(10)申请公布号 (43)申请公布日 2013.06.05C N 103131657 A (21)申请号 201310077644.6
(22)申请日 2013.03.12
CGMCC No.6692 2012.10.22
C12N 1/20(2006.01)
A01N 63/02(2006.01)
A01N 63/00(2006.01)A01P 3/00(2006.01)C12R 1/125(2006.01)
(71)申请人牛赡光
地址250014 山东省济南市历下区文化东路
42号
申请人朱卫东
(72)发明人牛赡光 朱卫东 王清海 张淑静
段春华 刘幸红
(74)专利代理机构济南诚智商标专利事务所有
限公司 37105
代理人韩百翠
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一株枯草芽孢杆菌及其生物
防治制剂和应用，属于生物防治植物病害领域。
该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）
XLBS-01，保藏号为CGMCC No.6692。实验表明，本
发明的枯草芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产孢
量大、作用谱广、抗逆性强，在植物根际能够快速
大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该
枯草芽孢杆菌制备的生物防治制剂，不仅能够高
效的防治植物土传病害，还能有效提高作物产量，
是一种极具应用前景的生物防治制剂。该微生物
制剂可以作为生物农药或生物肥料，防治多种土
传植物病害，也可以防治作物叶部病害，包括辣椒
病、黄瓜靶斑病、葡萄霜霉病、月季白粉病等。(83)生物保藏信息
(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书9页序列表3页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书1页 说明书9页序列表3页(10)申请公布号CN 103131657 A
*CN103131657A*
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1.枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）菌株XLBS-01，所述菌株的保藏号为CGMCC No.6692。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）菌株XLBS-01在防治植物土传病害中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征是，所述植物土传病害为辣椒病、黄瓜靶斑病、葡萄霜霉病或者月季白粉病。
4.一种生物防治制剂，包括权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）菌株XLBS-01。
5.一种制备权利要求4所述的生物防治制剂的方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）制备所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）菌株XLBS-01的种子液；
（2）将步骤（1）制备的种子液接种到固体培养基中，28～30℃下恒温培养；
（3）将步骤（2）培养的培养物加入其质量15倍的无菌水混合，过滤，将滤液接种至发酵培养基，在室温28～30℃、相对湿度85%以上的发酵室中进行发酵培养。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征是，
（1）将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）菌株XLBS-01的孢子移植到LB 液体培养基，28～30℃摇床振荡培养3～5天得到种子液；所述LB 液体培养基为：胰蛋白胨10g ，酵母提取物5g ，氯化钠10g ，蒸馏水1000mL ，pH 调至7.0-7.2；
（2）将步骤（1）制备的种子液按质量比10%的比例接种到固体培养基中，28～30℃下振荡培养3～5天；
（3）将步骤（2）培养的培养物加入其质量15倍的无菌水混合，过滤，将滤液按体积比1：6的比例接种至发酵培养基，室温28～30℃、相对湿度85%以上的发酵室中发酵培养8～9天；
所述步骤（2）中的固体培养基由固料和无机盐组成，所述固料和无机盐的质量比为98.7：0.3；所述固料由稻壳、玉米粉、豆粕粉和麸皮组成，按质量比计稻壳：玉米粉：豆粕粉：麸皮=55：25：15：5；所述无机盐按质量百分比计，包含20%磷酸二氢钾，5%硫酸镁，10%硫酸铵，65%轻质碳酸钙；所述步骤（3）中的发酵培养基同步骤（2）的固体培养基。
7.权利要求4所述的生物防治制剂在防治植物土传病害中的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其特征是，所述植物土传病害为辣椒病、黄瓜靶斑病、葡萄霜霉病或者月季白粉病。
9.一种植物土传病害的生物防治方法，其特征是，向具有土传病害的植物施用权利要求1的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）菌株XLBS-01或者权利要求4的生物防治制剂。权 利 要 求 书CN 103131657 A
