(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010391704.1
(22)申请日 2020.05.11
(71)申请人 杭州师范大学
地址 311121 浙江省杭州市余杭区仓前街
道余杭塘路2318号
(72)发明人 刘军 刘俊平
(74)专利代理机构 杭州浙科专利事务所(普通
合伙) 33213
代理人 沈渊琪
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6804(2018.01)
(54)发明名称
(57)摘要
一种同时检测酵母所有端粒长度的方法，属
于生物工程技术领域。本方法包括：（1）取酵母细
胞的基因组DNA，加入限制性内切酶MmeI在50微
升体系中消化过夜；（2）置于0.9%琼脂糖凝胶电
泳处理；（3）取凝胶先后放置于0.25M盐酸、变性
缓冲液和中和缓冲液中处理并水洗；（4）利用虹
吸法将凝胶上的DNA过夜转移至带正电荷的尼龙
膜上，利用紫外交联仪进行DNA与带正电荷的尼
龙膜共价键交联；（5）试剂盒标记TG 1-3探
针作DNA印记分析，检测端粒长度。本发明方法首
次使用限制性内切酶MmeI切割基因组DNA，可以
检测获得全部32个端粒的长度，比现有技术检测
17个端粒长度更加全面，有利于后续研究和相关
技术的开发和应用。权利要求书1页 说明书6页 附图3页CN 111575342 A 2020.08.25
C N 111575342
A
1.一种同时检测酵母所有端粒长度的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）取酵母细胞的基因组DNA，加入1微升2U限制性内切酶MmeI在50微升体系中消化过夜，得到酵母所有32个端粒的最小末端限制性片段；
（2）置于含有1XTBE缓冲液的0.9%琼脂糖凝胶中电泳分离处理；
（3）电泳完成后，将凝胶浸没于0.25M盐酸中缓慢摇动30min进行脱嘌呤处理，倒去0.25M盐酸后用水洗2次，加入含有1.5 M NaCl和0.5 M NaOH的强碱变性缓冲液，使凝胶浸没缓慢摇动处理30min，倒去强碱变性缓冲液后水洗2次，再加入含有3M NaCl和0.5M Tris -HCl pH7.0的中和缓冲液，使凝胶浸没缓慢摇动处理30min；
（4）利用虹吸法将经步骤（3）处理后的凝胶上的DNA用含有0.3 M NaCl和0.03 M柠檬酸钠的2XSSC缓冲液过夜转移至带正电荷的尼龙膜上，在上述带有DNA的尼龙膜的正面利用紫外交联仪进行能量交联200 mJ/cm 2 ，10min；
（5）利用试剂盒标记长度为250碱基对的TG 1-3序列探针，做DNA印记分析，检测端粒长度。
2.如权利要求1所述的一种同时检测酵母所有端粒长度的方法，其特征在于所述步骤
（1）中50微升体系包含5微摩尔终浓度SAM。
3. 如权利要求1所述的一种同时检测酵母所有端粒长度的方法，其特征在于所述步骤
（2）中凝胶的长´宽´高为：18.5cm ´15 cm ´1 cm，电泳分离处理条件为：恒压90V，2.6V/cm，30min，再恒压120 V，3.5V/cm，3-3.5h，所述每厘米为正负电极间的距离。
4. 如权利要求1所述的一种同时检测酵母所有端粒长度的方法，其特征在于所述步骤
（5）中标记TG 1-3序列探针的方法为：模板量为1微克，加去离子水体积调整为16微升，98℃变性处理5min立即置于冰水浴中2min使模板DNA处于单链状态，1000rpm离心2min后加入试剂盒中标记试剂4微升，37℃温育20小时后，加入2微升0.2 M EDTA在65℃处理10min终止反应后，保存于-20℃备用。
5. 如权利要求1所述的一种同时检测酵母所有端粒长度的方法，其特征在于所述步骤
（5）中DNA印记分析方法为：将紫外交联后的膜DNA面朝上，置于杂交管中，杂交炉缓慢转动，60℃进行预杂交处理1-2小时，探针首次使用于98℃处理10min，立即置于冰水浴中10min，倒去预杂交液，加入经过变性冷却的探针使得探针终浓度为25 ng/ml，缓慢转动60℃杂交过夜，期间封闭和结合碱性磷酸酶标记二抗的步骤参考试剂盒条件进行，最后采用终浓度为1%SDS的40 mMpH7.2磷酸缓冲液洗膜2次，每次20min，恒定转速80rpm/min。
权 利 要 求 书1/1页CN 111575342 A
一种同时检测酵母所有端粒长度的方法
技术领域
[0001]本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种同时检测酵母所有端粒长度的方法。
背景技术
[0002]酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是与人类关系最广泛的一种酵母，在现代分子和细胞生物学等基础学科中用作真核模式生物，其作用和地位相当于原核的模式生物大肠杆菌。酵母基因组由16条线性染体组成，染体末端为端粒保护结构（由端粒DNA和其上结合的蛋白质组成），共32个，其中17个端粒（TEL02L，TEL04R，TEL05L，TEL05R，TEL06L，TEL07R，TEL08L，TEL08R，TEL09L，TEL10L，TEL12L，TEL12R，TEL13L，TEL14L，TEL15R，TEL16L）的DNA中靠近末端TG1-3序列的亚端粒区包含有19个Y'元件，12号染体的左、右臂分别含有2个Y'元件。其余15个端粒为仅包含X元件的端粒（TEL01L，TEL01R，TEL02R，TEL03L，TEL03R，TEL04L，TEL06R，TEL07L，TEL09R，TEL10R，TEL11L，TEL11R，TEL13R，TEL14R，TEL15L）。[0003]现在通用的检测酵母端粒长度的标准方法为利用限制性内切酶XhoI或PstI切割基因组DNA释放最小的染体端粒末端限制性片段（chromosomal terminal restriction fragment，TRF），然后利用同位素32P或者（digoxigenin）标记的端粒序列TG1-3特异的探针做印记分析检测端粒长度。无论是XhoI还是PstI只能在17个含有Y’元件的端粒上切割Y’元件序列，而不能切割其余的15个端粒的亚端粒序列产生可以测定端粒长度的最小TRF。然而酵母基因组由16条染体组成，包含32个端粒。目前，尚没有一种简单的可以同时检测酵母的32个端粒的长度的TRF方法。
