创象知识产权代理有限
公司 35232
代理人 王凤玲 尤怀成
(51)Int.Cl.
C12N 15/70(2006.01)
C12N 1/21(2006.01)
C12P 7/42(2006.01)
C12R 1/19(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及一种生产原儿茶酸的大肠杆菌
构建方法及应用，该方法包括：PCR扩增获取
PmLAAD、HmaS、HMO、BFD、HFD1、HpaBC、PobA七种基
因；构建质粒pET -PmLAAD -HmaS、质粒pCDF -HMO -
BFD、质粒pACYC -HpaBC和质粒pACYC -PobA和质粒
pRSF -HFD1；将上述部分质粒共同转入大肠杆菌
MG1655RARE感受态细胞中，分别得到第一重组大
肠杆菌工程菌和第二重组大肠杆菌工程菌。根据
本发明实施例，该方法获得的重组大肠杆菌可使
原儿茶酸达最大收率，具有广阔的工业化应用前
景。
权利要求书1页 说明书6页序列表4页 附图3页CN 111647616 A 2020.09.11
C N 111647616
A
1.一种生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
PCR扩增获取PmLAAD、HmaS、HMO、BFD、HFD1、HpaBC、PobA七种基因，将PmLAAD和HmaS基因双片段、HMO和BFD基因双片段用BsaI酶切，随后分别连接进入经BamHI和XhoI双酶切的表达载体pETDuet -1、pCDFDuet -1，得到质粒pET -PmLAAD -HmaS和质粒pCDF -HMO -BFD；将HFD1酶切后，连接进入表达载体pRSFDuet -1中得到质粒pRSF -HFD1；将HpaBC、PobA基因单片段酶切，分别连接经BamHI和XhoI双酶切的pACYCDuet -1载体，获得质粒pACYC -HpaBC和质粒pACYC -PobA；
将质粒pET -PmLAAD -HmaS、质粒pCDF -HMO -BFD、质粒pRSF -HFD1和质粒pACYC -HpaBC共同转入大肠杆菌MG1655 RARE感受态细胞中，得到第一重组大肠杆菌工程菌MG1655-PCA1；
将质粒pET -PmLAAD -HmaS、质粒pCDF -HMO -BFD、质粒pRSF -HFD1和质粒pACYC -PobA共同转入大肠杆菌MG1655 RARE感受态细胞中，得到第二重组大肠杆菌工程菌MG1655-PCA2。
2.权利要求1所述的方法构建的生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌。
3.权利要求2所述的生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌用于生产原儿茶酸的用途。
4.一种使用权利要求2所述的生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌生产原儿茶酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将第一重组大肠杆菌工程菌和第二重组大肠杆菌工程菌分别进行活化和扩大培养，先接种于LB培养基中，之后按1:100比例将过夜培养物转接入TB培养液中培养，然后加入诱导剂进行诱导培养，离心收集细胞；
采用10g/L新鲜细胞干重，5mM L -酪氨酸底物，20g/L葡萄糖，磷酸盐缓冲液反应体系，在30℃，250rpm下催化1～12h，每隔两小时液相谱检测原儿茶酸产量。
权 利 要 求 书1/1页CN 111647616 A
一种生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌构建方法及应用
技术领域
[0001]本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌构建方法及应用。
背景技术
