用于促进施万细胞的血管生成素1（Ang-1）分泌的、含有红花提取物的组合物的制作方法

用于促进施万细胞的血管生成素1(ang-1)分泌的、含有红花提取物的组合物

技术领域

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：1.本发明涉及用于促进施万细胞的血管生成素1(ang-1)分泌的、含有红花提取物的组合物。

背景技术

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：：2.为了使生命活动维持正常，重要的是对各脏器供给充分的氧气和营养、进而妥善地转运和处理在生命活动中产生的废物，承担该功能的器官是血管。血管不仅通过血液向全身的脏器输送氧气、营养素，而且承担着将组织中的废物转运并排出体外的作用，是人体维持生命活动的重要组织。3.作为血管，除了流动着从心脏泵出的血液的动脉、流动着返回心脏的血液的静脉以外，还包括占血管的90％以上(人类的情况下)的毛细血管。毛细血管主要由血管内皮细胞和血管壁细胞构成。4.血管内皮细胞例如通过彼此粘附而形成能避免血管内环境因子(细胞及体液因子)轻易渗出到血管外的内皮细胞间的粘接斑等，从而作为血管屏障起作用，另外，近年还获知，通过调节物质的通透性即屏障功能而在维持生命健康方面起到重要作用。已知血管屏障功能受损不仅成为炎症、动脉硬化等各种血管疾病的诱因，而且会使外周细胞发生氧气、营养的缺乏。5.另外，统称为血管壁细胞的血管平滑肌细胞、周细胞从血管内皮细胞的外腔面借助胞外基质或直接地粘附于血管内皮细胞。血管内皮细胞与血管壁细胞的粘附比率根据血管径的大小而不同，对大血管类而言，在1层血管内皮细胞上排布有多层血管壁细胞，对于中、小血管而言，通常在1个血管内皮细胞上排布1个血管壁细胞，另外，对于直径更小的血管而言，1个血管壁细胞会与多个血管内皮细胞粘附。从而，血管壁细胞相对于血管内皮细胞的排布对于血管结构很重要。例如，根据组织对氧气和营养成分的需求、尤其是当它们不足时，血管能够进行调节，使得管腔扩大而增加血流、使氧气和养分充分地遍及组织。6.作为影响该血管屏障功能的因子，有例如在血管内皮细胞中表达的作为受体型酪氨酸激酶的tie2(tyrosinekinasewithigandegfhomologydomain2，酪氨酸激酶与ig和egf同源结构域2)，已知通过活化tie2可使血管成熟化及稳定化等。7.更具体而言，例如非专利文献1中记载了如下内容：ang-1借助tie2受体而增强内皮细胞间及内皮细胞-壁细胞间粘附，使血管稳定化和引起血管通透性下降；在体外的内皮细胞中，ang-1增强ve钙粘蛋白粘附，降低血管通透性；以及认为ang-1-tie2信号增强ve钙粘蛋白粘附而控制血管屏障功能。8.另一方面，还报道了作为周围神经系统的胶质细胞之一的施万细胞对血管的屏障功能有影响(非专利文献2及3)，其详细情况目前仍存在较多不明之处。9.现有技术文献10.非专利文献11.非专利文献1：journalofjapanesebiochemicalsociety89(3):368-376(2017)12.非专利文献2：actabiomaterialiavol126,may2021,pages224-23713.非专利文献3：neurobiologyofdiseasevol48,issue3,december2012,pages546-555技术实现要素：14.本发明人们发现，红花提取物会促进施万细胞的ang-1分泌。本发明基于该发现。15.因此，本发明提供一种用于促进施万细胞的ang-1分泌的、含有红花提取物的组合物。