一株枯草芽孢杆菌及其生物防治制剂和应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物防治植物病害领域。具体而言，本发明涉及一株能够高效防治植物病害的枯草芽孢杆菌及其用途，以及采用该芽孢杆菌制备的生物防治制剂。
背景技术
[0002] 植物病害严重影响农林作物生长和产品品质，甚至引起作物死亡，造成重大的经济损失。对于植物病害的防治，常规采用的方法包括传统的化学防治、培育抗病品种以及生物防治。抗病品种培育周期长，抗性单一，而化学防治，极易造成农药残留，环境污染；同时，化学农药的长期使用，使得病原菌对其产生抗药性，导致防效下降甚至失败。利用有益微生物防治植物病害具有广阔的前景。
[0003] 芽孢杆菌是一种广泛分布于各种不同生活环境中的腐生细菌，是一好氧兼厌氧的产芽孢革兰氏阳性杆菌的总称，可以产生内生耐热抗逆性芽孢。芽孢不仅对热有抗逆性，还对紫外线、电磁辐射及一些化学药品有很强的抗逆性，它可以忍受各种不良环境。由于具有如此强的抗逆性，使得它有利于生防菌剂的生产和剂型加工，也利于其在环境中的存活、定殖与繁殖。由于它们生长快、营养简单、能够形成具有较强抗逆性能力的芽孢，在产品开发中较非芽孢杆菌有效活菌数量高、性能稳定等优势而备受瞩目。芽孢杆菌是植物病害生防微生物的重要组成部分，可用于防治多种植物病害。芽孢杆菌作为生防菌防治植物病害的机制主要有：抗生作用、营养竞争、空间竞争、重寄生作用以及诱导植物产生抗性等机制，其主要的生防机制是以产生拮抗物质抑制有害病菌的生长或杀死病原菌。这些物质绝大多数为肽类抗生素，具有高效、低残留、与环境友好等优点。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种用于高效防治多种植物病害的新的微生物——枯草芽孢杆菌菌株XLBS-01。本发明的枯草芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。
[0005] 本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：本发明所提供的菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株XLBS-01，是从土壤中分离获得的，已于2012年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所），保藏号为CGMCC No.6692。其具有以下生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB培养基上菌落形态为圆形或不规则形，乳白偏黄，表面粗糙起褶皱，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染呈阳性(以大肠杆菌为对照)。经芽孢染后观察芽孢呈椭圆形或柱状。[0006] 本发明枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株XLBS-01的培养方法或繁殖方法包括：
[0007] （1）普通培养保存采用LB培养基，配方为胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0-7.2；
[0008] （2）实验室液体培养采用LB液体培养基，配方为胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸
馏水1000mL，pH调至7.0-7.2；
[0009] （3）固体培养基配方：固料和无机盐溶液，所述固料和无机盐的比例为质量比98.7：0.3；所述固料由质量比为稻壳：玉米粉：豆粕粉：麸皮=55：25：15：5的组成；所述无机盐按质量百分比计，包含20%磷酸二氢钾，5%硫酸镁，10%硫酸铵，65%轻质碳酸钙；[0010] （4）大量发酵培养配方：同（3）中固体培养基配方
[0011] 本发明还提供一种用于防治植物土传病害和植物叶部病害的生物防治制剂，所述生物防治制剂包括所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株XLBS-01。
[0012] 并且，本发明还提供了一种用于防治植物土传病害的生物防治方法，所述生物防治方法包括向具有土传病害的植物施用上述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株XLBS-01或者上述生物防治制剂。
[0013] 本发明也提供了上述枯草芽孢杆菌菌或者上述生物防治制剂在防治植物土传病害中的用途。
[0014] 就上述生物防治制剂、生物防治方法以及用途而言，所述植物病害可以选自辣椒病、黄瓜靶斑病、葡萄霜霉病、月季白粉病中的一种或几种。
[0015] 本发明所述的生物防治制剂的制备方法包括以下步骤：
[0016] （1）制备所述枯草芽孢杆菌的种子液；
[0017] （2）将步骤（1）制备的种子液接种到固体培养基中，28～30℃下恒温培养；[0018] （3）将步骤（2）培养的培养物用无菌水按质量比1：15的比例混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28～30℃、相对湿度85%以上的发酵室中进行发酵培养。[0019] 在本发明的一个具体实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：
