专利申请
交底书名称 必须填写 | |
技术联系人姓名 及其电话、email 必须填写 | |
经办人姓名 及其电话、email 必须填写 如不填写，则默认技术联系人为负责人 | |
备注 事项 | 1、是否仅用于申请政府高新资质或政府项目 2、是否将来申请国外专利 一份好的技术交底书有助于代理人撰写高质量的专利申请文件，从而获得更好的授权前景和保护范围。 |
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注意事项 1.技术联系人应为深入了解本申请技术方案的技术人员，如交底书撰写人，负责向专利审核人员和代理人解释技术细节、修改交底书、审核申请文件等工作,请务必填写技术联系人的姓名、E-mail、手机。 2.经办人应为管理本案知识产权的人，例如指示本案的申请人是谁，本案的发明人是谁，是否申请费用减缓，确认本案是否可以提交等。请务必填写经办人的姓名、E-mail、手机。 3.专利申请不要求已具体实现或实施，形成完整的技术方案即可提交申请，特别是需要向合作方公开、向标准提案或以其他方式公开的重要技术构思应在公开前尽早申请。 |
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一、与本专利最接近的现有技术：
1、现有技术的方案简述（只需要描述与本专利相关的内容）：
要求提供现有技术的技术方案图，针对图示做详细的文字说明，以使代理人了解本发明（实用新型）的技术背景。
我国已明令禁止在动物饲料和饮水中使用β2激动剂，但其非法滥用现象仍时有发生，严重影响畜产品质量安全和人民身体健康。因此，加强对β2激动剂类药物的检测和监管具有重要的现实意义。 目前，对于β2激动剂的残留检测技术主要有以下几种。（1）谱检测法。常用的谱技术有高效液相谱(HPLC) (Degroodt 等, 1989)、气相谱-质谱联用法(GC-MS) (Fente等, 1999)、高效液相谱-质谱联用法(HPLC-MS) (王娟等,2009) 、毛细管电泳法(CE) (Somsak 等, 2008)等。有些已在在饲料和动物性食品β2激动剂检测中列为了国标方法 。虽然谱检测法具有准确性和特异性高等优点，但由于仪器昂贵，耗时长等缺点不利于在基层推广和现场检测。（2）生物传感器技术。它是近年来发展起来的一种可以用于检测β2激动剂类物质的新技术。已经有较多这方面的相关报道，Traynor等采用表面等离子体共振生物传感器对肝脏组织的激动剂类物质进行了检测，取得了令人满意的效果。虽然该方法实现了对β2激动剂的快速、高通量检测，但是由于受到生物传感器的稳定性、灵敏性、重现性及使用寿命等诸
多因素的限制，在实际应用上还有许多局限。（3）免疫学技术。该技术主要是基于抗原抗体特异性识别并发生结合反应的分析检测技术，主要包括放射免疫技术(RIA)、荧光免疫技术(FIAS)及酶免疫技术(EIA)等，其中较为成熟的为酶联免疫吸附技术（ELLSA），国内外许多公司都开发了相关的检测试剂盒，适用于大量样品的初筛。为了进一步提高免疫分析法的灵敏度和准确性，许多学者研发了许多新的免疫学方法。He等(2007) 建立了基于碳纳米管的无标记电化学免疫传感器用于快速检测动物饲料中的盐酸克伦特罗，此方法检出限为0.32ng/mL，操作简单且高通量。郭荷梅等 (2009) 应用胶体金免疫层析技术建立了一种快速检测莱克多巴胺的方法，该快速检测试纸条的灵敏度为5ng/mL，检测时间5min，批内和批间重复性为100%。但这些免疫学方法均是建立在抗原抗体特异性识别基础上，需要针对每种药物制备相应的抗体，很难做到β2激动剂类物质的多残留同时检测。
β2AR是G蛋白偶联受体 (GPCR) 超级家族中的一员，具有7个平行排列的跨膜a螺旋结构，跨膜域氨基酸残基同源序列保守性最高，N端无信号序列而含2个N—糖基化位点，细胞内外各有三个亲水性环。β2AR能特异性地识别天然和人工合成的β2激动剂类物质，因此发展基于受体的多残留检测技术可大大提高检测效率，降低检测成本。
由于天然β2AR在细胞内的丰度很低，从动物体内细胞膜上分离纯化受体难度很大，因此通过体外异源表达获得大量均一受体蛋白是目前主要途径。β2AR在大肠杆菌，酵母，杆状病毒和哺乳动物等表达系统中都可以表达出有功能活性的蛋白，但成功的程度因受体的种类不同和宿主细胞特点的不同而有差异(Tate等,1996; Grisshammer等,1993; Gherici Hassaine等, 2006）。 受体蛋白在原核细胞中的表达研究主要集中在八、九十年代 (Marullo, S等, 1988; Munch等, 1995)。原核表达具有操作简便，成本低等优点，但表达β2AR却很困难，因为该膜蛋白对于细胞是一种毒蛋白，可导致原核细胞死亡，而且表达的蛋白往往是包涵体形式，无翻译后的修饰过程，没有功能活性。近年来，毕赤酵母已成为表达众多膜蛋白的重要工具，它不仅可以对表达的外源蛋白进行正确折叠和糖基化，而且繁殖速度快，可低成本大规模生产。Markus等 (1998) 在毕赤酵母KM71(his4，Muts)和SMDll63中表达了人的 β2AR。有研究表明在毕赤酵母中β2肾上腺素受体表达量为20~30mg活性蛋白/15L培养基。杆状病毒感染的昆虫细胞是目前研究β2AR较为常用的寄主（Grunewald等, 1996; Lenhard等, 1996），昆虫细胞利于大量培养且表达蛋白活性与哺乳动物细胞类似。从1989年后，陆续有人在昆虫细胞中表达β2AR (George等, 1989）。哺乳动物细胞表达蛋白是在结构上最为接近天然蛋白的一种
