[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101601860A [43]公开日2009年12月16日
[21]申请号200810110903.X [22]申请日2008.06.13
[21]申请号200810110903.X
[71]申请人中国科学院过程工程研究所
地址100190北京市海淀区中关村北二条1号
[72]发明人马光辉 卫强 梁争论 邱少辉 苏志国
李河民 安康 林小军 范蓓 田瑞 魏炜 [51]Int.CI.A61K 39/39 (2006.01)A61K 39/29 (2006.01)A61K 39/205 (2006.01)
A61P 1/16 (2006.01)
A61P 31/20 (2006.01)A61P 31/14 (2006.01)
权利要求书 2 页 说明书 16 页 附图 5 页
[54]发明名称
[57]摘要
本发明公开了一种预防和用的疫苗，其中
原与未吸附的抗原(游离抗原)两种形式，所述的颗
粒的平均粒径为0.1～20μm，所述的抗原结构明确，
具有抗病毒作用，优选为乙肝表面抗原和人用狂犬
病疫苗抗原，通过以下方法制备：将聚合物颗粒与
抗原溶液进行混合，通过聚合物颗粒与抗原溶液的
吸附作用制得的悬液即为疫苗产品。在所得的悬液
状疫苗中加入冻干保护剂，可制备疫苗的冻干粉剂。
泌抗体或细胞因子等来清除或控制病毒，而且本发
明疫苗的制备工艺简单，制备过程温和。
200810110903.X权 利 要 求 书第1/2页 1、一种疫苗，其中的抗原组成为吸附于可生物降解聚合物颗粒上的抗原与未吸附的抗原(游离抗原)两种形式，所述的颗粒的平均粒径为0.1～20μm，所述的抗原结构明确，具有抗病毒作用。
2、如权利要求1所述的疫苗，通过以下方法制备：将聚合物颗粒与抗原溶液以重量比10～5000进行混合，通过聚合物颗粒与抗原溶液的吸附作用制得的悬液即为疫苗产品。
3、如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的吸附作用是通过抗原与聚合物颗粒在盐溶液中以疏水作用来实现。
4、如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的吸附作用是通过抗原与聚合物颗粒以静电作用来实现。
5、如权利要求1所述的疫苗，所述的抗原为乙肝表面抗原，优选为通过重组汉逊酵母表达体系得到的乙肝表面抗原。
6、如权利要求1所述的疫苗，所述的抗原为人用狂犬病疫苗抗原。
7、如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗产品中的抗原总浓度根据需要可调节为1～50μg/0.2～1ml，聚合物颗粒的浓度为0.5～5mg/0.2～1ml。
8、如权利要求1-7中任一种所述的疫苗，其特征在于，在抗原与聚合物颗粒吸附前，所述的抗原浓度为5μg～1000μg/ml，优选为10μg～500μg/ml，更优选的抗原浓度为20μg～200μg/ml。
9、如权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所制备得到的疫苗产品中，吸附于聚合物颗粒上的抗原与吸附前的抗原总量的重量比为在1％～30％，优选为3％～25％，更优选的是5～20％。
10、如权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所制备得到的疫苗产品中，吸附于聚合物颗粒上的抗原与吸附前的抗原总量的重量比为在5％～75％，优选为5％～50％，更优选的是10～30％。
11、如权利要求1-7中任一种所述的疫苗，其特征在于，所述的聚合物的材料选自聚乳酸、
200810110903.X权 利 要 求 书 第2/2页聚羟基乙酸及其共聚物。
12、如权利要求1-7所述的疫苗，其特征在于，所述的聚合物颗粒与抗原的重量比为优选为50～1000，更优选的重量比为100～500。
13、如权利要求1-7所述的疫苗，其特征在于，所述的聚合物颗粒的粒径大小为0.15～5μm，优选为0.25～1.5μm。
14、如权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述的盐为氯化钠，其浓度为0.3～5mg/ml，优选的浓度为0.5～1.5mg/ml。
15、如权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述的聚合物颗粒在溶液中p H值为5～8时表面带有正电荷。
16、如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的包含有聚合物颗粒为空白颗粒，未包埋有抗原。
17、如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的包含有聚合物颗粒中包埋有抗原，其中包埋的抗原为聚合物的重量的1～3％。
18、如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，在所制备得到的包含有聚合物颗粒和抗原溶液的疫苗产品中加入冻干保护剂，制备得到疫苗的冻干制剂。
19、如权利要求17所述的疫苗，其特征在于，所述的冻干保护剂为蔗糖，其浓度为5～10 mg/ml。
20、上述权利要求中任意一种疫苗，在选用乙肝表面抗原时在制备乙型肝炎药物中的应用。
