[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公开说明书
[11]公开号CN 1527940A [43]公开日2004年9月8日
[21]申请号01823453.4[22]申请日2001.08.20
[21]申请号01823453.4
[30]优先权
[32]2001.07.07 [33]KR [31]2001/40678
[86]国际申请PCT/KR2001/001404 2001.08.20
[87]国际公布WO2003/005027 EN 2003.01.16
[85]进入国家阶段日期2004.01.07[71]申请人食品生物技术公司
地址韩国汉城江南区
[72]发明人卢建雄
[74]专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司代理人王学强
[51]Int.CI 7G01N 33/53
权利要求书 1 页 说明书 10 页 附图 2 页
[54]发明名称
法
[57]摘要
本发明提供了一种过敏分析和检测过敏原以及
其每一个点上有一个从不同种类的过敏原分离出来
的粗蛋白。通过使这种芯片和过敏病人的取样进行
反应，可以一次性的检测出不同的过敏原、以及与
特定过敏原引起的过敏反应有关的抗体的类型。
01823453.4权 利 要 求 书第1/1页 1.一种用于过敏分析的蛋白芯片，其特征在于，在其固体平板的一个点上结合有从不同种类的过敏原分离出来的每一种粗蛋白。
2.根据权利要求1的用于过敏分析的蛋白芯片，其特征在于，所述的粗蛋白通过分离溶解到中性盐溶液、乙醇、弱酸、PBS缓冲液中的一种或多种的混合溶液中的蛋白来制备。
3.根据权利要求1的用于过敏分析的蛋白芯片，其特征在于，所述的粗蛋白通过从鲜食物、热处理的食物和人工胃酸处理的食物之一来分离制备。
4.根据权利要求3的用于过敏分析的蛋白芯片，其特征在于，所述的人工胃酸含有0.842mg/ml的胃蛋白酶、2.0mg/ml的NaCl，其pH值为1.2。
5.一种检测过敏的方法，其特征在于，其步骤中使用权利要求1或权利要求4的蛋白芯片。
6.一种检测过敏的方法，其特征在于，在权利要求5所述的将蛋白芯片与样品反应步骤以后，还使用能够结合到要检测的抗体上并且能够与荧光材料结合的第二抗体或第三抗体来评价结果。
7.一种检测与特定过敏原诱导的过敏反应有关的抗体种类的方法，其特征在于，其中有使用权利要求1或权利要求4的蛋白芯片与样品反应的步骤。
8.根据权利要求7的检测与特定过敏原诱导的过敏反应有关的抗体种类的方法，其特征在于，在将蛋白芯片与样品反应步骤以后，还使用能够结合到要检测的抗体上并且能够与结合的第二抗体或第三抗体来评价结果。
9.根据权利要求8的检测与特定过敏原诱导的过敏反应有关的抗体种类的方法，其特征在于，所述的用于评价结果的荧光材料根据要检测的抗体而不同。
01823453.4说 明 书第1/10页分析过敏的蛋白芯片以及检测过敏原和抗体的方法
技术领域
本发明涉及分析过敏的蛋白芯片以及检测产生抗体的过敏原的方法。
背景技术
人体的免疫系统会产生抗体来消除抗原，比如从外界进入人体的外来物质。过敏现象就是产生的抗体对抗外来物质抗原的超敏免疫反应的结果，对大多数人而言都是无害的。作为对进入人体的抗原的反应，会产生许多抗体，比如诱导过敏的IgE、抑制过敏的IgG4、诱导一般免疫反应的IgG。这些抗体之间的相互作用的结果，产生支气管的收缩和毛细管的扩大，分泌腺受到刺激，接着产生过敏现象，比如咳嗽、流鼻涕。过敏引起的紊乱包括支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、过敏性皮炎、接触性皮炎。
方法之一是使用抗组胺药物，它能够短时间的缓解症状，但是有产生副作用的风险。最理想的方法是加强免疫功能和阻断过敏原物质。所以，检测过敏原物质对于过敏是很重要的。 常规的检测过敏反应的方法包括皮肤反应实验、诱导实验和血清实验。皮肤反应实验就是使过敏原与皮肤反应，然后检查是否发生了过敏翻译。该方法虽然简单、敏感并且被广泛采用，但是仍然受到了一定的限制，比如抑制使用抗组胺药物的病人的急性湿疹皮肤反应，这对于有效是很重要的。
