(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201980015578.5
(22)申请日 2019.01.18
(30)优先权数据
18152390.3 2018.01.18 EP
19150351.5 2019.01.04 EP
(85)PCT国际申请进入国家阶段日
2020.08.26
(86)PCT国际申请的申请数据
PCT/EP2019/051261 2019.01.18
(87)PCT国际申请的公布数据
WO2019/141814 EN 2019.07.25
(71)申请人 伊泽阿恩埃免疫疗法股份有限公司
地址 比利时尼尔
(72)发明人 S ·德科克 S ·贝维尔斯
P ·汤米
(74)专利代理机构 中国贸促会专利商标事务所有限公司 11038代理人 张小勇(51)Int.Cl.A61K 47/20(2006.01)A61K 9/127(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及脂质纳米颗粒(LNP)领域；更具
质和一种或多种核酸。本发明的LNP的特征在于
具有约140nm的最小平均直径，从而诱导更强力
的免疫应答。本发明提供了LNP在核酸分子特别
疾病。最后，
提供了用于制备此类LNP的方法。权利要求书2页 说明书12页 附图5页CN 111971066 A 2020.11.20
C N 111971066
A
1.一种脂质纳米颗粒(LNP)，其包含：
-可离子化的脂质；
-
约5mol％至约15mol％的选自包含DOPE、DOPC及其混合物的列表的磷脂；
-甾醇；
-PEG脂质；和
-一种或多种核酸分子；
其特征在于，所述LNP具有约140nm的最小平均直径。
2.根据权利要求1所述的LNP，其中所述可离子化的脂质是式(I)化合物：
其中：
RCOO选自包含以下的列表：肉豆蔻酰基、α-D-生育酚琥珀酰基、亚油酰基和油酰基；和X选自包含以下的列表： 优选地，所述可离子化的脂质是式(I)的脂质，其中RCCO是α-D-生育酚琥珀酰基，和X是
3.根据权利要求1-2中任一项所述的LNP，其中所述甾醇选自包含以下的列表：胆甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、氧甾醇、antrosterol、链甾醇、nicasterol、谷甾醇和豆甾醇；优选胆甾醇。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的LNP，其中所述PEG脂质选自包含以下的列表：PEG 修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油及其混合物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的LNP，其中所述LNP占所述可离子化的脂质的约10mol％至60mol％和/或所述LNP占所述甾醇的约15mol％至50mol％。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的LNP，其中所述一种或多种核酸分子选自包含以下的列表：mRNA和DNA，优选mRNA。
7.根据权利要求6所述的LNP，其中所述一种或多种mRNA分子选自包含以下的列表：免疫调节性多肽编码mRNA和/或抗原编码mRNA。
8.根据权利要求6至7中任一项所述的LNP，其中所述免疫调节性编码mRNA选自包含以下的列表：编码(包括更广泛的列表)CD40L、CD70和caTLR4的mRNA分子。
9.一种药物组合物或疫苗，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的一种或多种LNP 和可接受的药物载体。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的LNP或根据权利要求9所述的药物组合物，其用于人类或兽医医学。
11.一种用于制备具有约140nm的最小平均直径的包含核酸的LNP的方法，所述方法包括以下步骤：
-制备包含可离子化的脂质、磷脂、甾醇、PEG脂质和合适的醇溶剂的第一醇组合物；
-制备包含一种或多种核酸和补充有适当缓冲剂的水性溶剂的第二水性组合物；
-使用以下设置在微流体混合装置中混合所述第一和第二组合物：
-总流速(FR)为约0.5至约8ml/min，优选为约1至4ml/min。
-流速比(FRR)为约1/1至5/1，优选为约2/1至约3/1。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述醇溶剂为乙醇和/或所述水性溶剂为水。
13.根据权利要求1至8中任一项所述的LNP或根据权利要求9所述的药物组合物的用途，其用于在哺乳动物中诱导针对核酸编码的抗原的免疫应答。
14.根据权利要求1至8中任一项所述的LNP或根据权利要求9所述的药物组合物或疫苗，其用于癌症或感染性疾病。
脂质纳米颗粒
发明领域
[0001]本发明涉及脂质纳米颗粒(LNP)领域；更具体地，其包含可离子化的脂质、磷脂、甾醇、PEG脂质和一种或多种核酸。本发明的LNP的特征在于具有约140nm的最小平均直径，从而诱导更强力的免疫应答。本发明提供了LNP在核酸分子特别是mRNA的免疫原性递送中的用途；从而使得它们非常适合用于疫苗，例如用于癌症或传染性疾病。最后，提供了用于制备此类LNP的方法。
[0002]发明背景
[0003]生物活性物质的靶向递送领域中的主要挑战之一通常是它们的不稳定性和低的细胞穿透潜力。对于核酸分子特别是(m)RNA分子的递送尤其如此。因此，适当的包装对于充分的保护和递送至关重要。因此，持续需要用于包装生物活性物质例如核酸的方法和组合物。
[0004]在这方面，基于脂质的纳米颗粒组合物例如脂质复合物和脂质体已被用作生物活性物质的包装载体，以允许转运到细胞中和/或细胞内隔室中。这些基于脂质的纳米颗粒组合物通常包含不同脂质例如阳离子脂质、可离子化的脂质、磷脂、结构脂质(例如甾醇或胆甾醇)、PEG(聚乙二醇)脂质等的混合物(如Reichmuth等人,2016的综述)。尽管许多这类脂质组合物是本领域已知的，但它们通常具有小的直径，即小于200nm，最经常甚至小于140nm。
