(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201510786031.9
(22)申请日 2015.11.17
G01N 30/02(2006.01)
(71)申请人重庆医药工业研究院有限责任公司
地址400061 重庆市南岸区涂山路565号
(72)发明人陈皓 李雪逃 刘泽荣 张道林
冯浩 周冰 汪维维
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种分离测定恩格列净及其有
关物质的方法，该方法采用高效液相谱法，以辛
烷基硅烷键合硅胶填料或苯基硅烷键合硅胶填料
为谱柱，以磷酸溶液与甲醇、乙腈组成流动相，
进行梯度洗脱。该方法可以将恩格列净及其有关
物质很好分离，检测的重现性好、灵敏度高、专属
性强、操作简便，有助于控制恩格列净的质量和用
药安全。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书11页 附图2页CN 106706768 A 2017.05.24
C N 106706768
A
1.一种用高效液相谱法分离测定恩格列净及其有关物质的方法，包括以辛烷基硅烷键合硅胶填料柱或苯基硅烷键合硅胶填料柱为谱柱，流动相由有机相和水相组成，所述有机相为甲醇和乙腈混合溶液，水相为磷酸溶液或磷酸盐缓冲液，所述磷酸溶液或磷酸盐缓冲液的pH值为2～6，进行梯度洗脱，以紫外 检测器进行检测，其中，所述梯度洗脱包括水相与有机相的洗脱初始体积比为65∶35～45∶55，水相与有机相的洗脱终止体积比为35∶65～15∶85。 2.根据权利要求1所述的方法，所述磷酸溶液或磷酸盐缓冲液的pH值为
3.5。
3.根据权利要求1或2所述的方法，所述磷酸盐选自磷酸二氢钠、磷酸二氢钾和磷酸二氢铵。
4.根据权利要求1或2所述的方法，水相中磷酸盐浓度为：0～0.005mol/L。
5.根据权利要求1所述的方法，有机相中，甲醇与乙腈的体积比为50：
50。6.根据权利要求1所述的方法，所述梯度洗脱包括：0min至第18～24min时，流动相中水相与有机相的体积比为60∶40～50∶50；第18～24min至第48～54min时，水相与有机相的体积比匀速变化至30∶70～20∶80；第48～54min至第58～64min时水相与有机相的体积比保持比例不变。
7.根据权利要求7所述的方法，所述梯度洗脱包括：0min至第19.5min时，流动相中水相与有机相的体积比为55∶45；第19.5min至第50min时，水相与有机相的体积比匀速变化到25∶75；第50min至第60min时水相与有机相的体积保持比例25∶75不变。
8.根据权利要求1所述的方法，进一步包括以下步骤：
（1）取恩格列净原料药或其药物组合物，加流动相使恩格列净完全溶解并稀释定容，配制成每1ml溶液中含恩格列净0.4～0.8mg，滤过，作为供试品溶液；
（2）以辛烷基硅烷键合硅胶填料柱或苯基硅烷键合硅胶填料柱为谱柱，流速为0.8～
1.2ml/min，柱温为20～30℃，波长为200～250nm；
（3）取供试品溶液10～30μl，注入高效液相谱仪；
（4）将水相pH2～6的磷酸溶液或磷酸盐缓冲液与有机相甲醇、乙腈等以65∶35～45∶55为初始体积比洗脱至主峰出来后，逐渐增大有机相比例，至水相与有机相的体积比达到 35∶65～15∶85并保持不少于10分钟，完成恩格列净有关物质的测定；
（5）采用不加校正因子的主成分对照品法以峰面积计算恩格列净的纯度及有关物质中各单一杂质含量及有关物质总量。
9.根据权利要求9所述的方法，步骤（1）中，每1ml溶液中含恩格列净0.8mg，或步骤（2）中流速为1.0ml/min，柱温为25℃，波长为224nm，或步骤（3）中，取供试品溶液20μl，或步骤
（4）中水相为pH3.5的磷酸溶液或磷酸盐缓冲液，水相与有机相的初始体积比为55∶45，洗脱至主峰出来后，逐渐增大有机相比例，至水相与有机相的体积比达到25∶75。
权 利 要 求 书1/1页CN 106706768 A
一种分离测定恩格列净及其有关物质的方法
技术领域
[0001]本发明属于药物分析方法领域，具体涉及一种采用高效液相谱法分离测定降糖药恩格列净及其有关物质的方法。
背景技术
[0002]恩格列净为一种选择性钠-葡萄糖协同转运蛋白(SGLT)抑制剂，用于成人II 型糖尿病。恩格列净通过对钠-葡萄糖协同转运蛋白选择性抑制作用，限制了大部分葡萄糖在体内的重吸收，促使葡糖大量从尿中排出达到控制血糖水平的目的。
