[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公开说明书
[11]公开号CN 1529157A [43]公开日2004年9月15日
[21]申请号03127188.X [22]申请日2003.09.27
[21]申请号03127188.X
[71]申请人吉林大学
地址130012吉林省长春市前卫路10号
[72]发明人牟颖 金钦汉 杨蕊 吴喆 林章碧 [74]专利代理机构长春吉大专利代理有限责任公司代理人王恩远[51]Int.CI 7G01N 27/26G01N 35/08G01N 33/50
G01N 33/68
G01N 21/64C12Q 1/68
权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 3 页
[54]发明名称
法
[57]摘要
本发明的微流控芯片流式生化分析仪及检测生
化组分的方法属检测分析仪器及检测方法。微流控
芯片14是两层薄板经蚀刻粘接制成，薄板之间刻有
入孔17、相对的两个缓冲溶液流入孔18、废液流出
孔20与外界相连。在四个孔中各插有一个电极。激
光光源1发出的激光聚焦在十字交叉通道的检测点2
4；通道21内的物质发出的荧光由光纤15接收再传
入由CCD光谱检测器构成的分光检测系统16。本发
明体积小，重量轻，结构紧凑，操作简单，样品鞘
液用量少，可随意选择荧光试剂，同时获得多种波
长荧光强度，响应速度快，能用于生物化学物质分
析、化学成分分析、药物筛选、临床诊断等领域。
03127188.X权 利 要 求 书第1/1页 1、一种微流控芯片流式生化分析仪，其结构包括有激光光源(1)、分光检测系统(16)，即CCD光谱检测器，其特征在于，其结构还有微流控芯片(14)；所说的微流控芯片(14)是两层薄板经过蚀刻及粘接而制成，两层薄片之间刻有十字交叉的通道(21)，通道(21)的终点处分别是样品流入孔(17)、相对的两个缓冲溶液流入孔(18)、废液流出孔(20)并与外界相连。在样品流入孔(17)、缓冲溶液流入孔(18)、废液流出孔(20)中各插有一个电极；激光光源(1)发出的激光经平面镜(12)、凸透镜(13)后聚焦在微流控芯片(14)的十字交叉通道的检测点(24)；通道(21)内的物质发出的荧光由微流控芯片(14)下方的光纤(15)接收，然后传入分光检测系统(16)。
2、按照权利要求1所述的微流控芯片流式生化分析仪，其特征在于，在微流控芯片(14)上的样品流入孔(17)、缓冲溶液流入孔(18)、废液流出孔(20)上面粘接储液池；电极插装在各储液池中，电极是铂丝或金
丝或铂片或金片。
3、按照权利要求1和2所述的微流控芯片流式生化分析仪，其特征在于，所说的激光光源(1)是蓝或绿半导体激光器。
4、一种权利要求1的微流控芯片流式生化分析仪在检测生化组分中的应用，其特征在于，使用发光量子点编码微球为载体；首先激活微球表面的羟基；其次将编码微球与捕捉抗体耦联，即将核酸、抗体或抗原、肽类或细胞因子吸附在用发光量子点进行编码的微球上，制成标记微球；再次与待测样品混合，通过特异性相互作用，将待测样品中的特异性核酸、抗体或抗原、肽类或细胞因子吸附到对应的发光量子点编码微球上；最后使用微流控芯片流式生化分析仪检测分析待测样品中相关因子的含量。 5、按照权利要求4所述的微流控芯片流式生化分析仪在检测生化组分中的应用，其特征在于，在使用微流控芯片流式生化分析仪检测生化组分中，样品储液池(17)所加电压为600-1800V，缓冲液储液池(18)所加电压为200-1500V。
03127188.X说 明 书第1/8页微流控芯片流式生化分析仪及检测生化组分的方法
技术领域
本发明属一种应用于生物化学、药学研究、生物医学研究及临床诊断等的生化分析仪及使用该生化分析
仪检测核酸、抗体或抗原、肽类及化学因子等的方法。 背景技术
与本发明相近的现有技术为有机荧光染料编码微球和以荧光染料编码微球为基础的流式细胞仪。以荧光染料标记的微球为基础的定量流式细胞术已被用于准确地定量测定细胞表面受体等，其结果可与传统的Scatchard分析法相媲美，并可用于实验室间的标准化研究，因此已有几家公司开始生产高质量的荧光校准微球。
将有机荧光染料编码微球与传统流式细胞仪结合，进行多组分同时检测的仪器已经上市，例如美国Luminex公司的产品。该流式细胞仪的结构原理如图1所示。主要由激光光源1、流动室2、分光装置和检测系统构成。流动室2是样品和鞘液(缓冲液)相混的小室，常以有机玻璃、光学玻璃或石英等制成，是流动系统的心脏。被检测的样品粒子(细胞或微球)与鞘液流分别从样品流入孔3和鞘液流入孔4进入流动室2的流样管5处并被经聚焦的激光照射。采用气压进样的方法使被检测的样品粒子与鞘液流动。分光装置包括两片二性反射镜6。与样品粒子有关的特定的光信号按光的波长被二性反射镜6反射或透射，进行分光，再通过带通滤光片7和凸透镜8，最终到达检测系统。检测系统包括光电倍增管9和硅光电二极管10，两个光电倍增管9和一个硅光电二极管10分别接收两束反射光和透射光并对其强度进行检测。
