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基于丝素蛋白的止血水凝胶和止血海绵及其制备方法和应用

15wt％，丝素蛋白的浓度为5-20wt％；
8.步骤2，用注射器吸取步骤1制备得到的混合溶液，并将其置于40-45℃下，使得上述混合溶液凝胶化70-90s后取出，即得到基于丝素蛋白的止血水凝胶，利用注射器将上述水凝胶推入伤口中，即实现原位凝胶化止血的目的。
9.在步骤1中，所获得的混合溶液中月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐的浓度为15wt％，丝素蛋白的浓度为20wt％。
10.在步骤2中，恒温温度为42℃，混合溶液凝胶化时间为80s。
11.基于丝素蛋白的止血水凝胶的储能模量为222kpa。
12.基于丝素蛋白的止血海绵及其制备方法，按照下述步骤进行：
13.步骤1，将月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐和丝素蛋白加入去离子水中，搅拌使其充分溶解，即得到混合溶液，其中，所获得的混合溶液中丝素蛋白浓度为5-10wt％，月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐浓度为7.5-15wt％；
14.步骤2，将步骤1制备得到的混合溶液通过涡旋混合使得上述混合溶液中产生大量的气泡，并在涡旋混合的同时对其进行加热，加热温度为60-90℃，加热时间为90-120s，在加热的过程中，月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐诱导的丝素蛋白快速凝胶化，大量的气泡被固定在水凝胶中，由于重力和浮力的作用，最终获得具有不对称孔隙的sf-lae多孔水凝胶；
15.步骤3，将步骤2制备得到的具有不对称孔隙的sf-lae多孔水凝胶冷冻干燥，得到基于丝素蛋白的止血海绵。
16.在步骤1中，所获得的混合溶液中丝素蛋白的浓度为5wt％，月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐浓度为7.5wt％。
17.在步骤2中，加热温度为90℃，加热时间为105s。
18.在步骤3中，冷冻干燥的时间为2—3天，每天为24小时。
19.基于丝素蛋白的止血海绵在吸水后的压缩强度为35-37kpa，基于丝素蛋白的止血海绵的孔隙率为84-92％。
20.本发明的有益效果为：本发明缩短了丝素蛋白(sf)溶液凝胶化所需要的时间，制备出的两类止血剂：第一类止血剂是即时水凝胶止血剂，基于月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐(lae)可以诱导丝素蛋白(sf)溶液快速的凝胶化，首先设计了一种混合后可以即时原位凝胶化的止血水凝胶sf-lae-h材料；第二类止血剂是止血海绵材料，通过涡旋混合lae和sf溶液，同时加热混合溶液诱导丝素蛋白的快速凝胶化，将大量气泡固定在快速凝胶化的水凝胶中，进一步冻干以获得具有高吸液率和非对称孔隙的sf-lae-s止血海绵；该海绵一端孔隙疏松可以引流吸收血液，一端致密可以起到封堵伤口的作用，相互连接的多孔结构可以快速吸收血液，富集血细胞加速止血；该基于丝素蛋白的止血水凝胶和止血海绵均具有良好的抗菌性能和生物降解性能，可以用于不可压缩伤口的止血。
附图说明
21.图1是sf-lae-h水凝胶剪切模量g’，g”随时间的变化曲线图。
22.图2是sf-lae-h水凝胶的红外光谱图。
23.图3是sf-lae-h是凝胶的体内止血结果示意图，其中(a)大鼠肝脏穿透伤模型止血示意图；(b)空白组(1)、sf-lae-h组(2)的止血效果照片；黄箭头表示出血部位；(c，d)空
白组、纱布组和sf-lar-h组在大鼠肝脏穿透伤模型中的失血量和止血时间；数据以平均值
±
标准差表示。通过单向anova法检测显著差异。n＝5，**p《0.01，***p《0.001。
24.图4是sf-lae-s海绵的宏观形貌照片。
25.图5是sf-lae-s海绵及商业明胶海绵gel-s分别在放大倍率为200、300、2000倍时的扫描电子显微镜照片。
26.图6是gel-s、纯丝素蛋白冻干海绵psf-s、sf-lae-s海绵的孔隙率结果图，数据以平均值
±
标准差表示。通过单向anova法检测显著差异，n＝4，***p《0.001和ns：无显著性。
27.图7是sf-lae-s海绵的傅里叶红外光谱图。
28.图8是sf-lae-s海绵对去离子水、磷酸盐缓冲(pbs)溶液、抗凝兔全血的液体吸收率随时间的变化结果曲线图。
