(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010590015.3
(22)申请日 2020.06.24
(71)申请人 浙江天台药业有限公司
地址 317200 浙江省台州市天台县城关丰
泽路
申请人 中国计量大学
(72)发明人 周益峰 陈祉文 杨晓章 郭一平
陈杨毅 毛志峰
(74)专利代理机构 杭州知闲专利代理事务所
(特殊普通合伙) 33315
代理人 张勋斌
(51)Int.Cl.
C07K 5/083(2006.01)
C07K 1/107(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明提供了一种获得高纯度GHK铜肽的合
成方法，所述方法为将GHK三肽和铜络合剂相络
合，并通过过滤，旋干，冻干等后处理手段，即得
所述的高纯度的GHK铜肽。所述的铜络合剂选自
甲醇铜。本发明的优点主要体现在：与以往的合
成方法相比，操作简单，成本低廉，避免了树脂的
应用，可以得到纯度高，产率佳，样品各参数均合
格稳定的GHK铜肽产物，
可应用于大规模生产。权利要求书1页 说明书6页 附图1页CN 111808165 A 2020.10.23
C N 111808165
A
1.一种GHK铜肽的合成方法，其特征在于，包括：将含铜离子的铜络合剂溶于水中，再加入GHK三肽进行反应，反应结束后经过后处理得到所述的GHK铜肽。 所述的含铜离子的铜络合剂选自下列之一或两种的混合物：醋酸铜、氢氧化铜、二甲醇铜。
2.如权利要求1所述的GHK铜肽的合成方法，其特征在于，所述的GHK三肽和所述的铜络合剂的摩尔比为1:1～2。
3.如权利要求2所述的GHK铜肽的合成方法，其特征在于，所述GHK三肽和所述的铜络合剂摩尔比为1:1。
4.如权利要求1～3任一项所述的GHK铜肽的合成方法，其特征在于，所述铜络合剂为醋酸铜。
5.如权利要求1～3任一项所述的GHK铜肽的合成方法，其特征在于，所述铜络合剂为氢氧化铜和醋酸铜的混合物。
6.如权利要求4所述的GHK铜肽的合成方法，其特征在于，所述的后处理过程如下：反应液经过滤、浓缩，再加入碱试剂除去醋酸根，加入乙醇析出固体，加入需要量的醋酸，搅拌反应后经浓缩冻干得所述的GHK铜肽络合物。
7.如权利要求5所述的GHK铜肽的合成方法，其特征在于，所述的GHK三肽、氢氧化铜和醋酸铜的摩尔比为2:1:1；
所述的后处理过程如下：反应液经两次过滤，浓缩冻干得所述的GHK铜肽络合物。
8.如权利要求6所述的GHK铜肽的合成方法，其特征在于，反应温度为20～30℃，反应时间为3～5h，碱试剂为二乙胺。
9.如权利要求7所述的GHK铜肽的合成方法，其特征在于，反应温度为40℃，反应时间为12h。
10.如权利要求1所述的GHK铜肽的合成方法，其特征在于，所述方法具体过程如下：将醋酸铜溶于蒸馏水中，再加入与醋酸铜摩尔比为1:1的GHK三肽，30℃搅拌反应3-5h后经过滤、浓缩，再加入与GHK铜肽摩尔比为1:1.5的二乙胺，除去醋酸根，加入乙醇析出固体，加入需要量的醋酸，搅拌反应1h后经浓缩
冻干得所述的GHK铜肽络合物；
或者，所述方法具体过程如下：将醋酸铜溶于蒸馏水中，再加入与醋酸铜摩尔比为1:1的氢氧化铜、与醋酸铜摩尔比为1:2的GHK三肽，40℃条件下搅拌反应12h后，经过滤两次、浓缩冻干，即得所述的GHK铜肽络合物。
权 利 要 求 书1/1页CN 111808165 A
一种GHK铜肽的合成方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种简单方便的获得高纯度GHK铜肽的方法，尤其是一种能控制铜肽中醋酸含量等参数符合要求且稳定，可用于工业大生产的GHK铜肽合成方法。 背景技术
[0002]铜肽(GHK-Cu)是由铜离子和GHK三肽络合形成的一种化合物，其组成为甘氨酸-组氨酸-赖氨酸-铜(glycyl-L-histidyl-L-lysine-copper)，最初于1973年从人的血浆中分离而得，在医学上能够改善血液循环，促进神经和神经营养因子的合成，具有抗氧化性，抗炎症和癌症等作用。1999年研究者认为铜
肽及其铜修复物可以作为组织重塑的激活剂，同时也是一个信号肽，现主要用于皮肤护理产品中，促使皮肤上皮组织再生，恢复肌肤年轻、减少粗细皱纹与疤痕、改善肌肤弹性、使角质细胞和纤维姆细胞增生，更可以让皮下组织增厚，使肌肤不再脆弱敏感，增加皮肤弹性与韧度，也让保养品在脸上能被最大化的吸收利用。