[0020] （1）将所述枯草芽孢杆菌的孢子移植到LB液体培养基，28～30℃摇床振荡培养3～5d得到种子液；
[0021] （2）将步骤（1）制备的种子液按质量比10%的比例接种到固体培养基中，28～30℃下振荡培养3～5d；
[0022] （3）将步骤（2）培养的培养物用无菌水按质量比1：15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1：6的比例接种至发酵培养基，室温28～30℃、相对湿度85%以上的发酵室中发酵培养8～9d；活性菌可达到30-40亿/克。
[0023] 其中，步骤（1）中的LB液体培养基，配方为胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0-7.2；
[0024] 步骤（2）中的固体培养基由固料和无机盐组成，所述固料和无机盐的质量比为98.7：0.3；所述
固料由质量比为稻壳：玉米粉：豆粕粉：麸皮=55：25：15：5的组成；所述无机盐按质量百分比计，包含20%磷酸二氢钾，5%硫酸镁，10%硫酸铵，65%轻质碳酸钙；[0025] 步骤（3）中的发酵培养基同步骤（2）的固体培养基。
[0026] 实验表明，本发明的枯草芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该枯草芽孢杆菌制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治植物土传病害，还能有效提高作物产量，是一种极具应用前景的生物防治制剂。该微生物制剂可以作为生物农药或生物肥料，防治多种土传植物病害，也可以防治作物叶部病害，包括辣椒病、黄瓜靶斑病、葡萄霜霉病、月季
白粉病等中的一种或几种。
具体实施方式
[0027] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0028] 实施例1
[0029] 1、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）XLBS-01的分离与纯化
[0030] 本发明的枯草芽孢杆菌（B.subtilis）XLBS-01是从土壤中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：
[0031] （1）芽孢杆菌的分离：土样的采集，在全国不同地区选取种植不同作物类型的地块，采用5点取样法，分别采集地块四周和中央深度在10-20cm范围内的土壤适量，等量混匀。标明采集地点、时间和采集人。称取1g土样于100mL无菌水中，置于30℃摇床中150rpm 震荡10min，然后置于60℃水浴锅中孵育30min，取100μL10-2、10-3、10-4稀释液涂布于LB 培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在30℃培养2d后挑取LB培养基上的不同形态的微生物菌落于LB培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化芽孢杆菌菌株，分别编号保存。
[0032] （2）辣椒病高效拮抗芽孢杆菌的筛选
[0033] ①初筛：采用对峙培养法，制备PDA平板，用打孔器在芽孢杆菌、辣椒病边缘打取直径为5mm的菌饼，分别移植在平板相对的两侧中央，25℃恒温培养，逐日观察芽孢杆菌对病原菌的抑制作用。
[0034] ②复筛：将筛选到的具有高效拮抗活性的芽孢杆菌菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的芽孢杆菌菌株，进行盆栽防治试验和田间试验。
[0035] 本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治多种植物病害的枯草芽孢杆菌（B.subtilis）XLBS-01。实验证明，该枯草芽孢杆菌原粉在防治辣椒病显示出非常高效的防治效果，使得农作物显著增产。因而，本发明的枯草芽孢杆菌是具有广泛应用前景的枯草芽孢杆菌新菌株，可以用于制备防治多种植物病害的生物防治制剂。
[0036] 2、菌株鉴定
[0037] （1）微生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB培养基上菌落形态为圆形或不规则形，乳白偏黄，表面粗糙起褶皱，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染呈阳性(以大肠杆菌为对照)。经芽孢染后观察芽孢呈椭圆形或柱状。
[0038] （2）分子生物学特性
[0039] 该菌株的16s rRNA基因序列测定结果如下（SEQ-1）：
[0040] CTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGG ACGGGTGAGTAAC ACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACC GGGGGCTAATACCGGATGCTTGTTTGAACGCA TGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCG GCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAA
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