(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810204875.1
(22)申请日 2018.03.13
(71)申请人 中国农业大学
地址 100193 北京市海淀区圆明园西路2号
(72)发明人 车会莲 蒲瑞熙丽亚·莉安头
杨帅 张亚妮 陈成
(74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限
公司 11002
代理人 王文君 陈征
(51)Int.Cl.
A61K 38/01(2006.01)
A61K 33/08(2006.01)
A61P 37/08(2006.01)
(54)发明名称
型的建立方法
(57)摘要
本发明提供了一种小鼠嗜酸性粒细胞食管
炎食物过敏模型的建立方法及应用，本发明采用
种方式加强嗜酸性粒细胞的活化和聚集，建立了
小鼠嗜酸性粒细胞食管炎食物过敏模型。通过利
灌胃能在期间引起模型组对鹌鹑蛋的
免疫反应，对花生蛋白特异性IgE及IgG1都表现
出抑制作用，可以降低花生蛋白特异性IgE及
IgG1抗体水平，抑制TH2细胞的极化，类EOE
样食物过敏反应。本发明为研究和嗜酸性粒
细胞食管炎提供了动物模型和便捷的方法。
权利要求书1页 说明书13页序列表3页 附图17页CN 108578675 A 2018.09.28
C N 108578675
A
1.一种小鼠嗜酸性粒细胞食管炎食物过敏模型的建立方法，其特征在于，通过经口诱导和经皮肤诱导两种方式联合诱导来建立小鼠嗜酸性粒细胞食管炎食物过敏模型。
2.如权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述经口诱导为：选BALB/c小鼠，在实验第0，7和14天分别经腹腔注射50-200μL致敏剂；实验第29-49天，小鼠每隔一天用100-300μL PBS或生理盐水灌胃刺激，所述PBS中溶有1-3μg/μL花生蛋白。
3.如权利要求2所述的建立方法，其特征在于，所述BALB/c小鼠为7至8周龄雌性BALB/c 小鼠。
4.如权利要求2所述的建立方法，其特征在于，所述致敏剂为含1-3μg/μL的花生蛋白和10-30μg/μL氢氧化铝凝胶的PBS溶液。
5.如权利要求1-4任一所述的建立方法，其特征在于，所述经皮肤诱导是指：将小鼠皮肤用胶带粘贴、剥离反复刺激，实验第1-7天、21-28天和42-49天，小鼠分别进行3次花生蛋白皮肤接触性致敏，并将含有PBS的胶带贴于皮肤致敏5-9天后取下，所述PBS含有花生蛋白。
6.如权利要求5所述的建立方法，其特征在于，小鼠皮肤剃毛后用密封胶带粘贴于剃毛处反复剥离刺激4-8次。
7.如权利要求5所述的建立方法，其特征在于，所述PBS含有2-6μg/μL花生蛋白。
8.一种小鼠嗜酸性粒细胞食管炎鹌鹑蛋过敏模型的建立方法，其特征在于，采用权利要求1-7任一所述建立方法，实验第21-49天，花生蛋白灌胃刺激1小时前，将15-20mg/kg ·bw鹌鹑蛋粉溶于PBS中，给BALB/c小鼠灌胃，同时向饮水瓶中添加15-20mg/L鹌鹑蛋粉使小鼠连续摄入鹌鹑蛋。
9.鹌鹑蛋在制备花生蛋白特异性IgE及IgG1抑制剂中的应用。
10.鹌鹑蛋在制备嗜酸性粒细胞食管炎食物过敏PAR2和NF -κBp65表达抑制剂中的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 108578675 A
一种小鼠嗜酸性粒细胞食管炎食物过敏模型的建立方法
技术领域