由于流动室2做工精巧，尺寸准确，在设计上要求在流体力学上、光学上、机械学和电学上都十分稳定，因而具有加工困难、体积较大、价格昂贵的缺点。同时由于采用气压进样的方法，同时需要大量的
鞘液，更增加了其微型化的难度。由于采用光电倍增管9和硅光电二极管10作为检测器，用二性反射镜6作为分光装置，使得其光学结构相当复杂，调节也相当困难，操作复杂，需要经专门训练的人员进行操作，并且只能对几种特定的发射波长进行检测，波长种类越多价格越高，仪器体积也越大。
所说的样品粒子是采用荧光染料进行编码过的微球。由于有机染料激发光谱和发射光谱靠的较近，且峰形不对称，发射峰“拖尾”严重，亮度较低且光褪现象较严重。并且由于光褪问题，此种标记微球并不稳定，不易保存。并且很难选择同一个激发光源同时激发几种荧光染料(一般＜3种)，因此很难利用他们作大量微球的标记，目前市售的标记微球总数为64种，据说将有100种不同编码的微球即将推出，但这与人类基因总共有约3-4万种相比，仍然是远远不够的。 发明内容
本发明要解决的技术问题是克服背景技术的不足，设计一种流式生化分析仪以及用量子点编码微球检测生化组分的方法，使仪器的整体性能稳定、流动室及检测器体积变小、被检测的样品量与鞘液用量减少、价格低廉、可对所有波长上的光强进行检测，一次性得到每个波长处的数据；使用的编码微球亮度高、不褪、易保存，用同一个激发光源可同时激发更多种编码微球，从而可以对更多种生物或化学组分进行同时快速检测。
本发明的微流控芯片流式生化分析仪的结构主要包括有：激光光源、微流控芯片分析系统、分光检测系统(CCD全谱仪)。
所说的微流控芯片是两层薄板经过蚀刻及粘接而制成，薄板可以玻璃或塑料或其它材质的，两层薄片之间刻有十字交叉的通道，通道的终点处分别是样品流入孔、相对的两个缓冲溶液流入孔、废液流出孔并与外界相连。在样品流入孔、缓冲溶液流入孔、废液流出孔中各插有一个电极。激光光源发出的激光经平面镜、凸透镜后聚焦在微流控芯片的十字交叉通道的检测点。通道内的物质发出的荧光由芯片下方的光纤接收，然后传入分光检测系统。所说的分光检测系统是指一个体积仅为几立方厘米的CCD光谱检测器，其内部由一准直用光平行凹面镜、分光光栅和阵列检测器构成，光纤出口与C C D光谱检测器间由螺旋密切连接。 微流控芯片上的样品流入孔、缓冲溶液流入孔、废液流出孔均粘接有相应的储液池，用来分别承装样品、缓冲溶液及废液。各储液池中插装有电极，它们可以由铂丝、金丝、铂片或金片做成，但从稳定性、导电性能及造价等方面考虑，选择铂丝作为电极最为合适。微流控芯片大小为1-15cm2，但为了保证一定大小的电场强度，芯片无须做得过大，以1-6cm2为宜；每条微通道长度为1-5cm，以0.5-1.5cm为最佳；每条微通道宽度为10-150μm，以20-100μm为最佳。
微流控芯片的材质可为单晶硅、无定型硅、玻璃、石英、环氧树脂、聚脲、聚氨、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯及二甲基硅氧烷。可以通过化学蚀刻法、准分子激光刻蚀、塑膜法及热压法等方法得到价格低廉、深宽比较大的高分子材料的微流控芯片。微流控芯片可反复使用，亦可一次性使用。
激光光源可为蓝或绿半导体激光器或氩离子激光器，但由于半导体激光器具有体积小，无需水冷，预热时间短，价格低廉等优点，且蓝激光能够激发的荧光范围较宽，尤其是对于量子点，各种发射波
长的量子点都可以使用蓝激光来激发，故以蓝半导体激光器为最佳。
本发明用以检测生化组分的方法采用的技术方案是：使用发光量子点编码微球为载体，首先激活微球表面的羟基。然后将编码微球与捕捉抗体耦联，即将核酸、抗体或抗原、肽类或细胞因子等物质吸附在不同编码的发光量子点编码微球上制成标记微球。再将其与待测样品混合，通过DNA杂交反应、免疫反应等特异性相互作用，将各种待测样品中的特异性核酸、抗体或抗原、肽类或细胞因子等也全部吸附到对应的发光量子点编码微球上。最后使用微流控芯片流式生化分析仪检测分析待测样品中相关因子的含量。
所说的发光量子点编码微球已有大小均匀、包含各种特定比例不同种类发光量子点进行编码的聚苯乙烯或乳胶聚合物的微球产品。本发明采用直径范围为1 -20μm、量子点的发射带宽＜20nm的微球。微球直径范围以2-6μm为最佳，直径偏差＜±5％。
所说的将编码微球与捕捉抗体耦联也就是对编码微球进行修饰，在其上固定核酸、抗体或抗原、肽类、细胞因子等生物和化学物质。
所说的与待测样品混合也就是使微球标记的探针通过DNA杂交反应、免疫反应及分子识别等与样品中相应的待测组分结合。
在检测生化组分的方法中，样品储液池所加电压为600-1800V，缓冲液储液池为200-1500V，电压增加则流动速度加快，可缩短检测时间，但由于电解及焦耳热等各种因素的影响，最佳电压为样品池1000-1500V，缓冲液池为600 -1200V，并且操作电压可由系统操作软件进行控制。每秒钟检测的微球数为2 -500个，由于检测器相应速度和计算机处理速度及检测时间的限制，以每秒钟检测30-200个为宜。测试所需样品体积为0.04-0.5m L，最佳体积为0.05-
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