(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810442572.3
(22)申请日 2018.05.10
(71)申请人 中国国际医药卫生有限公司
地址 100029 北京市朝阳区惠新东街4号富
盛大厦一座2708
申请人 南京红杉生物科技有限公司
(72)发明人 吴法昊 杨文 李钢 史宏伟
高仰哲 刘丽莉 袁志法
(74)专利代理机构 中国国际贸易促进委员会专
利商标事务所 11038
代理人 杜仙 苏红梅
(51)Int.Cl.
C07D 233/56(2006.01)
C07D 295/182(2006.01)
C12N 9/10(2006.01)
C12N 15/54(2006.01)C12P 13/00(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本申请提供一种生物催化合成西他列汀及
其中间体的方法，具体地，本申请提供了式I和式
够催化所述式I化合物生成式II化合物的多肽，
编码所述多肽的核酸，含有所述核酸的载体和细
胞。此外，本发明还提供了使用所述多肽和式I化
合物来生产式II化合物以及西他列汀的方法，以
及制备所述多肽的方法。权利要求书3页 说明书17页序列表8页 附图4页CN 108586346 A 2018.09.28
C N 108586346
A
1.式I所示化合物、或其药学上可接受的盐，
其中，R1和R2各自独立地选自氢、C1-6烷基、3-8元环烷基、3-8元杂环烷基、6-10元芳基和5-10元杂芳基；或者，R1和R2与相连的N原子形成4-7元杂环；
优选地，R1和R2各自独立地选自氢、C1-4烷基、3-6元环烷基、3-6元杂环烷基、6-10元芳基和5-6元杂芳基；或者，R1和R2与相连的N原子形成5-6元脂杂环或5-6元芳杂环； 优选地，R1和R2各自独立地选自氢和C1-4烷基；或者，R1和R2与相连的N原子形成5-6元脂杂环或5-6元芳杂环；
优选地，R1和R2与相连的N原子形成吡咯环、咪唑环、吡咯烷环、噁唑烷环、异噁唑烷环、环、吗啉环或哌嗪环。
2.式II所示化合物、或其药学上可接受的盐，
其中，R1和R2各自独立地选自氢、C1-6烷基、3-8元环烷基、3-8元杂环烷基、6-10元芳基和5-10元杂芳基；或者，R1和R2与相连的N原子形成4-7元杂环；
优选地，R1和R2各自独立地选自氢、C1-4烷基、3-6元环烷基、3-6元杂环烷基、6-10元芳基和5-6元杂芳基；或者，R1和R2与相连的N原子形成5-6元脂杂环或5-6元芳杂环；
优选地，R1和R2各自独立地选自氢和C1-4烷基；或者，R1和R2与相连的N原子形成5-6元脂杂环或5-6元芳杂环；
优选地，R1和R2与相连的N原子形成吡咯环、咪唑环、吡咯烷环、噁唑烷环、异噁唑烷环、环、吗啉环或哌嗪环。
3.一种多肽，其具有催化羰基向氨基转化的活性，并且具有选自下列的氨基酸序列：
1)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
2)与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性，优选至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的氨基酸序列；和
(3)与SEQ ID NO:1相异在于一个或几个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)氨基酸残基的置换、缺失或添加的氨基酸序列。
4.一种分离的核酸，其编码权利要求3的多肽。
5.包含权利要求4的分离的核酸的载体。
6.包含权利要求4的分离的核酸和/或权利要求5的载体的细胞，其中，所述分离的核酸相对于所述细胞而言是异源的或外源的。
7.一种组合物，其含有权利要求3的多肽。
8.一种生产式II所示化合物、或其药学上可接受的盐的方法，其包括使用权利要求3的多肽或权利要求7的组合物将式I化合物转化为式II化合物的步骤，其中，所述式I化合物、或其药学上可接受的盐如权利要求1中所定义；
所述式II化合物、或其药学上可接受的盐如权利要求2中所定义；
优选地，所述方法包括，(a)将所述式I化合物与氨基供体在所述多肽或组合物和氨基传递体存在的条件下发生反应；(b)收集步骤(a)产生的式II化合物； 进一步优选地，在步骤(a)中，V多肽或组合物：m式I化合物＝(4-5)：1；在步骤(a)中，所述氨基供体选自C1-6烷胺(例如异丙胺)和无机铵盐(例如甲酸铵、氯化铵或硫酸铵)，优选为异丙胺；优选地，式I化合物与所述氨基供体的摩尔比为1：(1-3)(例如1：(1.2-3))；优选地，在步骤(a)中，所述氨基传递体选自磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺；优选地，在步骤(a)中，所述反应在水相中进行，进一步优选地将所述式I化合物用醇类溶剂(例如甲醇、乙醇或异丙醇)溶解加入反应体系中(例如将所述式I化合物用醇类溶剂溶解成1-5Kg/L的溶液，例如1-4Kg/L，例如3-4Kg/L)；优选地，反应体系中式I化合物的浓度为100g/L-250g/L；优选地，在步骤(a)中，所述反应在30-50℃(优选45℃)进行；优选地，在步骤(a)中，反应体系pH值为7.0-9.0(优选8.0-9.0)，进一步优选地，用有机胺(例如异丙胺、丁胺或戊胺)调节反应体系pH值；优选地，在步骤(a)中，反应体系与空气接触；