[0003]恩格列净的化学结构式如下：
其化学名为： (1S)-1,5-脱水-1-C-[4-氯-3-[[4-[[(3S)-四氢-3-呋喃基]氧基]苯基]甲基]苯基]-D-葡萄糖醇。
[0004]恩格列净为全合成化学药，反应过程中可能产生的副产物或残留的中间体会影响其纯度和质量；在其储存过程中，可能会因为温度、光照等环境因素导致降解产物产生，也会影响其纯度和质量。这些残留的中间体、副反应产物、降解产物就是通常药物质量控制中所说的有关物质。
[0005]目前，有关恩格列净及其组合物的有关物质测定方法未见报道，为保证恩格列净原料药及其药物组合物的质量可控，以确保其有效性和安全性，亟需一种有效的检测方法，能够有效分离测定恩格列净及其有关物质。本发明人经过大量的科学试验和测试条件的筛选，发现一种快速分离测定恩格列净及其有关物质的方法，该方法可以有效控制了恩格列净的工艺杂质和降解产物，保证了恩格列净原料药及其药物组合物的质量可控，从而完成了本发明。
[0006]本发明人发现，已上市的恩格列净片剂，其中含有的乳糖、微晶纤维素等药用辅料在本发明的方法中不会干扰测定恩格列净及其有关物质的测定。因此，本发明同样适用于恩格列净的药物组合物。
发明内容
[0007]本发明的目的在于提供一种分离测定恩格列净及其有关物质的方法，该方法能将恩格列净与其有关物质有效分离，准确检测恩格列净原料药和其药物组合物中的有关物质，从而控制恩格列净的质量，确保恩格列净药品的有效性和安全性。
[0008]为实现本发明的目的，提供如下实施方案。
[0009]在实施方案中，本发明是一种分离测定恩格列净及其有关物质的方法，该方法包
括采用高效液相谱法，以辛烷基硅烷键合硅胶填料柱或苯基硅烷键合硅胶填料柱为谱柱，以磷酸溶液或磷酸盐缓冲液为水相与以甲醇乙腈组成的有机相混合作为流动相，进行梯度洗脱，以紫外检测器进行检测。
[0010]在上述实施方案中，本发明的方法，所述磷酸溶液或磷酸盐缓冲液的pH值为2～6，优选为3.5，其中，所述磷酸盐缓冲液所用磷酸盐选自磷酸二氢钠、磷酸二氢钾和磷酸二氢铵，优选磷酸盐为磷酸二氢钠，用磷酸溶液调节pH值，水相中磷酸盐浓度为0～0.005mol/L，优选0.002 mol/L。
[0011]在上述实施方案中，本发明的方法，所述有机相为甲醇与乙腈的混合溶液，其中，甲醇-乙腈的体积比为50:50。
[0012]在上述实施方案中，本发明的方法，水相与有机相的洗脱初始体积比为65∶35～45∶55，优选55∶45，水相与有机相的洗脱终止体积比为35∶65～15∶85，优选25∶75。
[0013]在上述实施方案中，本发明的方法，紫外检测波长为200～250nm，优选为224nm。[0014]在上述实施方案中，本发明的方法，进一步包括以下步骤：
（1）取恩格列净原料药或其药物组合物，加流动相使恩格列净完全溶解并稀释定容，配制成每1ml溶液中含恩格列净0.4～0.8mg，优选0.8mg，滤过，作为供试品溶液；
（2）以辛烷基硅烷键合硅胶填料柱或苯基硅烷键合硅胶填料柱为谱柱，流速为0.8～1.2ml/min，优选1.0 ml/min，柱温为20～30℃，优选25℃，波长为200～250nm，优选为224 nm；
（3）取供试品溶液10～30μl，优选20μl，注入高效液相谱仪；
（4）将水相pH2～6的磷酸溶液或磷酸盐缓冲液与有机相甲醇、乙腈以65∶35～45∶55为初始体积比洗脱至主峰出来后，逐渐增大有机相比例，至水相与有机相的体积比达到 35∶65～15∶85并保持不少于10分钟，完成恩格列净有关物质的测定；
（5）采用不加校正因子的主成分对照品法以峰面积计算恩格列净的纯度及有关物质中各单一杂质含量及有关物质总量。
[0015]在上述实施方案中，本发明的方法，步骤（4）中优选的水相为pH3.5的磷酸溶液；优选的水相与有机相初始体积比为55∶45，洗脱至主峰出来后，逐渐增大有机相比例，优选的水相与有机相最终体积比达到25∶75并保持10分钟，完成恩格列净有关物质的测定。[0016]在上述实施方案中，本发明的方法，所述梯度洗脱包括：0min至第18～24min时，流动相中水相与有机相的体积比为60∶40～50∶50；第18～24min至第48～54min时，水相与有机相的体积比匀速变化至30∶70～15∶85；第48～54min至第58～64min时水相与有机相的体积比保持比例不变。