[0001]本发明涉及免疫学与动物医学模型应用领域，特别是涉及一种小鼠嗜酸性粒细胞食管炎食物过敏模型的建立方法及该模型在研究抗过敏剂对于过敏病症中的作用。
背景技术
[0002]嗜酸性粒细胞食管炎(Eosinophilic esophagitis，又称EoE)是一种迟发型食物过敏反应，在西方国家人中，发病率从每100,000人的10人上升到50人。亚洲已报道的关于EoE疾病的研究相对较少，但有学者发现EoE疾病在亚洲的发病率与西方国家相似。对于许多患者甚至是医生来说，EoE属于一种食物过敏的概念都是陌生的，因为EoE没有表现出过敏疾病典型的症状，如荨麻疹，肿胀，瘙痒，哮喘或过敏性休克。相反，它会引起食道功能障碍，如吞咽困难，食物阻塞，呕吐和疼痛。
[0003]美国国家过敏和传染病研究所专家小组将食物过敏定义为由于反复暴露于某种特定食物而发生的不利于健康的特异性免疫反应。一些研究表明EoE作为一种无法消退的食道炎症状态，避免与特定食物过敏原接触能够阻止该疾病的发生，而重复接触特定食物过敏原会导致疾病复发，因此，食物过敏原对
EoE疾病的发生至关重要。
[0004]嗜酸性粒细胞在EoE发病中发挥关键作用。尤其是在组织、血液和骨髓中升高的嗜酸性粒细胞数量是EoE的标志之一，并且与疾病严重程度相关，这表明嗜酸性粒细胞是EoE 的病理生理学中许多关键效应细胞之一。在EoE过敏疾病中，嗜酸性粒细胞的激活能促进各种介质的分泌，包括细胞因子如IL-4、IL-5、IL-13，转化生长因子(TGF)-β，趋化因子如CCL5、RANTES和CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子-1，和脂质介质如白三烯C4。这些介质对炎症反应具有深远的影响，包括上调粘附分子，增强细胞运输和激活，以及调节血管通透性和肌肉收缩。此外，嗜酸性粒细胞分泌毒性颗粒蛋白，其损害肠道上皮细胞，包括嗜酸性粒细胞过氧化物酶、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白、嗜酸性粒细胞衍生神经毒素和主要碱性蛋白，所有这些在EoE病人的组织都显示有明显地增加，促进组织损伤与功能障碍。
[0005]目前，由蛋白引发的EoE疾病较为常见，而评价蛋白致敏性最直接的方法是建立一种动物模型。动物模型在了解食物过敏反应发生和发展过程中所包含的复杂的免疫学及病理生理学机制等方面有极高的研究价值，动物模型还可用于研究抗过敏剂对于过敏病症的缓解作用。
发明内容
[0006]本发明的目的在于提供一种小鼠嗜酸性粒细胞食管炎食物过敏模型的建立方法。[0007]本发明的另一目的在于提供鹌鹑蛋在抗过敏中的应用。
[0008]本发明首先提供一种小鼠嗜酸性粒细胞食管炎食物过敏模型的建立方法，通过经口诱导和经皮肤诱导两种方式联合诱导来建立小鼠嗜酸性粒细胞食管炎食物过敏模型。[0009]所述经口诱导为：选BALB/c小鼠，在实验第0，7和14天分别经腹腔注射50-200μL致敏剂；实验第29-49天，小鼠每隔一天用100-300μL PBS灌胃刺激，所述PBS中溶有1-3μg/μL
花生蛋白。
[0010]优选地，在实验第0，7和14天分别经腹腔注射100μL致敏剂；实验第29-49天，小鼠每隔一天用200μL PBS灌胃刺激，所述PBS中溶有2μg/μL花生蛋白。
[0011]所述BALB/c小鼠为7至8周龄雌性BALB/c小鼠。