16.根据本发明，提供以下发明。17.(1)一种组合物，其为用于促进被检体中施万细胞的血管生成素1(ang-1)分泌的组合物，所述组合物含有红花提取物。18.(2)根据(1)所述的组合物，其中，施万细胞为非髓磷脂施万细胞。19.(3)根据(2)所述的组合物，其中，施万细胞形成remak束。20.(4)根据(1)～(3)中任一项所述的组合物，其中，上述被检体为人。21.(5)根据(1)～(4)中任一项所述的组合物，其为局部用组合物。22.(6)根据(5)所述的组合物，其为溶液、悬浮液、分散液、乳液、乳膏、软膏、凝胶、洗剂、泡沫、糊、或喷雾的形态。23.(7)根据(1)～(6)中任一项所述的组合物，其为化妆品组合物。24.(8)红花提取物在用于制造药剂中的应用，所述药剂以促进被检体中的施万细胞的血管生成素1(ang-1)分泌为目的。25.(9)根据(8)所述的应用，其中，施万细胞为非髓磷脂施万细胞。26.(10)根据(9)所述的应用，其中，施万细胞形成remak束。27.(11)根据(8)～(10)中任一项所述的应用，其中，上述被检体为人。28.(12)含有红花提取物的组合物的用于促进被检体中施万细胞的血管生成素1(ang-1)分泌的应用。29.(13)根据(12)所述的应用，其中，施万细胞为非髓磷脂施万细胞。30.(14)根据(13)所述的应用，其中，施万细胞形成remak束。31.(15)根据(12)～(14)中任一项所述的应用，其中，上述被检体为人。32.(16)根据(12)～(15)中任一项所述的应用，其中，上述组合物为局部用组合物。33.(17)根据(16)所述的应用，其中，上述组合物为溶液、悬浮液、分散液、乳液、乳膏、软膏、凝胶、洗剂、泡沫、糊、或喷雾的形态。34.(18)根据(12)～(17)中任一项所述的应用，其中，上述组合物为化妆品组合物。35.(19)一种促进被检体中施万细胞的血管生成素1(ang-1)分泌的方法，其包括给予有效量的含有红花提取物的组合物的步骤。36.(20)根据(19)所述的方法，其中，施万细胞为非髓磷脂施万细胞。37.(21)根据(20)所述的方法，其中，施万细胞形成remak束。38.(22)根据(19)～(21)中任一项所述的方法，其中，上述被检体为人。39.(23)根据(19)～(22)中任一项所述的方法，其中，上述组合物为局部用组合物。40.(24)根据(23)所述的方法，其中，上述组合物为溶液、悬浮液、分散液、乳液、乳膏、软膏、凝胶、洗剂、泡沫、糊、或喷雾的形态。41.(25)根据(19)～(24)中任一项所述的方法，其中，上述组合物为化妆品组合物。42.根据本发明，提供用于促进施万细胞的ang-1分泌的、含有红花提取物的组合物。通过使用本发明的组合物，能够促进被检体中的施万细胞的ang-1分泌。另外，通过使用本发明的组合物，还能够提高被检体中的血管的屏障功能。另外，通过使用本发明的组合物，还能够使被检体中的血管进一步稳定化。附图说明43.图1示出由人施万细胞(hsc)释放的ang-1量的测定结果。具体实施方式44.根据本发明，提供含有红花提取物的组合物，该组合物能够促进被检体中施万细胞的ang-1分泌。45.本发明中的“红花”是指菊科植物中的红花(carthamustinctoriusl.)。作为使用部位，当然没有限定，可列举叶、茎、干、花、根、果实等，优选花。46.作为本发明中的“红花”的产地，当然没有限定，可列举中国、韩国、日本、以列、美国、印度等。另外，本发明中的“红花”的进货时期也没有限定，可以使用任何进货时期的红花。47.本发明中的红花提取物的制造方法没有特别限定，可以根据该