进一步优选地，在步骤(b)中，通过如下方法收集式II化合物：将步骤(a)中所得产物用有机溶剂萃取、浓缩，进一步优选地，所述有机溶剂选自二氯甲烷、乙酸乙酯和乙酸异丙酯。
9.一种西他列汀或其盐的合成方法，其包括以下步骤：
第一步：式I化合物经不对称催化反应生成式II化合物；
第二步：式II化合物在碱的存在下水解得到式III化合物；
第三步：将式III化合物中的氨基进行保护得到式IV化合物；
第四步：式IV化合物与式V化合物进行缩合反应并脱除氨基保护基生成西他列汀或其盐；
其中，-Pg表示氨基保护基，例如为Boc、Cbz、Fmoc或Alloc；
R1和R2的定义如权利要求1中所定义。
10.权利要求9的方法，其特征在于下述的一项或多项：
(1)所述式I化合物通过如下方法制得：
a)化合物1和化合物2在非质子溶剂中(例如在EtOAc、DCM、DMF、DMA或DMSO；优选为DMA)，有机碱存在下(例如甲胺、三乙胺、正丁胺或叔丁胺；优选为三乙胺)，室温或加热(例如20-50℃；优选35℃)反应生成化合物3；优选地，化合物1和化合物2的摩尔比为1：(1-5)；优选地，在所述室温或加热反应后，还包括加入酸化试剂的步骤，进一步优选地，所述酸化试剂选自盐酸、二氯亚砜和特戊酰氯，优选为盐酸；优选地，所述酸化试剂的加入量为使得反应体系pH呈酸性；
b)化合物3与NHR1R2在非醇类溶剂中(例如苯、甲苯或四氢化萘)，经无机碱催化(例如氢氧化钠或氢氧化钾)，加热(例如40-120℃；例如100-105℃)生成式I化合物；优选地，化合物3与NHR1R2的摩尔比为1：(2-4)；
(1)在第一步中，所述不对称催化反应为不对称还原胺化反应，优选地，催化所述还原胺化的催化剂选自手性铑、钯和钌的金属配合物催化剂；
(2)在第一步中，不对称催化反应所用催化剂为权利要求3所述的多肽或权利要求7的组合物；优选地，所述不对称催化反应条件如权利要求8中所定义；
(3)在第二步中，所述碱为无机碱，例如氢氧化钠或氢氧化钾；
(6)在第三步中，用Boc酸酐与式III化合物在碱的存在下反应进行氨基保护；优选地，式III化合物、Boc酸酐与碱的摩尔比为1：(1.5-3)：(2-4)；优选地，所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾还和三乙胺；
(7)在第四步中，将式IV化合物经其活性中间体与式V化合物发生缩合反应；优选地，所述式IV化合物的活性中间体为其酰氯、酸酐或酰胺形式；优选地，式IV化合物与式V化合物的摩尔比为1：(1-1.2)；优选地，所述缩合反应在非醇类溶剂中进行(例如乙酸乙酯，二氯甲烷或)；优选地，所述缩合反应在室温条件下进行(例如25℃)；优选地，所述缩合反应在碱的存在下进行，进一步优选地，所述碱为三乙胺。
11.一种制备权利要求3的多肽的方法，其包括，(a)培养宿主细胞，所述宿主细胞包含并表达编码所述多肽的核酸；和，(b)收集所述细胞表达的所述多肽。
12.权利要求1或2的化合物、或其药学上可接受的盐、权利要求3的多肽或权利要求7的组合物在制备西他列汀或其中间体中的用途。
一种生物催化合成西他列汀及其中间体的方法技术领域
[0001]本发明涉及分子生物学技术领域，特别是西他列汀的生物合成领域。具体而言，本发明提供了式I和式II所示化合物、或其药学上可接受的盐，一种能够催化所述式I化合物生成式II化合物的多肽，编码所述多肽的核酸，含有所述核酸的载体和细胞。此外，本发明还提供了使用所述多肽和式I化合物来生产式II化合物以及西他列汀的方法，以及制备所述多肽的方法。
背景技术
[0002]西他列汀(Sitagliptin，结构如下所示)，化学名为(3R)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮，为一种口服降糖药。其可以单独应用也可以与其他口服降糖药组成复方药物(如二甲双胍或噻唑烷二酮)来2型糖尿病。相比其他口服类降糖药，西他列汀在控制血液中葡萄糖含量时副作用更少(更低几率导致低血糖和体重增加)。
[0003]
[0004]西他列汀结构中含有一个手性中心，该手性中心的构建是合成西他列汀最为关键的一步。现有研究中关于该手性中心的构建方法主要有以下几种：(1)生成烯胺底物后利用手性催化剂进行不对称氢化；(2)以手性氨化合物为原料；(3)手性拆分；(4)以β-羰基酯类化合物为底物，经转氨酶催化制备。然而，上述方法中存在诸如，成本昂贵、手性纯度低、后处理困难和收率低等。
[0005]近年来，由于生物酶法具有高选择性及环境友好的优势，逐步成为合成手性医药化学品及其中间体的优选方案。
[0006]转氨酶(transaminase)又称氨基转移酶，是不对称合成高光学纯手性氨的关键酶，在动植物和微生物中广泛分布。其中，许多ω-转氨酶基因己被克隆，部分氨基转移酶的基因已在不同的宿主(大肠杆菌、毕赤酵母等)中表达，获得了酶活和选择性都较高的基因工程菌。ω-转氨酶也被用于生产西他列汀。然而，对于R -型选择性转氨的天然ω-转氨酶报道很少，且这些ω-转氨酶催化的底物谱较窄，往往是为特定反应筛选的最适生物催化剂。
[0007]因此，寻构建西他列汀手性中心的方法，尤其是生物酶法对于解决该药物合成中所面临的问题提供了新的选择。发明内容
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