[0017]在上述实施方案中，本发明的方法，优选的梯度洗脱包括：0min至第19.5min时，流动相中水相与有机相的体积比为55∶45；第19.5min至第50min时，水相与有机相的体积比匀速变化到25∶75；第50min至第60min时水相与有机相的体积保持比例25∶75不变。
[0018]在一具体实施方案中，本发明所说的用高效液相谱分离测定恩格列净及其有关物质的方法，包括以下步骤：
（1）取恩格列净原料药或制剂，精密称定，加流动相适量使恩格列净溶解，再用流动相稀释制成每1ml中含恩格列净0.4～0.8mg的溶液，必要时滤过，作为供试品溶液；另精密称取恩格列净对照品适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml中含0.6～1.2μg的溶液，作为对照
品溶液；
（2）取供试品溶液和对照品溶液各10～30μl，注入高效液相谱仪，进行梯度洗脱，谱条件如下：选择以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂或苯基硅烷键合硅胶为填充剂的谱柱，以磷酸溶液(取纯化水，用磷酸调pH值至2～6)或磷酸盐缓冲液(如0.002mol/L磷酸二氢钠溶液，用磷酸调pH值至2～6)作为流动相水相，以甲醇和乙腈混合溶液作为流动相有机相，进行梯度洗脱，柱温为：20～30℃；流速为0.8～1.2ml/min检测波长为200～250nm，梯度洗脱条件如下：0min至第18～24min时，流动相中水相与有机相的体积比为60∶40～50∶50；第18～24min至第48～54min时，水相与有机相的体积比匀速变化至30∶70～20∶80；第48～54min至第58～64min时水相与有机相的体积比保持比例不变，此时已完成有关物质测定，记录谱图；
（3）为了连续进样，可以设置一段平衡谱系统的过程，即第58～64min至第58.5～64.5min时, 水相与有机相的体积比匀速变化至初始比例，再保持10min完成平衡。[0019]上述本发明所说的用高效液相谱分离测定恩格列净及其有关物质的方法，优选的，包括以下步骤：
（1）取恩格列净原料药或制剂，精密称定，加流动相适量使溶解，再用流动相稀释制成每1ml中含恩格列净0.8mg的溶液，必要时滤过，作为供试品溶液；另精密称取恩格列净对照品适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml中含1.2μg的溶液，作为对照品溶液。
[0020]（2）以辛烷基硅烷键合硅胶填充柱（ZORBAX Rx-C8，4.6×250mm，5µm）或者苯基硅烷键合
硅胶填充柱（Generall-M PH，4.6×250mm，5µm）为谱柱；以磷酸溶液(取纯化水，用磷酸调pH值至3.5)作为流动相的水相，以甲醇-乙腈（50:50）作为流动相的有机相，进行梯度洗脱；柱温为25℃；流速为1.0ml/min检测波长为224nm，梯度洗脱条件如下：0min至第19.5min时，流动相中水相与有机相的体积比为55∶45；第19.5min至第50min时，水相与有机相的体积比匀速变化到25∶75；第50min至第60min时水相与有机相的体积保持比例25∶75不变，记录谱图。
[0021]上述本发明的方法，所述“0min至第18～24min”表示：从0min开始，到第18～24min 中任意时刻为止（将此时刻记为时刻A）；“第18～24min至第48～54min时，水相与有机相的体积比匀速变化至30∶70～20∶80”表示：从选择的第18～24min中的时刻A开始，到第48～54min中的任意时刻为止（将此时刻记为时刻B），在时刻B，经过梯度变化，动相中水相与有机相的体积比变为30∶70～20∶80范围内的任意比例。关于梯度时间的表述以此类推。[0022]上述本发明的方法，按不加校正因子的主成分对照品法以峰面积计算恩格列净中各单一杂质含量及有关物质总量。
[0023]本发明的方法，有益效果或优势在于：
①专属性强，杂质之间不会相互干扰，方法不但能够提供恩格列净有关物质总量的检测方法，还提供了单个杂质的检测结果；
②灵敏度高，本发明中恩格列净的最低检测浓度为0.017μg/ml，表明其能够保证检出微量的杂质；
③实用性强，在检测完有关物质之后设计有平衡谱系统过程，可以避免大量连续进样带来的基线噪音大、梯度系统峰多等不利影响，保证了检测结果能够良好重现；
④耐用性好，选用本发明中提到的不同类型谱柱，或者将谱条件中流动相pH值、流
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