技术领域

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：中通常使用的方法进行提取。作为上述提取方法，当然没有限定，可列举例如热水提取法、超声波提取法、过滤法、回流提取法、溶剂提取法等。这些可以单独进行，或者将两种以上方法组合进行。另外，为了得到高纯度的提取物，可以将提取物用同样的方法进一步提取1次以上。48.用于制造本发明中的红花提取物的提取溶剂的种类没有特别限定，只要是得到对本发明的组合物赋予本发明的效果的红花提取物的提取溶剂，则可以使用该

技术领域

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：中公知的任意溶剂。作为这样的溶剂的例子，当然没有限定，可列举例如水、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、1,3-丁二醇、乙二醇、丙二醇、甘油、乙酸、乙酸乙酯、醚、己烷等，可以将这些中的两种以上组合使用。49.在红花提取物有商业销售的情况下，只要是对本发明的组合物赋予本发明的效果的红花提取物，则也可以使用该红花提取物。50.本发明的组合物中所含的红花提取物的配合量可根据用途适宜决定。51.本发明的组合物当然没有限定，可以为化妆品组合物。本发明中的化妆品组合物是指为了进行化妆的目的而使用的组合物，可以为经口用组合物、局部用组合物中的任一种。52.本发明的组合物可以为经口用组合物、局部用组合物中的任一种，优选为局部用组合物。将本发明的组合物制成局部用组合物时，可以进一步配合可配合于局部用组合物中的公知成分(添加剂)。作为这样的成分，当然没有限定，可列举例如乳化剂、可湿性粉剂(wettablepowder)、溶剂、润肤剂、稳定剂、增稠剂、保存剂、润滑剂、螯合剂、填充剂、赋形剂、粉末、芳香剂、香料、吸收剂、染料、乳白剂、抗氧化剂、维生素、氨基酸等。53.本发明中的局部用组合物可以为液体、半固体、固体中的任意者，当然没有限定，但优选为溶液、悬浮液、分散液、乳液、乳膏、软膏、凝胶、洗剂、泡沫、糊、或喷雾的形态。54.本发明中的被检体可以为任何动物，当然没有限定，但优选为哺乳动物，例如人、黑猩猩等灵长类、狗、猫等宠物、牛、马、绵羊、山羊等家畜动物、小鼠、大鼠等啮齿类等哺乳动物，更优选为人。55.通常，施万细胞在周围神经中参与例如髓磷脂形成、神经发育及再生、营养辅助、神经细胞胞外基质的产生、神经肌肉突触活动的调节等，通过是否形成髓磷脂而大致被分为髓磷脂形成施万细胞和非髓磷脂施万细胞这两种。髓磷脂形成施万细胞覆盖在包括全部运动神经、部分感觉神经在内的、直径较大的轴突的周围，对轴突的直径、神经纤维的磷酸化加以控制。1个髓磷脂形成施万细胞伴随一个轴突，形成髓磷脂。另一方面，非髓磷脂施万细胞与来自一部分感觉神经细胞的c纤维、交感神经节后细胞等直径较小(0.5～1.5μm)的轴突以及神经肌肉接头有关，例如在轴突周围细胞体伸展变薄而形成remak束、或覆盖运动神经的突触前末端。1个非髓磷脂施万细胞与多个轴突接触。本发明中的施万细胞当然没有限定，优选非髓磷脂施万细胞，更优选形成了remak束。56.本发明的“促进施万细胞的血管生成素1(ang-1)分泌”这一用途是指：直接或间接地促进施万细胞分泌ang-1，当然没有限定，例如是指增加施万细胞所分泌的ang-1的量、提高施万细胞分泌ang-1的速度等。该施万细胞所在的位置以血管周围为代表，可以是身体的任何位置。57.通过本发明的组合物的“促进施万细胞的血管生成素1(ang-1)分泌”这一用途，例如可以实现tie2活化、抑制血管通透性等，进而可以实现血管的稳定化、血管屏障功能的强化。58.本发明中“tie2活化”是指：能够通过将tie2磷酸化而将其转化为活性体(磷酸化tie2)的能力。在毛细血管结构的稳定化中，存在于血管内皮细胞的tie2的活化起到了重要作用。该tie2除了存在于血管内皮细胞以外也存在于淋巴管内皮细胞，可被例如血管壁细胞释放的ang-1活化而加强血管内皮细胞彼此的粘附、与血管壁细胞的粘附，与血管结构的稳定化有关。据报道，还发现该tie2的活性例如随着年龄而下降，而且明确了血管、淋巴管会随之而老化。另外，观察到tie2活化会使血管内皮细胞稳定化、抑制血管通透性等。因此，例如使血管内皮细胞牢固地结合，从而能够将营养输送至皮肤，使皮肤紧致、改善皮肤质地、防止皱纹等。另外，通过封堵血管、淋巴管的内皮细胞的间隙而改善血流，使来自组织的水分、废物得到回收，能够改善、预防发冷、肩膀僵硬、浮肿、淤堵等各种症状。因此，通过利用本发明的组合物促进施万细胞的ang-1分泌，从而可实现tie2活化、抑制血管通透性等。另外，通过利用这些作用来改善血管、淋巴管的状态，从而还可实现血管的稳定化、血管屏障功能的增强。59.实施例60.基于以下例子具体说明本发明，但是本发明不受这些例子限定。在没有特别声明时，含量以质量％来表示。61.人施万细胞的培养62.