发明内容
[0004]针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种同时检测酵母所有端粒长度的方法。本方法通过使用限制性内切酶MmeI切割基因组DNA释放所有32个端粒的最小末端限制性片段并利用标记的TG1-3探针做DNA印记分析检测所有端粒的长度。
[0005]一种同时检测酵母所有端粒长度的方法，包括以下步骤：
（1）取酵母细胞的基因组DNA，加入1微升2U限制性内切酶MmeI在50微升体系中消化过夜，得到酵母所有32个端粒的最小末端限制性片段；
（2）置于含有1XTBE缓冲液的0.9%琼脂糖凝胶中电泳分离处理；
（3）电泳完成后，将凝胶浸没于0.25M盐酸中缓慢摇动30min进行脱嘌呤处理，倒去0.25M盐酸后用水洗2次，加入含有1.5 M NaCl和0.5 M NaOH的强碱变性缓冲液，使凝胶浸没缓慢摇动处理30min，倒去强碱变性缓冲液后水洗2次，再加入含有3M NaCl和0.5M Tris-HCl pH7.0的中和缓冲液，使凝胶浸没缓慢摇动处理30min；
（4）利用虹吸法将经步骤（3）处理后的凝胶上的DNA用含有0.3 M NaCl和0.03 M柠檬酸钠的2XSSC缓冲液过夜转移至带正电荷的尼龙膜上，在上述带有DNA的尼龙膜的正面利用紫
外交联仪进行能量交联200 mJ/cm2 ，10min；
（5）利用试剂盒标记长度为250碱基对的TG1-3序列探针，做DNA印记分析，检测端粒长度。
[0006]所述的一种同时检测酵母所有端粒长度的方法，其特征在于所述步骤（1）中50微升体系包含5微摩尔终浓度SAM。
[0007]所述的一种同时检测酵母所有端粒长度的方法，其特征在于所述步骤（2）中凝胶的长´宽´高为：18.5cm´15 cm ´1 cm，电泳分离处理条件为：恒压90V，2.6V/cm，30min，再恒压120 V，3.5V/cm，3-3.5h，所述每厘米为正负电极间的距离。
[0008]所述的一种同时检测酵母所有端粒长度的方法，其特征在于所述步骤（5）中标记TG1-3序列探针的方法为：模板量为1微克，加去离子水体积调整为16微升，98℃变性处理5min立即置于冰水浴中2min使模板DNA处于单链状态，1000rpm离心2min后加入试剂盒中标记试剂4微升，37℃温育20小时后，加入2微升0.2 M EDTA在65℃处理10min终止反应后，保存于-20℃备用。
[0009]所述的一种同时检测酵母所有端粒长度的方法，其特征在于所述步骤（5）中DNA印记分析方法为：将紫外交联后的膜DNA面朝上，置于杂交管中，杂交炉缓慢转动，60℃进行预杂交处理1-2小时，探针首次使用于98℃处理10min，立即置于冰水浴中10min，倒去预杂交液，加入经过变性冷却的探针使得探针终浓度为25 ng/ml，缓慢转动60℃杂交过夜，期间封闭和结合碱性磷酸酶标记二抗的步骤参考试剂盒条件进行，最后采用终浓度为1%SDS的40 mMpH7.2磷酸缓冲液洗膜2次，每次20min，恒定转
速80rpm/min。
[0010]本发明的有益效果：本发明方法使用限制性内切酶MmeI切割基因组DNA，不仅可以切割17个Y'元件端粒，还可以切割剩余的15个X元件的端粒，检测获得全部32个端粒的长度，比现有技术检测17个端粒长度更加全面，有利于后续研究和相关技术开发应用。
附图说明
[0011]图1为限制性内切酶MmeI的识别和切割位点；
图2为利用限制性内切酶MmeI切割并检测的所有32个端粒的长度，与XhoI和PstI法比较；
图3为限制性内切酶MmeI消化基因组DNA检测野生型细胞的所有32个端粒长度；
图4为限制性内切酶MmeI消化基因组DNA检测端粒缩短（YKU80基因敲除）和端粒延长（RIF1基因敲除）。
具体实施方式
[0012]以下将结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
[0013]实施例1：
我们从酿酒酵母（S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e）数据库（S G D，h t t p:// /）中获得了所有32个端粒和亚端粒的DNA序列。经过详细分析靠近末端TG1-3序列的限制性内切酶酶切位点，最终发现限制性内切酶MmeI能够在32个端粒的每一个端粒靠近TG1-3序列进行切割并产生比现在通用的XhoI和PstI法更小的末端限制性片段。分析结果如表1所示，MmeI可在两组端粒的亚端粒区靠近TG1-3平均约200个碱基对和400个
碱基对的位置进行切割。
[0014]表1限制性内切酶Mme I, Xho I和Pst I切割产生最小TRF的比较
我们从酿酒酵母数据库（SGD）获得了酿酒酵母16条染体的DNA序列。经过分析比较，总结出限制性内切酶MmeI，XhoI和PstI在基因组范围的切割位点数量，结果如表2所示。
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