(10)申请公布号 (43)申请公布日 2013.10.30C N 103373901 A (21)申请号 201310283189.5
(22)申请日 2013.07.05
CGMCC NO.7323 2013.03.19
C07C 31/24(2006.01)
C07C 29/88(2006.01)
(71)申请人上海交通大学
地址200240 上海市闵行区东川路800号
申请人山东三元生物科技股份有限公司
(72)发明人程海荣 吕霁烊 王犇 邓子新
(74)专利代理机构上海汉声知识产权代理有限
公司 31236
代理人牛山
陈少凌
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种从赤藓糖醇母液中提取
赤藓糖醇的方法及其专用酵母菌种。该方法为：
在赤藓糖醇母液中加入酵母菌种，进行发酵净
化；所述酵母菌种为能分解代谢所述赤藓糖醇
母液中除赤藓糖醇外的多元醇以及糖类的酵母
菌种。所述专用酵母菌种为假丝酵母(Candida
sp.SJTU828)CGMCC NO.7323。本发明采用生物发
酵净化的方法从赤藓糖醇母液中工业化提取赤藓
糖醇，提取效率高，对环境友好，有效地利用了废
弃的资源。
(83)生物保藏信息
(51)Int.Cl.
权利要求书2页 说明书9页 附图5页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书2页 说明书9页 附图5页(10)申请公布号CN 103373901 A
*CN103373901A*
1.一种从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法，其特征在于，所述方法为：在赤藓糖醇母液中加入酵母菌种，进行发酵净化；所述酵母菌种为能分解代谢所述赤藓糖醇母液中除赤藓糖醇外的多元醇以及糖类的酵母菌种。
2.如权利要求1所述的从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法，其特征在于，所述酵母菌种为假丝酵母(Candida sp.SJTU828)CGMCC NO.7323。
3.如权利要求1或2所述的从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
A、将赤藓糖醇母液稀释2～10倍，每100毫升所述稀释后的赤藓糖醇母液中加入氮源
0.2g～3g，调节pH为3.5～7.0，高温灭菌，冷却后接入酵母菌种，在25～35℃，转速为100～500转/小时的条件下进行发酵净化；
B、发酵净化结束后经过滤、脱、浓缩、结晶、精制，即得赤藓糖醇结晶体。
4.如权利要求3所述的从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法，其特征在于，步骤A 中，所述氮源为酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、玉米浆、磷酸氢二铵中的一种或几种的混合。
5.如权利要求3所述的从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法，其特征在于，步骤B 中，所述过滤具体为：发酵净化结束后通过离心或者膜过滤的方法将酵母菌种与发酵液分离，并通过纳滤分离去除所述发酵液中的分子量大于1000道尔顿的大分子粘性物质，得澄清透明的发酵液。
6.如权利要求5所述的从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法，其特征在于，步骤B 中，所述脱具体为：每100毫升所述澄清透明的发酵液中加入活性炭1～5g，在60℃～85℃下脱，得脱后过滤除去活性炭得到的无或浅的发酵液。
7.如权利要求6所述的从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法，其特征在于，步骤B 中，所述浓缩具体为：将无或浅的发酵液在70℃以上浓缩到固形物含量为50～80％，得富含赤藓糖醇的糖浆。
8.如权利要求7所述的从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法，其特征在于，所述结晶具体为：将所述富含赤藓糖醇的糖浆以2～5℃/h的速率冷却降温至10℃以下，在起晶点温度下每100毫升所述糖浆中加入0.1～2g赤藓糖醇晶体诱导成晶，离心分离，即得赤藓糖醇粗晶体与赤藓糖醇二次母液。
