一种保持病毒颗粒完整的灭活保存液和检测试管的制作方法

1.本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种保持病毒颗粒完整的灭活保存液和检测试管。

背景技术：

2.严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)，世界卫生组织(who)命名的2019 年冠状病毒(corona virus disease 2019,coivd-19)是导致呼吸道疾病的病原体。这种新发传染病传播迅速、传染性强、人普遍易感，病毒防控刻不容缓。
3.诊断covid-19感染最常用的是荧光定量逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)这一方便可靠的检测技术。核酸检测的质量控制涉及多个方面，样本取材、保存运输、检测试剂、结果判读等。样本的保存是影响检测效果的一个关键但又容易被忽视的环节。在临床检测中，病毒样本保存不当会出现各种问题。rna病毒的外壳容易破裂，可能会释放出核酸，导致核酸降解，不及时灭活病毒，医护人员的感染风险增加。
4.现有一次性使用病毒采样管主要分为含有非灭活型病毒保存液，以及后续为避免采集样本和保存运输环节中的感染性，使用灭活型病毒保存液，这些灭活型病毒保存液都利用了胍盐(cn113186251a、cn113444772a、cn113736755a、cn113684253a、cn114717292a 等)，使得蛋白质发生变性，变性裂解病毒，达到灭活病毒、释放核酸到保存液中待检。病毒的蛋白外壳遭到破坏，不利于后续有关病毒形态和结构的研究。
5.中国发明专利申请(cn108823286a)公开了血液游离dna的保护剂为一种组合物，该组合物包括咪唑烷基脲、乙二胺四乙酸三钾二水合物和甘氨酸。该专利公开了咪唑烷基脲在保护剂中起到维持细胞稳定，防止细胞破裂释放dna的作用。同样，在中国发明专利 (cn103789202a、cn112322615a等)咪唑烷基脲都是起到保护细胞不破裂的作用。但是在这些文献中都没有公开在灭活病毒，而又能够保持病毒颗粒完整的作用。

技术实现要素：

6.为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种不含胍盐的能灭活病毒样本的保存液。此保存液能够在常温条件下保护病毒颗粒的完整性，避免rna释放、降解和污染，提高后续检测的准确率。
7.为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：
8.一种保持病毒颗粒完整的灭活保存液，该保存液按质量百分比计包括以下的组分：
[0009][0010]
所述的蛋白质变性剂选自对羟基苯甲酸乙酯、重氮烷基脲、咪唑烷基脲中的一种或多种混合。
[0011]
作为优选，该保存液按质量百分比计包括以下的组分：
[0012][0013]
作为优选，所述的蛋白质变性剂选自咪唑烷基脲。
[0014]
作为优选，所述的稳定剂选自l-谷氨酰胺、甘氨酸、glutagro中的一种或多种混合。作为再优选，所述的稳定剂选自l-谷氨酰胺和甘氨酸的组合。
[0015]
作为优选，所述的自由基去除剂选自还原型谷胱甘肽、维生素c、n-乙酰半胱氨酸中的一种或多种混合。所述的自由基去除剂选自还原型谷胱甘肽。
[0016]
作为再优选，钙镁离子螯合剂选自edta、edta二钠盐、edta三钾盐中的一种或多种混合。作为再优选，钙镁离子螯合剂选自edta三钾盐。
[0017]
进一步，本发明还公开了一种病毒检测试管，该试管内包括所述的灭活保存液。
[0018]
本发明由于采用了上述的技术方案，pbs缓冲剂使得保存液ph范围在6.50-7.50之间，为整个病毒提供稳定的ph环境。蛋白质变性剂使得病毒外层由脂质和糖蛋白构成包膜失去感染能力。稳定剂在病毒蛋白质衣壳外形成保护膜，使得蛋白质不易被分解。还自由基去除剂清除代谢过程中产生的自由基，维持氧化还原环境，防止保存过程中病毒破裂。钙镁离子螯合剂可以螯合核酸酶发挥作用所依赖的二价阳离子(ca
2+
与mg
2+
)，以至核酸酶活性被阻断。该保存液有效防止病毒破裂而释放出核酸被周围环境中的核酸酶所降解，极大程度提高病毒样本在常温下的储存时长。
附图说明
[0019]
图1为细胞感染对照组电子显微镜照片。
[0020]
图2为实施例1-5细胞感染实验结果图。
[0021]
图3为对比例1-5细胞感染实验结果图。
[0022]
图4为实施例1-5病毒蛋白的sds-page电泳图。
[0023]
图5为对比例1-5病毒蛋白的sds-page电泳图。
具体实施方式
[0024]
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现详细说明本发明的具体实施方式。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0025]
本发明实施例中若无特别说明，所用试剂及耗材均为市售商品。
[0026]
本发明的实施例和对比例的配方如下：
[0027][0028]
一、保存液灭活能力试验
[0029]
将慢病毒gv115在室温下悬浮在不同实例和对比例的保存溶液中15分钟，并以moi＝10 感染hek293t细胞。对照组使用pbs。增强的绿荧光蛋白(egfp)荧光。感染后48小时，通过电子显微镜检查确定显微镜放大率100
×
。图1为对照组电子显微镜照片，图2为实施例1-5细胞感染实验结果图，图3为对比例1-5细胞感染实验结果图，从图1、图2、图3可以看出本技术的保存液灭活能力。
[0030]
二、颗粒完整性试验
[0031]
将慢病毒gv115蛋白储存在不同实例和对比例的保存溶液中7天。病毒蛋白颗粒完整性如图4、图5为病毒蛋白的sds-page电泳图。从图4、图5可以看出，本发明采用了实施例1-5 的技术方案相对于对比例1-5病毒蛋白颗粒完整显著提高。
[0032]
三、核酸保存效果试验
[0033]
将慢病毒在不同实例和对比例的保存溶液中保存7天的核酸检测结果。本发明的实施例和对比例荧光pcr的ct值如下：
[0034] 保存3天保存7天实施例123.2123.89实施例223.1223.68实施例323.0323.34实施例424.5226.35
实施例525.3626.98对比例123.1530.39对比例223.6727.65对比例325.5931.52对比例423.3126.03对比例523.6327.36
[0035]
以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。