[0012]所述致敏剂为含1-3μg/μL的花生蛋白和10-30μg/μL氢氧化铝凝胶的PBS溶液。[0013]优选地，所述致敏剂为含2μg/μL的花生蛋白和20μg/μL氢氧化铝凝胶的PBS溶液。[0014]本发明小鼠嗜酸性粒细胞食管炎食物过敏模型的建立方法中，所述经皮肤诱导是指：将小鼠皮肤用胶带粘贴、剥离反复刺激，实验第1-7天、21-28天和42-49天，小鼠分别进行3次花生蛋白皮肤接触性致敏，并将含有PBS的胶带贴于皮肤致敏5-9天后取下，所述PBS 含有花生蛋白。所述PBS含有2-6μg/μL花生蛋白。优选地，所述PBS含有4μg/μL花生蛋白。[0015]优选地，小鼠皮肤剃毛后用密封胶带粘贴于剃毛处反复剥离刺激4-8次。在本发明的一个较佳实施例中，将小鼠经背部剃毛后用苏格兰密封胶带粘贴于剃毛处反复剥离刺激6次。
[0016]单纯使用花生蛋白经口诱发嗜酸性粒细胞活化并不能达到显著性水平，本发明中联合使用花生蛋白径口致敏和花生蛋白接触性皮肤致敏两种方式加强嗜酸性粒细胞的活化和聚集，建立了一种BALB/c小鼠EoE样食物过敏反应模型。在本发明所建立的动物模型中，用胶带反复剥离刺激六次，有利于皮肤接触致敏，增加了皮肤朗格汉斯细胞及树突状细胞对抗原的反应，允许抗原进入。树突状细胞提呈抗原，导致皮肤细胞释放的细胞因子(特别是TSLP)可能通过影响树突状细胞的能力而影响T细胞的极化。TSLP是一种类于IL-7的细胞因子，它由角质细胞释放，并在皮炎患者中高表达。皮肤致敏通过活化皮肤树突状细胞，促进Th2细胞因子分泌，诱导Th2极化。有证据表明TSLP能调节树突状细胞的极化，引发Th2炎症反应。因此，在实验第三周，本发明进行了灌胃激发。
[0017]本发明方法建立的动物模型可使致敏小鼠产生体重降低，体温下降、抓挠等系统性过敏反应症状和腹泻、皮炎等局部过敏反应症状，同时引发了食管、肺部和肠组织中嗜酸性粒细胞的聚集以及相关趋化因子，细胞因子等的表达，促进过敏原特异性IgE和IgG1的产生，表现出类EoE样的食物过敏反应。而在致敏后经鹌鹑蛋持续发现可有效抑制类EoE 样食物过敏反应，包括过敏性反应症状，过敏原特异性抗体水平，脾脏EoE相关细胞因子，嗜酸性粒细胞聚集和炎症反应等，该模型发病机制如图12所示。
[0018]本发明还提供一种小鼠嗜酸性粒细胞食管炎鹌鹑蛋过敏模型的建立方法，包括以下步骤：遵循上述小鼠嗜酸性粒细胞食管炎食物过敏模型的建立方法，在实验第21-49天，在花生蛋白灌胃刺激1小时前，
将15-20mg/kg·bw鹌鹑蛋粉，溶于PBS中，给BALB/c小鼠灌胃，同时向饮水瓶中添加15-20mg/L鹌鹑蛋粉使小鼠连续摄入鹌鹑蛋。
[0019]在本发明的一个实施例中，具体是采用以下步骤：
[0020](1)径口诱导：选用7至8周龄雌性BALB/c小鼠，在实验第0，7和14天分别经腹腔注射致敏剂100μL PBS，所述100μL PBS中溶有2mg氢氧化铝凝胶剂和200μg花生蛋白；实验第29-49天，小鼠每隔一天用200μLPBS灌胃刺激，所述200μL PBS中溶有2mg花生蛋白；[0021](2)皮肤诱导：将小鼠经背部剃毛后用苏格兰密封胶带粘贴于剃毛处反复剥离刺激六次，实验第1-7天、21-28天和42-49天，小鼠分别进行3次花生蛋白皮肤接触性致敏，并将1×1cm含有50μL PBS的胶带贴于剃毛处致敏7天取出，所述50μL PBS中含有200μg花生蛋
白；
[0022](3)鹌鹑蛋粉灌胃处理：实验第21-49天，在花生蛋白灌胃刺激1小时前，将17mg/ kg·bw鹌鹑蛋粉，溶于200μL PBS中，给BALB/c小鼠灌胃，同时向饮水瓶中添加17mg/L鹌鹑蛋粉使小鼠连续摄入鹌鹑蛋。
