(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011182808.8
(22)申请日 2020.10.29
(71)申请人 诺峰药业（成都）有限公司
地址 610000 四川省成都市天府国际生物
城(双流区生物城中路二段18号)
(72)发明人 文路乔 宋德兰 徐欣 叶翔
庄昌萌
(74)专利代理机构 成都高远知识产权代理事务
所(普通合伙) 51222
代理人 李高峡 张娟
(51)Int.Cl.
G01N 30/02(2006.01)
G01N 30/06(2006.01)
G01N 30/34(2006.01)
G01N 30/36(2006.01)
G01N 30/74(2006.01)G01N 30/86(2006.01)
(54)发明名称
质及其含量的高效液相谱方法
(57)摘要
本发明提供了一种测定二氟泼尼酯眼用乳
酯眼用乳剂，加溶剂溶解配制样品溶液；(2)标准
品溶液的制备：称取二氟泼尼酯标准品，加溶剂
溶解配制标准品溶液；(3)将样品溶液和标准品
溶液分别注入高效液相谱仪，梯度洗脱，进行
检测和计算。本发明方法专属性强，精密度高且
回收率高，是检测二氟泼尼酯眼用乳剂中降解杂
质及其含量的有效方法，
具有应用前景。权利要求书2页 说明书13页 附图11页CN 112305115 A 2021.02.02
C N 112305115
A
1.一种检测二氟泼尼酯眼用乳剂中降解杂质的高效液相谱方法，其特征在于，所述降解杂质包括Dif lu
oropred nisolone、Dif luoropred nisolone 17-Aceta te、Difluoroprednisolone 21-Acetate、Difluoroprednisolone 17-Butyrate、Difluoroprednisolone 21-Butyrate，包括以下操作步骤：
(1)样品溶液的制备：取待检二氟泼尼酯眼用乳剂，加溶剂溶解配制样品溶液；
(2)将样品溶液注入高效液相谱仪检测，谱条件如下：
谱柱：C18谱柱；
流动相：流动相A为乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱，洗脱程序如下：
洗脱时间0min，25％～35％的流动相B；
洗脱时间6min，25％～35％的流动相B；
洗脱时间25min，40％～50％的流动相B；
洗脱时间35min，40％～50％的流动相B；
洗脱时间40min，25％～35％的流动相B；
洗脱时间50min，25％～35％的流动相B。
2.一种检测二氟泼尼酯眼用乳剂中降解杂质含量的高效液相谱方法，其特征在于，所述降解杂质包括Difluoroprednisolone、Difluoroprednisolone 17-Acetate、Difluoroprednisolone 21-Acetate、Difluoroprednisolone 17-Butyrate、Difluoroprednisolone 21-Butyrate，包括以下操作步骤：
(1’)样品溶液的制备：取待检二氟泼尼酯眼用乳剂，加溶剂溶解配制样品溶液；
(2’)标准品溶液的制备：称取二氟泼尼酯标准品，加溶剂溶解配制标准品溶液；
(3’)将样品溶液和标准品溶液分别注入高效液相谱仪检测，谱条件如下：
谱柱：C18谱柱；
流动相：流动相A为乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱，洗脱程序如下：
洗脱时间0min，25％～35％的流动相B；
洗脱时间6min，25％～35％的流动相B；
洗脱时间25min，40％～50％的流动相B；
洗脱时间35min，40％～50％的流动相B；
洗脱时间40min，25％～35％的流动相B；
洗脱时间50min，25％～35％的流动相B；
(4’)根据检测结果计算得到二氟泼尼酯眼用乳剂中5种降解杂质的含量，计算公式如下：
其中，Aspl为测得的样品溶液的峰面积；
Astd为标准品溶液重复测量5次的峰面积的平均值；
Wstd为标准品溶液中二氟泼尼酯的质量，以mg计；
Dstd为标准品溶液的稀释倍数；
Dspl为样品溶液的稀释倍数；
L为样品溶液的标示量，以mg计；
P为二氟泼尼酯标准品的纯度以mg/mg计；