29.图9是gel-s度sf-lae-s海绵的压缩应力-应变测试结果图，其中a为gel-s度sf-lae-s海绵吸水和吸血后的压缩应力-应变结果曲线图，b为吸水后sf-lae-s的纵向和横向压缩展示照片(b)；
30.图10是与sf-lae-s共培养后细菌的相对活性测试结果柱状图，其中数据以平均值
±
标准差表示，通过单向anova法检测显著差异，n＝4，***p《0.001和ns，无显著性。
31.图11是sf-lae-s海绵的体内止血测试结果图，(a)兔肝脏穿透伤模型止血示意图，(b，c)在兔肝脏穿透创伤损伤模型中1-空白、2-纱布和3-sf-lae-s的失血量和止血时间，数据以平均值
±
标准差表示。通过单向anov a检测到显著差异，对于(b，c)n＝5，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001和ns：无显著性；(d)兔肝穿孔伤口模型中空白组、纱布组和sf-lae-s止血过程的照片。
32.图12是sf-lae-s、psf-s海绵的细胞活性测试结果柱状图。
33.图13是本发明的制备过程流程图。
具体实施方式
34.下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
35.实施例1
36.基于丝素蛋白的止血水凝胶，用去离子水分别配制混合后sf浓度为20％，lae浓度为15％的溶液，用注射器吸取溶液后置于42℃恒温箱中80s后注射到流血伤口中原位凝胶化止血。
37.实施例2
38.基于丝素蛋白的止血水凝胶，用去离子水分别配制混合后sf浓度为15％，lae浓度为15％的溶液，用注射器吸取溶液后置于42℃恒温箱中80s后注射到流血伤口中原位凝胶化止血。
39.实施例3
40.基于丝素蛋白的止血海绵，用去离子水分别配制混合后sf浓度为5％，lae浓度为7.5％的溶液，涡旋产生气泡的同时加热溶液约105s，迅速形成多孔凝胶。随后将上述凝胶冷冻干燥得到sf5-lae7.5-s多孔海绵，并装载到注射器中。
41.实施例4
42.基于丝素蛋白的止血海绵，用去离子水分别配制混合后sf浓度为10％，lae浓度为
7.5％的溶液，涡旋产生气泡的同时加热溶液约105s，迅速形成多孔凝胶。随后将上述凝胶冷冻干燥得到sf10-lae7.5-s多孔海绵。
43.实施例5
44.基于丝素蛋白的止血海绵，用去离子水分别配制混合后sf浓度为20％，lae浓度为15％的溶液，涡旋产生气泡的同时加热溶液约105s，迅速形成多孔凝胶。随后将上述凝胶冷冻干燥得到sf20-lae15-s多孔海绵。
45.对比例1
46.用去离子水配制sf浓度为10％的溶液，涡旋产生气泡的同时加热溶液约105s，停止加热后溶液未形成水凝胶，仍为溶液状态。将得到的溶液冻干得psf-s海绵，该海绵孔隙率低，吸液能力差，不具备良好的止血能力。
47.对sf-lae-h水凝胶的表征：
48.(1)对sf-lae-h进行流变性能测试：从储能模量和损耗模量随时间的变化可以看出(图1)，g’和g”在相对较短的时间内开始相交，表明水凝胶的超快速形成。同时水凝胶的储能模量最高可以达到222kpa。
49.(2)对sf-lae-h进行红外光谱测试：1626-1628cm-1
(酰胺i)归因于β折叠构象，如图2所示，sf-lae-h在1628cm-1
处显示出了明显的峰，峰值归属于β折叠，表明形成了物理交联网络和lae对sf的成功诱导。
50.(3)对sf-lae-h水凝胶进行体内止血能力测试：如图3所示，sf-lae-h前体溶液在注入伤口后及时固化，最终实现完全止血。此外，通过记录失血量和止血时间，进一步评估sf-lae-h的止血性能，并将纱布用作对照组。空白组、纱布组、sf-lae-h组的失血量分别为2.45克、2.11克和0.30克；止血时间变化趋势相似，分别为383秒、345秒和34秒，显然sf-lae-h的失血量最少，止血效果最好。这表明该材料可以通过物理阻断止血，是一种有潜力的止血材料。
51.(4)对sf-lae-h水凝胶进行抗菌性能测试：使用细菌共培养的方法评估sf-lae-h水凝胶的抗菌性能。实验中采用大肠杆菌和金黄葡萄球菌这两种革兰氏阴性杆菌和革兰氏阳性菌进行实验。通过于海绵共培养后的细菌的相对活性评价海绵的抗菌性，结果如图10所示，sf-lae-h水凝胶显示出比其他组高得多的抗菌活性，表明优异的抗菌效果。对sf-lae-s海绵的表征：