[0003]目前已经报道的GHK铜肽的合成生产专利还较少，经典的固相多肽合成方法合成GHK铜肽原材料价格贵、成本高、产率低，不适合规模化生产。目前已有的文献中可见，熊瑛(GHK和Eptifibatide的合成研究.厦门大学,2007.)报道了首先通过将铜离子螯合到树脂上，再和GHK三肽络合得到GHK铜肽，该法应用到了树脂原材料，在合成过程中并不经济环保；Perkins C M,Rose N J,Weinstein B,et al.(The structure of a copper complex
of the growth factor glycyl-L-histidyl-L-lysine at resolution[J] .Chemischer Informationsdienst,1984,82(1):93-99.)报道的方法虽不需要应用到树脂，且能得到铜肽晶体，但其产率和重复率都不高，且操作中需要刮壁结晶，不适用于工业大批量生产；王惠嘉等(一种铜肽络合物GHK-Cu的合成及分析方法研究)报道的方法虽然操作方便，但其和铜离子络合的原料GHK醋酸盐是通过将GHK三氟乙酸盐进行离子交换后所得，仍存在不经济环保的缺点，此外，通过此法得到的GHK铜肽中各参数如醋酸含量参数值并不稳定，且持续偏高。
发明内容
[0004]本发明所要解决的技术问题在于克服现有方法中树脂使用导致的不经济环保、GHK铜肽产品的参数要求不稳定等缺点，提供一种成本低、简单易行、醋酸含量符合要求且稳定可控、易规模化生产的GHK铜肽合成方法。
[0005]解决上述技术问题所采用的技术方案由下述组成：
[0006]一种GHK铜肽的合成方法，包括：将含铜离子的铜络合剂溶于水中，再加入GHK三肽进行反应，反应结束后经过后处理得到所述的GHK铜肽；
[0007]所述的含铜离子的铜络合剂选自下列之一或两种的混合物：醋酸铜，氢氧化铜，二甲醇铜。
[0008]已经意外的发现，当选自上述铜络合剂任意一种参与上述方法合成，均可在避免
使用树脂的情况下得到目标GHK铜肽产物。
[0009]在根据本发明的实施方案中，当含铜离子的铜络合剂选为醋酸铜时，所述方法如下：将醋酸铜溶于蒸馏水中，再加入与醋酸铜摩尔比为1:1的GHK三肽，搅拌反应后经过滤、浓缩，再加入碱试剂除去醋酸根，加入乙醇析出固体，加入需要量的醋酸，搅拌反应后经浓缩冻干得高纯度的，醋酸含量符合要求且稳定可控的GHK铜肽络合物。
[0010]具体的，所述碱试剂选自下列之一：二乙胺，氢氧化钠，碳酸氢钠；所述GHK铜肽和碱试剂的摩尔比优选为1:1～2。
[0011]优选的，所述碱试剂为二乙胺，所述GHK铜肽和二乙胺摩尔比为1:1.2～1.8，更优选为1:1.5。
[0012]具体的，所述方法如下：将醋酸铜溶于蒸馏水中，再加入与醋酸铜摩尔比为1:1的GHK三肽，室温(一般规定为30℃)搅拌反应3-5h后经过滤、浓缩，再加入与GHK铜肽摩尔比为1:1.5的二乙胺，除去醋酸根，加入乙醇析出固体，加入需要量的醋酸，搅拌反应1h后经浓缩冻干得高纯度的，醋酸含量符合要求且稳定可控的GHK铜肽络合物。
[0013]本实施方案方法合成的GHK铜肽产物纯度高，产率一般，方法经济且操作较为简单。
[0014]在根据本发明的方法的又一实施方案中，当含铜离子的铜络合剂选为二甲醇铜时，所述方法如下：将二甲醇铜溶于甲醇中，不能完全溶解，再加入与二甲醇铜摩尔比为1:1的GHK三肽，搅拌反应后经过滤、浓缩，再加入需要量的醋酸，搅拌反应后经浓缩冻干得高纯度的，醋酸含量符合要求且稳定可控的GHK铜肽络合物。发现，当铜络合剂选为二甲醇铜时，反应时间过长且纯度有所下降，铜含量偏低。
[0015]在根据本发明的方法的又一实施方案中，当含铜离子的铜络合剂选为氢氧化铜时，所述方法如下：
将氢氧化铜溶于蒸馏水中，不能完全溶解，再加入与氢氧化铜摩尔比为1:1的GHK三肽，再加入需要量的醋酸，搅拌反应后经过滤、浓缩冻干得高纯度的，醋酸含量符合要求且稳定可控的GHK铜肽络合物。发现，铜络合剂为氢氧化铜较醋酸铜来说，实施方案更加简便，可有效提高产率，但铜含量偏低；较二甲醇铜来说，实施方案更加省时环保，选用原料更加经济。
[0016]此外发现，根据GHK铜肽要求的醋酸含量计算，可将一定比例混合的醋酸铜和氢氧化铜作为铜络合剂。