[0002]原儿茶酸也称为3,4-二羟基苯甲酸，存在于木犀科植物紫丁香、蓼科植物头花蓼、冬青科植物冬青等植物的叶中，是具有独特生理活性及药理特性的次级代谢产物。针对不同的分子靶点，原儿茶酸具有多种多样的生物活性：可预防一些慢性变性、心血管和神经退行性疾病；可作为一种新型合成多聚物和塑料的组成部分；具有良好的电化学活性的与多糖物质结合的复合物；可合成生物塑料；在药理特性上具有抗菌、抗炎、抗氧化、防衰老等作用，还可潜在地用于药物和功能食品中。基于原儿茶酸的优异特性，其在医药、饲料、环保等领域的需求量不断增长，具有十分明显的生产意义。而植物提取的方法价格昂贵且产率低；化学合成法是市场目前普遍采用的方法，但其产生过多三废，不符合我国环保国情；采取的生物合成法使用廉价原料和易操作底盘细胞，具有成本低、能耗低，绿环保等优势。[0003]生物合成原儿茶酸的研究有Okai等利用过生产苯丙氨酸的谷氨酸棒状杆菌ATCC 21420菌株，通过模拟大肠杆菌莽草酸途径，过表达大肠杆菌CPL基因(Ubic)，终以分批补料方式喂养117.0g/L葡萄糖，培养72小时后产出1.14g/L原儿茶酸。Kallscheuer等以谷氨酸棒状杆菌MB001(DE3)为底盘细胞，敲除n
agIKL-nagR-nagT-genH(cg3349-c54)基因簇，以防止目的化合物对羟基苯甲酸和原儿茶酸的降解，再通过表达天然编码转酮醇酶基因(tkt)，以葡萄糖为底物，优化后生产2.0g/L原儿茶酸。Luo等利用电脑设计大肠杆菌莽草酸代谢途径，将大肠杆菌遗传中心株系4474敲除莽草酸脱氢酶(aroG)阻断下游合成途径，再通过自身启动子与强启动子交换，产生4.74g/L原儿茶酸。Weber等描述了在工程酵母中通过异种生物合成途径，将芳香氨基酸生物合成途径的中间体3-脱氢莽草酸合成原儿茶酸和邻苯二酚，再转化为顺，顺-己二酸。Curran等利用BY4741酵母菌株，敲除aro3，aro4基因，进行强启动子替换，过表达经密码子优化的莽草酸脱水酶和邻苯二酚-1,2-加双氧酶，经40g/L的葡萄糖发酵培养后，产生约0.3g/L的原儿茶酸。原儿茶酸从头合成通常伴随着对宿主细胞的毒性，这可能会导致非完全的生长和产量。
发明内容
[0004]本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌构建方法。该方法可使原儿茶酸达最大收率，具有广阔的工业化应用前景。
[0005]为此，在本发明的一方面，本发明提出了一种生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0006]PCR扩增获取PmLAAD、HmaS、HMO、BFD、HFD1、HpaBC、PobA七种基因，将PmLAAD
和HmaS 基因双片段、HMO和BFD基因双片段用BsaI酶切，随后分别连接进入经BamHI和XhoI双酶切的
表达载体pETDuet-1、pCDFDuet-1，得到质粒pET-PmLAAD-HmaS和质粒pCDF-HMO-BFD；将HFD1酶切后，连接进入表达载体pRSFDuet-1中得到质粒pRSF-HFD1；将HpaBC、PobA基因单片段酶切，分别连接经BamHI和XhoI双酶切的pACYCDuet-1载体，获得质粒pACYC-HpaBC和质粒pACYC-PobA；
[0007]将质粒pET-PmLAAD-HmaS、质粒pCDF-HMO-BFD、质粒pRSF-HFD1和质粒pACYC-HpaBC 共同转入大肠杆菌MG1655 RARE感受态细胞中，得到第一重组大肠杆菌工程菌MG1655-PCA1；
[0008]将质粒pET-PmLAAD-HmaS、质粒pCDF-HMO-BFD、质粒pRSF-HFD1和质粒pACYC-PobA 共同转入大肠杆菌MG1655 RARE感受态细胞中，得到第二重组大肠杆菌工程菌MG1655-PCA2。
[0009]根据本发明实施例的一种生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌构建方法，该方法表达6种酶：L-α-氨基酸转氨酶(L-α-amino acid deaminase,PmLAAD)、羟基扁桃酸合成酶(hydroxymandelate synthase,HmaS)、羟基扁桃酸氧化酶(hydroxymandelate oxidase, HMO)、苯甲酰甲酸脱羧酶(benzoylformate decarboxylase,BFD)、乙醛脱氢酶(aldehyde dehyd rogenase,HFD1)和大肠杆菌羟化酶(two-component flavin-dependent monooxygenase,HpaBC)的一株菌培养12h后，生产摩尔收率达64.4％的原儿茶酸；含有替代大肠杆菌羟化酶的4-羟基苯甲酸羟化酶(4-hydroxybenzonate hydroxylase,
PobA)的6种酶级联催化后生产接近100％收率的原儿茶酸。
[0010]在本发明的第二个方面，本发明提出了由上述方法构建的生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌。