9.如权利要求8所述的从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法，其特征在于，所述精制具体为：用去离子水溶解所述赤藓糖醇粗晶体得赤藓糖醇粗晶体溶液，每100毫升所述赤藓糖醇粗晶体溶液中加入0.1～5g活性炭，在60℃～85℃下搅拌脱30～180min；过滤分离活性炭得赤藓糖醇糖液，将所述赤藓糖醇糖液浓缩到固形物含量为20～30％后，依次进行阴离子树脂与阳离子树脂离子交换，待电导率降到100μs以下后继续浓缩到固形物含量为50～80％，得到富含赤藓糖醇的糖浆，以2～5℃/h的速率冷却降温至10℃以下，在起晶点温度下每100毫升所述糖浆中加入0.1～2g赤藓糖醇晶体诱导成晶，离心分离，得赤藓糖醇精制晶体与赤藓糖醇三次母液。
10.如权利要求9所述的从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法，其特征在于，还包括如下步骤：
a、将所述赤藓糖醇二次母液和所述赤藓糖醇三次母液的合并液浓缩到固形物含量为
50～80％，得到富含赤藓糖醇的糖浆，以2～5℃/h的速率冷却降温至10℃以下，在起晶点温度下每100毫升所述糖浆加入0.1～2g赤藓糖醇晶体诱导成晶，得到赤藓糖醇粗晶体；
b、将所述赤藓糖醇粗晶体按照所述精制的方法进行精制，得赤藓糖醇精制晶体。
11.一种用于如权利要求1所述从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法的酵母菌种，其特征在于，所述酵母菌种为假丝酵母(Candida sp.SJTU828)CGMCC NO.7323。
从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法及其专用酵母菌种
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法及其专用酵母菌种。
背景技术
[0002] 赤藓糖醇是一种低热量具有甜味的功能糖醇，在食品领域得到较为广泛的应用。赤藓糖醇主要是采用酵母发酵葡萄糖合成。不同的酵母在发酵葡萄糖合成赤藓糖醇的过程中，除了得到赤藓糖醇这一目的产物外，还会产生其它不同种类的多元醇。比如我国赤藓糖醇企业广泛使用的解脂假丝酵母(现在称为解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica)除了合成赤藓糖醇外，还产生一定量的甘油、核糖醇、阿拉伯糖醇以及甘露醇副产物(Tokuoka K，Ishitani T，Chung WC.1992.J Gen Appl Microbiol 38：35)。木兰假丝酵母除了合成赤藓糖醇外还产生甘油副产物(Lee KH，Seo JH，Ryu YW.2002.JBiotechnol Bioeng 17：509)。发酵结束后发酵液中除了含有赤藓糖醇，还含有核糖醇、甘油、阿拉伯糖醇以及甘露醇副产物。我国赤藓糖醇工业菌株发酵液中赤藓糖醇的含量一般在140～180克/升，而副产物的含量达到10～50克/升。
[0003] 发酵液经过浓缩将赤藓糖醇多次结晶后得到的粘稠液体即为赤藓糖醇母液，该母液中副产物(除赤藓糖醇外的其它多元醇)的含量一般达到100～300克/升，赤藓糖醇的含量一般在150～200克/升，赤藓糖醇的纯度低于50％，无法再结晶。该母液除了含有赤藓糖醇、甘油、核糖醇、阿拉伯糖醇、甘露醇等多元醇外，还含有大分子素、多糖、低聚糖以及发酵时加入的消泡剂等物质。这些大分子物质的存在使得通过物理的分离方法(谱分离)难以将其中的赤藓糖醇有效的分离。虽然有从赤藓糖醇母液再提取赤藓糖醇的专利文献报道，比如，申请号为CN201210364267.X的中国发明专利公开了一种从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法，该方法通过母液的静置沉淀以除去部分颗粒杂质，然后浓缩加入有机溶剂