将获得的人施万细胞(hsc)(sciencellresearchlaboratories公司制)用含有生长补充剂(sciencellresearchlaboratories公司制)的施万细胞培养基(sciencellresearchlaboratories公司制)培养。每隔3天对hsc培养液进行培养基交换，至达到70％汇合状态，之后每隔1天进行培养基交换，至达到90％汇合状态。63.人施万细胞的传代培养64.达到90％汇合状态的人施万细胞通过以下方法进行传代。在传代培养时，首先准备用聚d-赖氨酸(pdl)包被的t-75培养烧瓶、及加入了5mlfbs或胰蛋白酶中和溶液(lifetechnologies公司制)的50ml锥形离心管。65.通过以下步骤进行t-75培养烧瓶的pdl包被。首先，将pdl(gibco公司制)用pbs稀释，从而制备50μg/ml的pdl溶液。将该pdl溶液添加到t-75培养烧瓶中，在室温下孵育1小时。孵育后去除pdl溶液，将培养表面用蒸馏水冲洗3次。在冲洗表面之后，将该培养表面经处理的t-75培养烧瓶在洁净室内在不加盖的状态下进行干燥，由此得到被pdl包被的t-75培养烧瓶。66.传代培养按照以下步骤进行。首先，将在烧瓶上培养的hsc用pbs冲洗，然后将在5ml的pbs中添加5ml的0.05％胰蛋白酶/edta(lifetechnologies公司制)而成的混合溶液加入到烧瓶上所培养的hsc中。将烧瓶轻轻地用标签(tab)覆盖，在37度下孵育1分钟后，将所添加的混合溶液转移到装有胰蛋白酶中和溶液的50ml锥形离心管中，向烧瓶中添加5ml的胰蛋白酶中和溶液，将该烧瓶进一步在37度下孵育2分钟。孵育后，将烧瓶内的已发生分离的hsc转移到50ml锥形离心管中。进而，加入5ml的胰蛋白酶中和溶液冲洗烧瓶，将烧瓶内残留的hsc回收到50ml锥形离心管中。将50ml锥形离心管以1000rpm离心分离5分钟，将hsc用施万细胞培养基轻轻地悬浮。对该悬浮液中的hsc进行计数，以达到375000hsc数/烧瓶的量的方式将hsc悬浮液接种到新的pdl包被烧瓶中，从而进行hsc的传代培养。67.红花提取物对hsc的ang-1释放的影响的评价68.用含有10％fbs的施万细胞培养基培养传代四次的hsc。将该培养的hsc以3×104hsc数/孔接种于pdl包被24孔板(iwaki公司制)。1天后，将培养基交换成含有2％fbs的施万细胞培养基，将红花提取物分别添加到各孔中，使其达到0.1％、0.5％、0.9％。在添加红花提取物起4小时后、24小时后、及48小时后，回收各孔中的上清。红花提取物的提取按照公知方法使用1,3丁二醇水溶液作为提取溶剂而进行。69.人ang-1的检测中使用了quantikineelisa试剂盒(biotecco.,ltd.制)。首先，按照试剂盒附带的说明书准备所有的试剂、各种溶液、样品及空白。将测定稀释液rd1-20向各孔中分别添加100μl，然后分别以每孔50μl添加对照、标准样品、及试验样品。使用试剂盒附带的粘合带覆盖平板，在微孔板振荡器上在室温下孵育2小时。然后，将各孔的溶液吸出，用400μl的清洗缓冲液清洗4次，清洗后将200μl的人ang-1的偶联物添加到各孔中。将平板用新的粘合带再次覆盖，在微孔板振荡器上在室温下孵育2小时。将各孔的溶液吸出，用400μl的清洗缓冲液清洗4次，清洗后，向各孔中添加400μl的底物液，在遮光条件下在室温下孵育30分钟。向各孔中添加50μl的反应停止液，添加后30分钟以内用酶标仪测定各孔的450nm及570nm的光学密度(od)值。对于得到的结果，通过t检验(p《0.05时记载为*)进行统计分析。70.将结果示于图1。添加红花提取物起4小时后的组与对照相比，观察到来自hsc的ang-1释放量增加的倾向。另外，添加红花提取物起24小时后及48小时后的组与对照相比，来自hsc的ang-1释放量显示出显著增加。以上结果表明，红花提取物使hsc释放ang-1。当前第1页12当前第1页12

技术特征：

1.一种组合物，其为用于促进被检体中施万细胞的血管生成素1(ang-1)分泌的组合物，所述组合物含有红花提取物。2.根据权利要求1所述的组合物，其中，施万细胞为非髓磷脂施万细胞。3.根据权利要求2所述的组合物，其中，施万细胞形成remak束。4.根据权利要求1～3中任一项所述的组合物，其中，所述被检体为人。5.根据权利要求1～3中任一项所述的组合物，其为局部用组合物。6.根据权利要求5所述的组合物，其为溶液、悬浮液、分散液、乳液、乳膏、软膏、凝胶、洗剂、泡沫、糊、或喷雾的形态。7.根据权利要求1～3中任一项所述的组合物，其为化妆品组合物。

技术总结

提供用于促进施万细胞的血管生成素1(Ang-1)分泌的、含有红花提取物的组合物。目的在于，提供一种组合物，其为用于促进被检体中施万细胞的血管生成素1(Ang-1)分泌的组合物，所述组合物含有红花提取物。一种组合物，其为用于促进被检体中施万细胞的血管生成素1(Ang-1)分泌的组合物，所述组合物含有红花提取物。取物。