[0011]在本发明的第三个方面，本发明提出由上述生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌用于生产原儿茶酸的用途。
[0012]在本发明的第四个方面，本发明提出由上述的生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌生产原儿茶酸的方法，其包括以下步骤：
[0013]将第一重组大肠杆菌工程菌和第二重组大肠杆菌工程菌分别进行活化和扩大培养，先接种于LB培养基中，之后按1:100比例将过夜培养物转接入TB培养液中培养，然后加入诱导剂进行诱导培养，离心收集细胞；
[0014]采用10g/L新鲜细胞干重，5mM L-酪氨酸底物，20g/L葡萄糖，磷酸盐缓冲液反应体系，在30℃，250rpm下催化1～12h，每隔两小时液相谱检测原儿茶酸产量。
[0015]根据本发明实施例的生产原儿茶酸的方法，其以L-酪氨酸为底物生产高产率原儿茶酸。生产可接近100％收率的原儿茶酸，达到了大肠杆菌重组菌株生产原儿茶酸的最大收率，具有广阔的工业化应用前景。
[0016]本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
[0017]图1为根据本发明实施例的PmLAAD、HmaS、HMO、BFD、HFD1、HpaBC六种酶催化合成原儿茶酸路径；
[0018]图2为根据本发明实施例的PobA替代HpaBC六种酶催化合成原儿茶酸路径；
[0019]图3为根据本发明实施例的第一重组大肠杆菌菌株MG1655-PCA1生产原儿茶酸的时间曲线图；
[0020]图4为根据本发明实施例的第二重组大肠杆菌菌株MG1655-PCA2生产原儿茶酸的时间曲线图；
[0021]图5为根据本发明实施例的第一重组大肠杆菌菌株MG1655-PCA1催化反应12h的HPLC验证图；
[0022]图6为根据本发明实施例的第二重组大肠杆菌菌株MG1655-PCA2催化反应12h的HPLC验证图。
具体实施方式
[0023]以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并
不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
[0024]为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
[0025]本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得；涉及的实验如无特别说明，均为常规实验方法。
[0026]所用材料来源：大肠杆菌菌株MG1655 RARE和TOP10为市售，大肠杆菌菌株MG1655 RARE用于本发明中所有基因的表达，TOP10用于载体构建。大肠杆菌表达载体pETDuet-1，pCDFDuet-1,pRSFDuet-1,pACYCDuet-1来源于Novagen，Phusion高保真DNA聚合酶、限制性内切酶购买自厦门鹭隆生物科技发展有限公司。质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒、胶回收试剂盒和细菌基因组DNA提取试剂盒购买自上海生物工程有限公司。
[0027]LB培养基组成为：10g L-1蛋白胨、5g L-1酵母粉、5g L-1NaCl，余量为双蒸水，0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。
[0028]TB培养基组成为：12g L-1蛋白胨、24g L-1酵母粉、2.31g L-1KH2PO4、12.54g L-1K2HPO4、0.4％甘油，余量为双蒸水，培养基在0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。
[0029]本发明实施例的羟基酪醇生物合成路径见图1和图2：
[0030]以L-酪氨酸为底物，通过L-α-氨基酸脱氨酶LAAD催化合成4-羟基苯丙酮酸，4-羟基苯丙酮酸在大肠杆菌羟化酶的作用下生成3,4-二羟基苯丙酮酸，经羟基扁桃酸合酶HmaS 的催化作用下合成3,4-二羟基扁桃酸，再经羟基扁桃酸氧化酶HMO、苯甲酰甲酸脱羧酶BFD 的催化下合成3,4-二羟基苯甲醛，最后在醇脱氢酶HFD1作用下合成原儿茶酸。由于HpaBC酶具有底物广泛性，会伴随着副产物产生，将4-羟基苯甲酸羟化酶PobA替代HFD1，可避免副产物积累。
[0031]为减少中间产物苯甲醛的还原，本发明以大肠杆菌MG1655 RARE为生产宿主，
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