21、上述权利要求中任意一种疫苗，在选用人用狂犬病疫苗抗原时在制备预防狂犬病药物中的应用。
200810110903.X说 明 书第1/16页
疫苗
技术领域
本发明涉及一种疫苗，更具体地说，涉及一种以可生物降解聚合物颗粒作为佐剂的疫苗。
背景技术
乙型肝炎(Hepatitis B)是由乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)引起的全球性传染病，具有感染性强、携带率高和流行面广等特点，严重危害着人类健康。根据世界卫生组织(W H O)统计，迄今为止全球有20亿人感染过乙型肝炎病毒，其中约3.5亿人为慢性乙肝感染者，我国乙肝病毒总感染率60％，携带率约为10％(即约1.3亿)，属乙型肝炎高流行区。对于乙型肝炎尚无有效的药物，目前抗病毒上常用的干扰素和拉米呋啶，虽然能迅速抑制病毒复制，但是停药后易反跳，也易导致变异株的产生。近年来，由于基因重组技术的发展与应用、免疫学理论和技术的新进展等使得利用疫苗来慢性H B V感染已成为研究的热点。
在慢性H B V感染者体内由于免疫耐受的存在，特异性T细胞反应低下。传统观点认为，性疫苗的目的是发挥清除病毒作用的细胞免疫反应主要特异性细胞毒性T淋巴细胞(C T L)的溶细胞作用，即C T L通过释放穿孔素、颗粒酶杀伤感染的肝细胞或通过F a s介导的途径来诱导感染的肝细胞凋亡。但是近年来研究显示，T h1类细胞和C T L分泌的细胞因子参与的非溶细胞机制在抗病毒免疫中起着主导作用。I F N-γ、T N F-a等细胞因子都可以通过非细胞病变的方式来抑制病毒复制，甚至清除病毒D N A。尤其是I F N-γ在多种动物模型中的研究表明其具有抑制H B V复制中间产物和H B V特异m R N A的作用，在病毒清除中发挥着重要作用，通过激发自身的细胞免疫应答促进以I F N-γ为主的细胞因子的分泌来清除病毒。检测这些细胞因子的分泌水平可以衡量抗原特异性T细胞的活化程度，从而对疫苗的免疫效果进行
准确的评价。
目前研究中的性乙肝疫苗主要分为蛋白疫苗、免疫复合物型疫苗、多肽疫苗、D N A 疫苗或佐剂性疫苗等。疫苗设计为考虑如何有效的激发或增强特异性多表位的细胞免疫应答，达到清除体内病毒的目的。以聚合物微球作为疫苗佐剂，能够增强抗原被树突状细胞吞噬的能力，增强抗原诱导的细胞免疫。中国专利号为011118448.5公开了一种以聚乳酸-聚乙二醇为佐剂的乙肝疫苗，将抗原包埋于该材料制备的微球中，注射免疫小鼠，25天后能够显著增强T细胞的功能，提高机体内抗原的特异性诱导的细胞免疫。但是作为一种乙型肝炎的药物来说，需要在机体内迅速诱导细胞免疫应答，而且抗原在微包埋过程中，不可能
200810110903.X说 明 书 第2/16页完全被包埋于微球中，抗原会有相当量的损失，制备过程中也涉及的剪切力及有机溶剂也会影响抗原的生物活性，因而该方法从实际应用的角度来看不大可行。
此外，狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的世界性人兽共患性疾病，它能侵蚀人、家畜和野生动物的中枢神经系统。人类感染狂犬病毒后，一旦发病，死亡率为100％。我国狂犬病发病率和死亡率仅次于印度，并且近年来呈不断上升趋势，因此对于狂犬病的预防也是刻不容缓。目前对狂犬病尚无有效方法，接种人狂犬病疫苗后，可刺激机体产生抗狂犬病病毒免疫力，用于预防狂犬病。狂犬病疫苗可采用免疫5针用于暴露后免疫，也可接种3针暴露前免疫，按是否添加佐剂可分为佐剂疫苗和无佐剂疫苗，使
用A l(O H)3佐剂能够增强疫苗的免疫原性而提高免疫效果，有利于抗体持续产生。但是狂犬病是致死性疾病，早期抗体产生在防止发病中起到了重要的作用，注射狂犬病疫苗后抗体产生的越早越好，因此需要一种新型佐剂疫苗，能快速在机体内迅速诱导抗原的特异性的免疫应答。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术存在的不足，提供一种以可生物降解聚合物颗粒作为佐剂的疫苗，能够在机体内迅速诱导抗原的特异性诱导的免疫应答，诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，分泌抗体或细胞因子等来清除或控制疾病。
本发明提供的疫苗包含吸附于聚合物颗粒上的抗原与未吸附的抗原(游离抗原)两种形式，聚合物颗粒表面吸附有一定量的抗原溶液，增强了抗原被抗原提呈细胞吞噬的能力，从而达到增强免疫效果的作用。
在本发明中，所提供的疫苗包含有平均粒径为0.1～2μm的可生物降解的聚合物颗粒和乙肝表面抗原溶液，其中聚合物颗粒与抗原的重量比为10～5000，通过聚合物颗粒与抗原溶液的吸附作用制得的悬液即为疫苗产品。
在本发明中，在抗原与聚合物颗粒混合前，比较优选的抗原浓度为5μg～100μg/m l，优选的抗原浓度为10μg～50μg/m l，更优选的抗原浓度为20μg～20μg/m l，还可以是30μg～100μg/ml。
在本发明中，所述的聚合物颗粒与抗原溶液的吸附作用使得所得疫苗产品的悬液中包含有两种形式的抗原：吸附于聚合物颗粒上的抗原与未吸附的抗原(游离抗原)，两者的比例依赖于具体选择的吸附方式，通过控制制备过程的工艺条件，就能制备得到满足要求的疫苗产品。
在本发明中，将聚合物颗粒加入至与抗原溶液中，所述的吸附作用可通过在盐溶液存在
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