[0005]基于脂质的纳米颗粒包含四种脂质(阳离子或可离子化的脂质、磷脂、甾醇和聚乙二醇化脂质)的混合物，其已被开发用于在全身施用后向肝脏非免疫原性递送siRNA和mRNA。为了引起最佳的肝细胞摄取和表达，这些LNP通常显示70-100nm的小尺寸(Li等人, Nanoletters 2015；Thess等人,Mol ther 2015；Kauffman等人,Biomaterials 2016)。[0006]除肝脏靶向外，LNP还已被用于将编码抗原的mRNA免疫原性递送至肌肉或真皮(Richner等人Cell 2017；Liang等人,Mol Ther2017)。在这种情况下，还是通常使用小尺寸(80-120nm)的LNP，因为这种小尺寸已显示对免疫原性至关重要，并且小尺寸的LNP有效
地到达注射引流淋巴结，而较大的LNP保留在注射部位(参见Reichmuth等人，2016)。[0007]我们现在已经令人惊讶地发现，与通常认为的小尺寸的颗粒对于LNP介导的mRNA 递送是有益的观点相反，直径大于140nm，优选甚至大于200nm的纳米颗粒非常适合于在LNP 的全身性注射后免疫原性递送mRNA，这似乎与mRNA向脾脏的递送增强有关。
[0008]发明概述
[0009]在第一方面，本发明提供了脂质纳米颗粒(LNP)，其包含可离子化的脂质、磷脂、甾醇、PEG脂质和一种或多种核酸分子，其特征在于，所述LNP具有约140nm、更优选约200nm的最小平均直径。
[0010]在一个具体的实施方案中，所述可离子化的脂质是式(I)的化合物：
[0011]
[0012]其中：
[0013]RCOO选自包含以下的列表：肉豆蔻酰基、α-D-生育酚琥珀酰基、亚油酰基和油酰基；和
[0014]X选自包含以下的列表：
[0015]
[0016]更具体地，所述可离子化的脂质是式(I)的脂质，其中RCCO是α-D-生育酚琥珀酰基，并且X是
[0017]
[0018]在本发明的另一个实施方案中，所述甾醇选自包含以下的列表：胆甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、氧甾醇、antrosterol、链甾醇、nicasterol、谷甾醇和豆甾醇；优选胆甾醇。[0019]在另一个具体的实施方案中，所述磷脂选自包含以下的列表：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)，1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)，1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)，1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-
磷酸胆碱(DMPC)，1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)，1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)，1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，1,2-二十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)，1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)，1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚PC)，1-油酰基-2-胆甾醇基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)，1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C 16Lyso PC)，1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，1,2-二十二碳己酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)，1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，1, 2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，1,2-二十二碳己酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)，鞘磷脂及其混合物。[0020]在一个更具体的实施方案中，所述磷脂选自包含以下的列表：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)，1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)及其混合物。[0021]在又一个实施方案中，所述PEG脂质选自包含以下的列表：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺，PEG修饰的磷脂酸，PEG修饰的神经酰胺，PEG修饰的二烷基胺，PEG修饰的二酰基甘油，PEG修饰的二烷基甘油及其混合物。
[0022]在另一个具体的实施方案中，应用以下一者或多者：
[0023]-所述LNP占所述可离子化的脂质的约10mol％至60mol％；
[0024]-所述LNP占所述甾醇的约15mol％至50mol％；
[0025]-所述LNP占所述PEG脂质的约0.5mol％至10mol％；和/或
[0026]-所述LNP占所述磷脂的约5mol％至40mol％。
[0027]在另一个具体的实施方案中，所述一种或多种核酸分子选自(m)RNA和DNA分子；尤其是一种或多种mRNA分子。在一个具体的实施方案中，所述一种或多种mRNA分子选自包含以下的列表：编码免疫调节性多肽的mRNA分子，例如(加上所有潜在分子的列表)和/或编码
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