52.(1)由于浮力和重力作用，更多的大气泡向上移动，较少的小气泡停留在水凝胶的下部，从而形成上部松散、下部致密的不对称水凝胶，并将多孔水凝胶进一步冷冻干燥以获得具有不对称孔的sf-lae-s海绵，sf-lae-s海绵的宏观形貌如图4所示。通过扫描电子显微镜(sem)对sf-lae-s的微观形貌进行成像。如图5所示，sf-lae-s上部的孔隙较大且稀疏，而下部的孔隙较小且致密。此外，在2000倍的放大倍数下，通过冷冻干燥形成的微孔可以在整个海绵网络中看到。这些微孔是由水凝胶内部的水结晶形成的，尺寸较小。这些具有不同尺寸的微孔有助于形成分级多孔结构，提供出的液体吸收能力。相比之下，商业明胶海绵gel-s的孔隙虽然大但很少，这不利于毛细作用和吸水。sf-lae-s海绵这种非堆成的孔隙可以使上端的大孔隙引流血液，下端的致密孔隙防止血液流失。同时，对比图6中海绵的孔隙率可知，sf-lae-s海绵具有更高的孔隙率。
53.(2)对sf-lae-s海绵进行红外光谱测试：1626-1628cm-1
(酰胺i)归因于β折叠构象，
如图7所示，sf-lae-s在1628cm-1
处显示出了明显的峰，峰值归属于β折叠，表明形成了物理交联网络和lae对sf的成功诱导。
54.(3)对sf-lae-s海绵进行液体吸收能力测试：超快的液体吸收能力对于实现快速止血至关重要，评估了sf-lae-s海绵在水、pbs、抗凝兔全血中的液体吸收速率，对照组选择医用止血海绵(gel-s)。首先测试sf-lae海绵在干态下的初始重量，然后将称量好的干态海绵分别浸入上面的三种液体中，在不同的时间点取出海绵并用湿润的纸巾擦去表面吸附的多余液体，再次称量海绵的质量计算液体吸收能力。sf-lae海绵的液体吸收动力学曲线如图8所示，可以看到sf5-lae7.5-s海绵在100s内对水(1923％)、pbs(1734％)、血液(2898％)的吸收量均为最大，其中对血液吸收率最快，说明sf5-lae7.5海绵具有瞬间吸水、吸血的能力，而gel-s海绵吸水、吸血都很困难。
55.(4)对sf-lae-s海绵进行力学测试：测试了sf-lae海绵吸水和吸抗凝兔全血后的压缩应力-应变曲线，使用legend 2344电子测力机，实验温度为室温，gel-s作为对照组。将海绵切成直径为11mm，高度为0.5cm的圆柱体，分别进入去离子水和抗凝兔全血中达到平衡等待测试。将拉力机的压缩速率调整为10mm/min，对样品进行测试。将海绵分别浸入水和抗凝兔全血中，平衡稳定之后待测。结果如图9所示，sf-lae-s在吸收水和血液后表现出良好的机械稳定性和机械强度(54kpa)。而水和血液浸渍的gel-s强度较差。在压缩展示图中，用手轻压sf-lae-s海绵，可以迅速恢复海绵原有的形状，证明sf-lae-s海绵良好的回弹性能。
56.(5)对sf-lae-s海绵进行抗菌性能测试：使用细菌共培养的方法评估sf-lae-s海绵的抗菌性能。实验中采用大肠杆菌和金黄葡萄球菌这两种革兰氏阴性杆菌和革兰氏阳性菌进行实验。通过于海绵共培养后的细菌的相对活性评价海绵的抗菌性，结果如图10所示，sf-lae-s显示出比其他组高得多的抗菌活性，表明其优异的抗菌效果。
57.(6)对sf-lae-s海绵进行体内止血能力测试：将制备的海绵材料装入直径为11mm的注射器中，上端向外暴露使大孔首先接触伤口以排出血液，致密部分堵塞伤口以防止血液溢出。通过记录止血时间和失血量，在兔肝脏穿透伤模型中评估了sf-lae-s的体内止血性能。对于兔肝脏穿透性伤口模型，在兔肝脏上开一个直径为14mm的穿孔，并用注射器将海绵推入伤口，不加压，直到没有血液流出(图11a)。在用纱布处理145秒后，血液继续从兔子的肝叶渗出，而sf-lae-s组的出血完全停止。对照组、纱布组和sf-lae-s组的出血时间分别为20.9分钟、8.4分钟和2.4分钟；对照组、纱布组和sf-laes组的失血量分别为27.0g、7.3g和2.9g(图11b，c)。从数量上看，sf-lae-s组的总失血量和失血时间明显低于其他组，表明其作为止血材料的巨大潜力。
58.(7)是sf-lae-h、sf-lae-s海绵对小鼠成纤维细胞(l929)细胞毒性结果。先将准备好的sf-lae-h、sf-lae-s海绵分别和培养基浸泡24h，将l929细胞以2*104细胞/孔的浓度接种到96孔板中，培养24h，每孔加入以上sf-lae-s海绵的浸提液，共培养1天，之后每孔加入20μl 5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(mtt)溶液以及180μl新鲜培养基，培养4h，加入n,n
’‑
二甲基亚砜(dmso)，在酶标仪中震荡3min，并测量570nm处的吸光度，使用未加海绵的细胞作为对照组，通过吸光度的比值计算细胞存活率。在使用mtt定量测定细胞存活率，结果如图12所示，可以看到sf-lae-h、sf-lae-s海绵细胞存活率相较于对照组均在90％以上，说明此水凝胶和海绵的细胞相容性较好。
59.根据本