表达系统。近些年随着对该表达系统研究的深入，β2AR在哺乳动物细胞上也得到了成功表达（Chelikani P 等, 2006; Granier S.等, 2007; Daniel M.等, 2007）。
目前，国内外基于受体的β2激动剂检测方法的报道极少。Sophie D等 (2007) 在大肠杆菌中表达了β2AR，并用其建立放射受体分析法检测β2激动剂和β2抑制剂，检测盐酸克伦特罗的IC 50范围是1×10−8mol/L~8±2×10−6mol/L。Boyd S等 (2009) 利用制备的β2AR蛋白建立放射受体分析法检测了动物饲料中的7种β2激动剂，除齐帕特罗外，其他均能检出，其中对盐酸克伦特罗的检测限是250ng/g，远远低于饲料中的添加量。国内对于β2AR的研究还大多集中于该受体基因的克隆和表达，表达的受体蛋白或未经活性鉴定，或试验证明活性较差，且将该重组受体应用于β2激动剂检测的研究几乎是空白。
二、本专利的技术：
（1）具体方案（描述的重点：与现有技术对比，本专利的差别以及如何通过这些差别实现客观改进效果）。
如果是计算机软件发明，请附上反映方案流程的流程图。
如果是产品，请附上计算机绘图（应该是线条描绘）以反映产品的各个部件。
请配合附图来描述各部件的连接关系（可结合附图中的数字标记描述），各步骤次序。应当详细到图中有标号的每个部件和每个步骤都要描述到。
上述技术方案，不能只做功能介绍，而应当说明是怎样实现的？技术方案的阐述以本领域技术人员不需付出创造性劳动即可实现为准。
实用新型必须提供结构图，图上需标记部件名称，同时结合图进行文字说明（工艺步骤、结构说明、原理说明、动作关系说明）。发明专利必要时提供图，图的文字说明同实用新型。
本发明所采取的技术方案：从猪肝细胞中克隆得到猪肾上腺素能受体Ss β2A基因，并将其克隆到穿梭表达载体pTriEx-1.1 Hygro（Novagen），然后将重组表达质粒pTriEx-1.1Hygro- Ss β2AR转染HEK293细胞并进行瞬时表达，表达的重组蛋白分子量约为48kDa。进一步进行重组蛋白Ss β2A的分离纯化，结合SDS-PAGE电泳和Western blot结果，纯度达到80% 以上。采用ELISA方法进行活性鉴定，该重组蛋白可特异性吸附β2激动剂类药物，揭示其可用于该类药物的快速检测。
本发明提供了一种经分离纯化的一种重组猪β2肾上腺素能受体蛋白，其具有β2激动剂结合活性，SDS-PAGE电泳显示重组蛋白分子量约为48kDa，纯度达到80% 以上。
重组猪β2肾上腺素能受体蛋白（Ss β2A），其具有以下条件之一：1）SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列；2）SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列经一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有相同活性的由SEQ ID No. 1衍生的蛋白质。
根据本发明公开的重组猪β2肾上腺素能受体蛋白Ss β2AR的氨基酸序列(SEQ ID No.1)，在保证其活性的前提下，取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，得到该受体蛋白的突变序列。因此，本发明的重组β2肾上腺素能受体蛋白Ss β2AR还包括SEQ ID No.1 所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基，具有与重组猪β2肾上腺素能受体蛋白Ss β2AR相同活性的由Ss β2AR衍生得到的蛋白质。SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列是由418个氨基酸残基组成的蛋白质。
本发明还提供编码上述编码权利要求1所述的重组猪β2肾上腺素能受体蛋白的基因。可选的，上述基因具备以下条件之一：1）SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；2）SEQ ID No.2 所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸，编码相同活性蛋白质的核苷酸序
列。3) 编码SEQ ID No. 1氨基酸序列的核苷酸序列。SEQ ID No.2 所示的核苷酸序列由1257个碱基组成，该基因的读码框为自5＇端第1到第1257位碱基。
本发明将核苷酸序列为SEQ ID No.2 的基因片段克隆到载体PMD-18T中，构建重组克隆质粒PMD-18T-Ss β2AR，并在感受态菌DH5α中扩繁。
本发明将上述重组克隆质粒进行改造后，将改造后基因片段定向克隆到表达载体pTriEx-1.1 Hygro中，构建重组表达质粒pTriEx-1.1 Hygro-Ss β2AR，并在感受态菌NovaBlue中扩繁。
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