RRF是杂质的相对响应因子。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)，和/或步骤(1’)，和/或步骤(2’)所述溶剂为乙腈。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)和/或步骤(3’)中，所述乙酸铵溶液的浓度为0.01～0.03mol/L，pH为3～4；优选为浓度0.02mol/L，pH为3.5。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(2)和/或步骤(3’)中所述谱柱规格为内径4.6mm，长度150mm，填料粒径3.5μm；优选的谱柱型号为SVEA C18 Cold谱柱。
6.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)和/或步骤(3’)中所述梯度洗脱程序为：
洗脱时间0min，30％的流动相B
洗脱时间6min，30％的流动相B
洗脱时间25min，45％的流动相B
洗脱时间35min，45％的流动相B
洗脱时间40min，30％的流动相B
洗脱时间50min，30％的流动相B。
7.如权利要求1或2任一项所述的方法，其特性在于，步骤(2)和/或步骤(3’)中所述谱条件还包括：柱温为25～35℃，流速为0.5～1.5mL/min，样品盘温度为5℃，检测波长为254nm。
8.如权利要求7所述的方法，其特性在于，所述柱温为30℃；流速为1.0mL/min。
9.如权利要求1或2任一项所述的方法，其特性在于，步骤(2)和/或步骤(3’)中的样品溶液和标准品溶液进样量分别为5～15μL，优选为10μL。
10.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述杂质的相对响应因子的值如下：
Difluoroprednisolone的相对响应因子为：1.41；
Difluoroprednisolone 17-Acetate的相对响应因子为：1.22；
Difluoroprednisolone 21-Acetate的相对响应因子为：1.26；
Difluoroprednisolone 17-Butyrate的相对响应因子为：1.05；
Difluoroprednisolone 21-Butyrate的相对响应因子为：1.12。
一种检测二氟泼尼酯眼用乳剂中的降解杂质及其含量的高效
液相谱方法
技术领域
[0001]本发明属于化学分析技术领域，具体涉及一种测定二氟泼尼酯眼用乳剂中的降解杂质及其含量的高效液相谱方法。
背景技术
[0002]二氟泼尼酯眼科乳剂是一种用于的无菌、外抗炎皮质类固醇。它的化学名称是6-3,9二氟-11,17,21-三羟基孕烯-1,4-二烯-3,20-二酮21-乙酸17-丁酸酯(CAS编号23674-86-4)。每毫升乳剂含活性成分二氟泼尼酯0.5mg(0.05％)；非活性成分：硼酸、蓖麻油、甘油、聚山梨酯80、注射用水、醋酸钠、依地酸二钠、氢氧化钠，并含有防腐剂山梨酸。[0003]二氟泼尼酯眼科乳剂的降解杂质主要包括以下五种：
[0004]Difluoroprednisolone(CAS:806-29-1)，
[0005]Difluoroprednisolone 17-Acetate(CAS:23674-85-3)，
[0006]Difluoroprednisolone 21-Acetate(CAS:52-70-0)、
[0007]Difluoroprednisolone 17-Butyrate(CAS:23640-96-2)，
[0008]Difluoroprednisolone 21-Butyrate(CAS:N/A)
[0009]上述五种降解杂质均是在原料药(Active Pharmaceutical Ingredient，API) 合成过程中产生的，在研制成成品制剂后，在放置过程中主成分会有不同程度的降解，根据ICH Q3B的要求，需对其降解出来的杂质进行定性及定量，即作为特定杂质控制，同时监测产品质量。故对二氟泼尼酯眼用乳剂中降解杂质的含量进行有效准确的监测是非常有必要的。
[0010]目前暂没文献报道同时检测二氟泼尼酯眼用乳剂中5种降解杂质的含量的方法，而且其中的Difluoroprednisolone杂质的谱峰容易与辅料峰发生重叠，影响检测。因此，提供一种能够同时、准确检测二氟泼尼酯眼用乳剂中 5种降解杂质的含量的方法具有重要意义。