[0017]在根据本发明的方法的又一实施方案中，当含铜离子的铜络合剂选为氢氧化铜和醋酸铜的混合物时，所述方法如下：将醋酸铜溶于蒸馏水中，再加入氢氧化铜、GHK三肽，搅拌反应后经多次过滤、浓缩冻干得高纯度的，醋酸含量符合要求且稳定可控的GHK铜肽络合物。发现，得到的GHK铜肽纯度高，铜含量和醋酸含量符合要求且稳定可控。
[0018]优选的，所述氢氧化铜和醋酸铜比例为1:1。所述蒸馏水溶剂量优选为GHK三肽质量的十倍量。
[0019]具体的，所述反应温度优选为30℃～50℃，更优选为40℃。
[0020]具体的，所述方法如下：将醋酸铜溶于蒸馏水中，再加入与醋酸铜摩尔比为1:1的氢氧化铜、与醋酸铜摩尔比为1:2的GHK三肽，40℃条件下搅拌反应12h后，经过滤两次、浓缩冻干，即得高纯度的，醋酸含量符合要求且稳定可控的GHK铜肽络合物。
[0021]本发明所采用的合成GHK铜肽的方法避免了以往方法中树脂的使用，这样可以获
得纯度达99％以上的蓝粉末，大大提高了产率，对产物中铜含量和醋酸含量标准进行了控制，这是以往文献中从未报道实现的。
[0022]进一步的，本发明的合成方法还包括原料GHK三肽的制备，具体包括以下步骤：[0023]1、一种GHK三肽的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0024](1)在氢氧化钠的作用下，甘氨酸与Boc酸酐在1，4-二氧六环中进行反应，反应结束后经过后处理得到Boc-Gly-OH；
[0025](2)在三乙胺的作用下，组氨酸与二甲基二氯硅烷在二氯甲烷中进行反应，反应完毕再加入含三苯基氯甲烷的二氯甲烷溶液和三乙胺继续反应，反应结束后经过纯化处理Trt-His-OH；
[0026](3)在碳酸氢钠和五水合硫酸铜的作用下，赖氨酸或其盐与Boc-酸酐在丙酮和水的混合溶剂中进行反应，反应结束后经过纯化处理，得到Boc-Lys-OH；
[0027](4)在DCC的作用下，步骤(1)得到的Boc-Gly-OH与Hosu在1,4-二氧六环中进行反应，反应结束后经过纯化处理得到Boc-Gly-OSu；
[0028](5)在DIPEA的作用下，步骤(4)的Boc-Gly-OSu和步骤(2)的Trt-His-OH在DMF中进行反应，反应结束后经过纯化处理得到Boc-Gly-His(Trt)-OH；
[0029](6)在DCC的作用下，步骤(5)的Boc-Gly-His(Trt)-OH与Hosu在二氧六环中进行反应，反应结束后经过后处理得到Boc-Gly-His(Trt)-OSu；
[0030](7)在碳酸氢钠的作用下，步骤(3)的Boc-Lys-OH与步骤(6)的Boc-Gly-His(Trt)-OSu在四氢呋喃和水的混合溶剂中进行反应，反应结束后经过纯化处理得到Boc-Gly-His (Trt)-Lys(Boc)-OH；
[0031](8)在三乙基硅烷的作用下，步骤(7)的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH和三氟乙酸在二氯甲烷中进行反应，反应结束后经过纯化处理得到GHK三肽三氟乙酸盐；
[0032](9)步骤(8)的GHK三肽三氟乙酸盐溶解在乙酸乙酯和甲醇的混合溶液中，然后加入二乙胺至白沉淀析出，抽滤，收集滤饼，进行纯化处理得到所述的GHK三肽。
[0033]本发明的有益效果主要体现在：与以往合成方法相比，操作简单，成本低廉，获得的GHK铜肽纯度高，产率高，参数可控，适用于规模化生产。
附图说明
[0034]图1是实施例1的GHK铜肽质谱图；
[0035]图2是实施例5的GHK铜肽质谱图；
[0036]图3是实施例4的GHK铜肽质谱图；
具体实施方式
[0037]下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
[0038]实施例1：
[0039]将0.54g醋酸铜溶于20ml蒸馏水中，搅拌条件下再加入1.02gGHK三肽，室温(一般规定为30℃)搅拌反应3h后，经过滤、浓缩，再加入1ml二乙胺，搅拌30min，加入90ml乙醇析出固体，过滤，滤饼用蒸馏水洗涤后再溶于10ml蒸馏水中，加入0.13ml冰醋酸，搅拌反应1h
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