[0023]本发明也发现鹌鹑蛋灌胃能在在期间引起模型组对鹌鹑蛋的免疫反应。在本发明中，发
现鹌鹑蛋对花生蛋白特异性IgE及IgG1都表现出抑制作用，可以降低花生蛋白特异性IgE及IgG1抗体水平。本发明拟将鹌鹑蛋作为一种日常饮食物质进行推广，而非具有较短生物半衰期的口服补充剂，大多数口服补充剂倾向于具有更短的生物半衰期，一般在3和4小时之间，因此本发明设计不仅经口灌胃鹌鹑蛋溶液，还向饮用水中添加适量鹌鹑蛋粉进行功能性研究。但在本发明的过程中，发现鹌鹑蛋可能引发组血清中鹌鹑蛋特异性IgE及IgG1水平的升高，而单独的鹌鹑蛋处理也未产生食物过敏反应，这可能由于鹌鹑蛋中某些蛋白可能与花生蛋白存在交叉反应。但这种情况可以在第三周后减少，随着试验进行，鹌鹑蛋特异性IgE的升高逐渐消失。该数据表明鹌鹑蛋含有的卵类黏蛋白与已确定的过敏原蛋白不同，具有低致敏性或不具有致敏性，可作为安全的过敏反应剂进行应用。此外，鉴于鹌鹑蛋具有抑制蛋白酶活性的作用，本发明深入研究并确定了鹌鹑蛋发挥抗过敏作用的机理，即通过抑制组织中可引发炎症反应的PAR2活化以及其下游NF-κB 信号通路的激活而发挥作用。
[0024]在肠道过敏反应期间，肠神经系统(ENS)和免疫系统双向通信以调节神经生理效应，包括神经源性炎症和肠内离子转运和运动性以及相关性腹泻的变化。二次暴露于抗原导致肥大细胞脱颗粒、组胺激活、协调分泌及ENS推动性运动的防御反应，其作用是快速排出来自肠的抗原刺激源。口服抗原诱导的花生致敏小鼠腹泻的发展与血清中增加的组胺及类胰蛋白酶有着密切的关系，其表明肥大细胞脱颗粒的程度。肥大细胞分泌的介质增加，有可能导致白细胞在炎症部位的募集，特别是嗜酸性粒细胞，诱发EoE样疾病。
[0025]在这个模型中，在用抗原进行皮肤和灌胃激发后，嗜酸性粒细胞的积累不仅限于食道，在模型组小鼠的小肠中嗜酸性粒细胞，包括一些炎症介质也有明显地增加。在EoE过敏疾病中，嗜酸性粒细胞的激活能促进各种介质的分泌，包括细胞因子如IL-4、IL-5、IL-13，转化生长因子(TGF)-β，趋化因子如CCL5、RANTES和CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子-1，和脂质介质如白三烯C4。这些介质对炎症反应具有深远的影响，包括上调粘附分子，增强细胞运输和激活，以及调节血管通透性和肌肉收缩。此外，嗜酸性粒细胞分泌毒性颗粒蛋白，其损害肠道上皮细胞，包括嗜酸性粒细胞过氧化物酶、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白、嗜酸性粒细胞衍生神经毒素和主要碱性蛋白，所有这些在EoE病人的组织都显示有明显地增加，促进组织损伤与功能障碍。EoE作为一种食物引发的炎症性疾病，可能经日常摄入鹌鹑蛋而得以改善，将会成为一种有效无副作用的过敏性疾病的策略。
[0026]综合本发明的研究结果，鹌鹑蛋类EOE样食物过敏反应作用如图13所示。鹌鹑蛋抑制了TH2细胞的极化，在其处理后，TH2型细胞因子(IL-4，IL-5)水平显著降低，但未影响IL-13的水平。TH2型细胞因子水平的减少直接抑制了花生蛋白特异性IgE和IgG1的产生，但几乎未产生鹌鹑蛋特异性抗体。我们发现在实验第35天，鹌鹑蛋特异性IgE水平会显著增加，这与已报道的临床研究结果一致，即鹌鹑蛋过程中可观察到的患者血清中鹌鹑蛋特异性IgE突然升高，但随后开始显著降低。另外，鹌鹑蛋引发IgE水平的升高远低于花生蛋
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议