技术实现要素：

进行工艺参数调整，均可实现止血水凝胶和止血海绵的制备，经
测试表现出与本发明基本一致的性能。以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

技术特征：

1.基于丝素蛋白的止血水凝胶的制备方法，其特征在于：按照下述步骤进行：步骤1，将月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐和丝素蛋白加入去离子水中，搅拌使其充分溶解，即得到混合溶液，其中，所获得的混合溶液中月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐的浓度为5-15wt％，丝素蛋白的浓度为5-20wt％；步骤2，用注射器吸取步骤1制备得到的混合溶液，并将其置于40-45℃下，使得上述混合溶液凝胶化70-90s后取出，即得到基于丝素蛋白的止血水凝胶。2.根据权利要求1所述的基于丝素蛋白的止血水凝胶的制备方法，其特征在于：在步骤1中，所获得的混合溶液中月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐的浓度为15wt％，丝素蛋白的浓度为20wt％。3.根据权利要求1所述的基于丝素蛋白的止血水凝胶的制备方法，其特征在于：在步骤2中，恒温温度为42℃，混合溶液凝胶化时间为80s。4.如权利要求1-3任一所述的基于丝素蛋白的止血水凝胶的制备方法制备得到的基于丝素蛋白的止血水凝胶，其特征在于：基于丝素蛋白的止血水凝胶的储能模量为222kpa。5.基于丝素蛋白的止血海绵的制备方法，其特征在于：按照下述步骤进行：步骤1，将月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐和丝素蛋白加入去离子水中，搅拌使其充分溶解，即得到混合溶液，其中，所获得的混合溶液中丝素蛋白浓度为5-10wt％，月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐浓度为7.5-15wt％；步骤2，将步骤1制备得到的混合溶液通过涡旋混合使得上述混合溶液中产生大量气泡，并在涡旋混合的同时对其进行加热，加热温度为60-90℃，加热时间为90-120s，在加热的过程中，月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐诱导的丝素蛋白快速凝胶化，以使气泡被固定在水凝胶中，由于重力和浮力的作用，获得具有不对称孔隙的sf-lae多孔水凝胶；步骤3，将步骤2制备得到的具有不对称孔隙的sf-lae多孔水凝胶冷冻干燥，以得到基于丝素蛋白的止血海绵。6.根据权利要求5所述的基于丝素蛋白的止血海绵的制备方法，其特征在于：在步骤1中，所获得的混合溶液中丝素蛋白的浓度为5wt％，月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐浓度为7.5wt％。7.根据权利要求5所述的基于丝素蛋白的止血海绵的制备方法，其特征在于：在步骤2中，加热温度为90℃，加热时间为105s。8.根据权利要求5所述的基于丝素蛋白的止血海绵的制备方法，其特征在于：在步骤3中，冷冻干燥的时间为2—3天。9.如权利要求5-8任一所述的基于丝素蛋白的止血海绵的制备方法制备得到的基于丝素蛋白的止血海绵，其特征在于：基于丝素蛋白的止血海绵在吸水后的压缩强度为35-37kpa，基于丝素蛋白的止血海绵的孔隙率为84-92％。10.如权利要求1—4之一所述的基于丝素蛋白的止血水凝胶或者如利要求5—9所述的基于丝素蛋白的止血海绵在生物材料上的应用。

技术总结

本发明提供基于丝素蛋白的止血水凝胶和止血海绵及其制备方法和应用，将月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐和丝素蛋白加入去离子水中，搅拌使其充分溶解，即得到混合溶液；用注射器吸取上述混合溶液，并将其置于40-45℃下，使得上述混合溶液凝胶化70-90s后取出，即得到基于丝素蛋白的止血水凝胶，利用注射器将上述水凝胶推入伤口中，即实现原位凝胶化止血的目的。该基于丝素蛋白的止血水凝胶和止血海绵均具有良好的抗菌性能和生物降解性能，可以用于不可压缩伤口的止血。伤口的止血。伤口的止血。