乙醇并在低温-5℃的条件下结晶。该方法要求加入易燃易爆的乙醇以及在-5℃的结晶条件，在大规模生产时难以做到。而且采用该方法赤藓糖醇的纯度并没有得到提高，副产物仍然存在于母液中，赤藓糖醇的结晶收率仍然很低。申请号为CN201210363274.8的中国发明专利公开了一种赤藓糖醇母液的处理方法。该方法采用在母液中加入赤藓糖醇粗晶体以提高母液中赤藓糖醇的含量，然后再精制、浓缩并结晶。但该方法需要先加入大量的赤藓糖醇粗晶体(加入2倍母液体积的赤藓糖醇含量为25-40％的赤藓糖醇粗晶体溶液)，并不经济。然后直接通过活性炭脱与离子交换。由于母液中含有大量的胶体类粘度大的物质，活性炭脱以及离子交换效果并不好。申请号为CN201210042264.4与CN201210480454.4的中国发明专利均描述了从赤藓糖醇母液中回收或分离提纯赤藓糖醇的方法，二者的方法基本一致，包括用水将母液稀释，然后分别经过超滤、纳滤、浓缩结晶等步骤。虽然经过这些处理步骤，但母液中的其它多元醇杂质并没有得到去除或分离，赤藓糖醇的含量并没有提高，因此赤藓糖醇的回收得率依然很低，没有经济上的使用价值。因此，我国赤藓糖醇生产企业大多将赤藓糖醇母液作为废弃液进行污水处理或直接排放，即浪费
了资源又损害了环境。因此，开发一种高效的从赤藓糖醇母液中回收赤藓糖醇的方法具有重要的意义。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于克服上述现有的赤藓糖醇母液分离技术存在的不足，提供一种从赤藓糖醇母液
中高效提取赤藓糖醇的方法及其专用酵母菌种。本发明通过采用生物净化的方法，利用分离并改进的酵母将赤藓糖醇母液中赤藓糖醇以外的其它多元醇以及大分子物质分解代谢，显著提高赤藓糖醇母液中赤藓糖醇的纯度，再通过精制的过程(超滤、纳滤、浓缩、结晶以及重结晶等)，从赤藓糖醇母液中高效的分离出符合国家标准的赤藓糖醇晶体。
[0005] 本发明所使用的一种酵母菌种为假丝酵母(Candida sp.SJTU828)，该菌株已于2013年3月19日递交CGMCC中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.7323。
[0006] 本发明所使用的酵母菌株的分离方法与特性如下：
[0007] 酵母菌株CGMCC No.7323在液体培养基中(成分：葡萄糖、酵母粉以及蛋白胨各10克/升)培养24小时后单个细胞在400倍显微镜下为长椭圆形，长10-30微米，宽3-5微米，两端出芽生殖，单个细胞或者3～8个大小不同的细胞连在一串形成假丝状。菌落圆形，边缘锯齿状，表面有折皱，淡黄或米黄，表面干燥凸起。能在含有葡萄糖，半乳糖、木糖，木糖醇，山梨醇，甘露醇，D-半乳糖醇，L-阿拉伯糖醇，D-阿拉伯糖醇，核糖醇，甘油，麦芽糖以及低聚麦芽糖作为唯一碳源的基本培养基上良好生长，基本培养基成分为：酵母氮碱10克/升，购自BD公司，货号239210。该酵母不能在含赤藓糖醇的基本培养基上生长。将该酵母菌株在高浓度的赤藓糖醇母液的液体培养基中连续驯化50次，每次培养时间
为5天，使其适应赤藓糖醇母液，提高在赤藓糖醇母液的抗逆性。通过26SrDNA的分子鉴定，该酵母菌株为假丝酵母(Candida sp.)。
[0008] 本发明是通过以下技术方案来实现的：
[0009] 第一方面，本发明涉及一种从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法，在赤藓糖醇母液中加入酵母菌种，进行发酵净化即可；所述酵母菌种为能分解代谢所述赤藓糖醇母液中除赤藓糖醇外的多元醇以及糖类的酵母菌种。
[0010] 优选地，所述酵母菌种为假丝酵母(Candida sp.SJTU828)CGMCC N0.7323。[0011] 优选地，所述方法包括如下步骤：
[0012] A、将赤藓糖醇母液用水稀释2～10倍，每100毫升所述稀释后的赤藓糖醇母液中加入氮源0.2g～3g，该氮源可以是单一氮源，也可以是复合氮源；调节pH为3.5～7.0，高温灭菌，冷却后接入酵母菌种，在25～35℃，转速为100～500转/小时的条件下进行发酵净化；定时取样进行高效液相谱分析，当除了赤藓糖醇以外的其它杂质多元醇分解完全时停止发酵。所述酵母菌种能分解代谢所述赤藓糖醇母液中除赤藓糖醇外的多元醇以及糖类；
[0013] B、发酵净化结束后经过过滤、脱、浓缩、结晶，即得赤藓糖醇粗晶体；得到的粗晶体重新溶解，再经过脱与离子交换脱盐，浓缩，再结晶，得到赤藓糖醇精制晶体。
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