诱导实验是使过敏原与病人的眼睛、鼻子和支气管直接作用。该方法的采用因为病人的负担较高而受到一定的限制。
血清实验就是检查总血清中的嗜伊红性粒细胞的数目或IgE效价。尤其是，无论病人的皮肤和用药状态如何，荧光免疫吸附剂实验(FAST)
都可以用来进行质量和数量分析。但是该方法只能用来检测某些种类的抗体，而且敏感性不如皮肤反应实验、花费昂贵。
另一方面，蛋白芯片用于检测蛋白疾病的研究开发非常活跃。 大多数蛋白芯片一般都是在固体平板上的一个点上结合一个蛋白。但是，对于过敏反应，则可以由包括在过敏原中的粗蛋白诱导，因而检测过敏原没有必要检测单一蛋白。
常规方法是检测单一过敏原诱导的过敏反应，这样也就没有办法到所有的过敏反应的原因。而且，常规方法也不能用来从众多的抗体中区别出针对特定过敏原的特定抗体。所以，为了有效的分析过敏，需要一次性检测出所有种类的过敏原、测试与过敏反应有关的抗体并确定准确的过敏原因。
本发明的目的是提供一种蛋白芯片，它用于检测病人过敏的原因、检测与特定过敏原引起的过敏反应有关的抗体的类型。
本发明的另外一个目的是提供一种使用上述蛋白芯片检测过敏原和抗体的方法。
发明内容
本发明提供了一种过敏分析和检测过敏原以及抗体的蛋白芯片。本发明的蛋白芯片是固体芯片，其每一个点上有一个从不同种类的过敏原分离出来的粗蛋白。通过使这种芯片和过敏病人的取样进行反应，可
以一次性的检测出不同的过敏原、以及与特定过敏原引起的过敏反应有关的抗体的类型。
本发明提供了一种分析过敏的蛋白芯片以及检测过敏原和抗体的方法。本发明的蛋白芯片是固体芯片，其每一个点上结合有一个从不同种类的过敏原分离出来的粗蛋白。通过使这种芯片和过敏病人的取样(比如血液、体液)进行反应，可以检测出不同的过敏原、以及与特定过敏原引起的过敏反应有关的抗体的类型。结合到本发明的蛋白芯片上的粗
蛋白是分离自过敏性有机物，比如房间灰尘、微粒、花粉、动物毛发、肉，包括微生物、豆、玉米、冬作物、海产品、蘑菇、水果、奶制品、蛋。
由于所有的过敏性蛋白不但包括纯蛋白，还包括非蛋白的氮源化合物，含有过敏原的所有蛋白的粗蛋白被分布在本发明的精确检测实验用的固体平板的一个点上。结合到本发明的蛋白芯片上的粗蛋白是溶解到中性盐水、乙醇、弱酸和磷酸盐缓冲液(PBS)中的混合蛋白。这样，本发明的蛋白芯片的一个点就能含有所有的粗蛋白。
本发明的结合到蛋白芯片上的粗蛋白分别被制成加工过的、消化过的、和新鲜的形式。食物性过敏不但会被新鲜食物诱发，还会被煮过的和体内消化过的食物诱发。所以，本发明的蛋白芯片上结合的粗蛋白使用了分离自新鲜食物的蛋白、生化过程处理过的能够诱导过敏反应的食物形式，比如加热、使用人工的胃酸消化过的形式。
使用人工的胃酸消化过的食物的处理方法如下。将新鲜食物和含有0.842mg/ml胃蛋白酶、2.0mg/ml NaCl、pH值为1.2的人工胃酸以1∶200 (w/w)的比例进行混合，加入HCl以后，在37.5℃处理30分钟。终止HCl的反应时，加入与HCl等量的10M NaOH，在99℃处理10分钟。按照1∶200(抗原：胰岛素)的比例加入50mg/ml的胰岛素，在37.5℃处理。终止反应时，在99℃处理10分钟。
从过敏原中分离粗蛋白的方法如下。
将反应物冻干，粉碎，以正己烷处理，然后收集小丸进行最终干燥。通过重复正己烷处理2次来去除液体。
洗脱并离心与0.5M NaCl中性盐溶液混合在一起的粉末。收集上层，用蒸馏水透析，冻干，得到溶解到乙醇中的蛋白。
上述程序中从上层分离收集的小丸是在加入蒸馏水后洗脱、然后离心收集，去除残留物。洗脱前将其与1％醋酸混合并离心。收集上层后，用蒸馏水透析，冻干，得到溶解到弱酸中的蛋白。
上述程序中从上层分离收集的小丸是在加入蒸馏水后洗脱、然后离心
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