技术特征：

1.一种保持病毒颗粒完整的灭活保存液，其特征在于，该保存液按质量百分比计包括以下的组分：缓冲剂
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20-100mm蛋白质变性剂
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1.00wt%-3.00wt%稳定剂
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0.20wt%-2.00wt%自由基去除剂
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0.50wt%-2.00wt%钙镁离子螯合剂
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0.10wt%-0.50wt%；所述的蛋白质变性剂选自对羟基苯甲酸乙酯、重氮烷基脲、咪唑烷基脲中的一种或多种混合。2.根据权利要求1所述的一种保持病毒颗粒完整的灭活保存液，其特征在于，该保存液按质量百分比计包括以下的组分：缓冲剂
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40-80mm蛋白质变性剂
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1.50wt%-2.50wt%稳定剂
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0.50wt%-1.50wt%自由基去除剂
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0.60wt%-1.50wt%钙镁离子螯合剂
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0.15wt%-0.30wt%。3.根据权利要求1所述的一种保持病毒颗粒完整的灭活保存液，其特征在于，所述的蛋白质变性剂选自咪唑烷基脲。4.根据权利要求1所述的一种保持病毒颗粒完整的灭活保存液，其特征在于，所述的稳定剂选自l-谷氨酰胺、甘氨酸、glutagro中的一种或多种混合。5.根据权利要求1所述的一种保持病毒颗粒完整的灭活保存液，其特征在于，所述的稳定剂选自l-谷氨酰胺和甘氨酸的组合。6.根据权利要求1所述的一种保持病毒颗粒完整的灭活保存液，其特征在于，所述的自由基去除剂选自还原型谷胱甘肽、维生素c、n-乙酰半胱氨酸中的一种或多种混合。7.根据权利要求1所述的一种保持病毒颗粒完整的灭活保存液，其特征在于，所述的自由基去除剂选自还原型谷胱甘肽。8.根据权利要求1所述的一种保持病毒颗粒完整的灭活保存液，其特征在于，钙镁离子螯合剂选自edta、edta二钠盐、edta三钾盐中的一种或多种混合。9.根据权利要求1所述的一种保持病毒颗粒完整的灭活保存液，其特征在于，钙镁离子螯合剂选自edta三钾盐。10.一种病毒检测试管，其特征在于，该试管内包括权利要求1-9所述的灭活保存液。

技术总结

本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种保持病毒颗粒完整的灭活保存液和检测试管。一种保持病毒颗粒完整的灭活保存液，该保存液按质量百分比计包括以下的组分：缓冲剂20-100mM，蛋白质变性剂1.00wt%-3.00wt%，稳定剂0.20wt%-2.00wt%，自由基去除剂0.50wt%-2.00wt%，钙镁离子螯合剂0.10wt%-0.50wt%；所述的蛋白质变性剂选自对羟基苯甲酸乙酯、重氮烷基脲、咪唑烷基脲中的一种或多种混合。此保存液能够在常温条件下保护病毒颗粒的完整性，避免RNA释放、降解和污染，提高后续检测的准确率。率。率。