发明内容
[0011]本发明的目的在于提供一种检测二氟泼尼酯眼用乳剂中降解杂质的方法，所述降解杂质包括Dif l u o r o p red n i s o l o n e、Dif l u o r o p red n i s o l o n e 17-A c e ta te、 Difluoroprednisolone 21-Acetate、Difluoroprednisolone 17-Butyrate、 Difluoroprednisolone 21-Butyrate，包括以下操作步骤：
[0012](1)样品溶液的制备：取待检二氟泼尼酯眼用乳剂，加溶剂溶解配制样品溶液；[0013](2)将样品溶液注入高效液相谱仪检测，谱条件如下：
[0014]谱柱：C18谱柱；
[0015]流动相：流动相A为乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱，洗脱程序如下：[0016]洗脱时间0min，25％～35％的流动相B
[0017]洗脱时间6min，25％～35％的流动相B
[0018]洗脱时间25min，40％～50％的流动相B
[0019]洗脱时间35min，40％～50％的流动相B
[0020]洗脱时间40min，25％～35％的流动相B
[0021]洗脱时间50min，25％～35％的流动相B
[0022]本发明还提供了一种检测二氟泼尼酯眼用乳剂中降解杂质含量的高效液相谱方法，所述降解杂质包括Difluoroprednisolone、Difluoroprednisolone 17-Acetate、Difluoroprednisolone 21-Acetate、Difluoroprednisolone 17-Butyrate、 Difluoroprednisolone 21-Butyrate，包括以下操作步骤：
[0023](1’)样品溶液的制备：取待检二氟泼尼酯眼用乳剂，加溶剂溶解配制样品溶液；[0024](2’)标准品溶液的制备：称取二氟泼尼酯标准品，加溶剂溶解配制标准品溶液；[0025](3’)将样品溶液和标准品溶液分别注入高效液相谱仪检测，谱条件如下：[0026]谱柱：C18谱柱；
[0027]流动相：流动相A为乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱，洗脱程序如下：[0028]洗脱时间0min，25％～35％的流动相B
[0029]洗脱时间6min，25％～35％的流动相B
[0030]洗脱时间25min，40％～50％的流动相B
[0031]洗脱时间35min，40％～50％的流动相B
[0032]洗脱时间40min，25％～35％的流动相B
[0033]洗脱时间50min，25％～35％的流动相B
[0034](4’)根据检测结果计算得到二氟泼尼酯眼用乳剂中5种降解杂质的含量，计算公式如下：
[0035]
[0036]其中，Aspl为测得的样品溶液的峰面积；
[0037]Astd为标准品溶液重复测量5次的峰面积的平均值；
[0038]Wstd为标准品溶液中二氟泼尼酯的质量，以mg计；
[0039]Dstd为标准品溶液的稀释倍数；
[0040]Dspl为样品溶液的稀释倍数；
[0041]L为样品溶液的标示量，以mg计；
[0042]P为二氟泼尼酯标准品的纯度以mg/mg计；
[0043]RRF是杂质的相对响应因子。
[0044]所述杂质的相对响应因子的值如下：
[0045]Difluoroprednisolone的相对响应因子为：1.41；
[0046]Difluoroprednisolone 17-Acetate的相对响应因子为：1.22；
[0047]Difluoroprednisolone 21-Acetate的相对响应因子为：1.26；
[0048]Difluoroprednisolone 17-Butyrate的相对响应因子为：1.05；
[0049]Difluoroprednisolone 21-Butyrate的相对响应因子为：1.12。
[0050]进一步地，上述方法中，步骤(1)，和/或步骤(1’)，和/或步骤(2’) 所述溶剂为乙
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