(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201880096312.3
(22)申请日 2018.09.03
(85)PCT国际申请进入国家阶段日
2021.02.05
(86)PCT国际申请的申请数据
PCT/CN2018/103764 2018.09.03
(87)PCT国际申请的公布数据
WO2020/047695 ZH 2020.03.12
(71)申请人 深圳华大生命科学研究院
地址 518083 广东省深圳市盐田区盐田街
道北山工业区综合楼
(72)发明人 翟莉莉 王林 章文蔚 董宇亮
郑越 刘芬 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245代理人 关畅(51)Int.Cl.C12N 9/12(2006.01)C12N 15/52(2006.01)C12N 15/63(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
提供一种重组型KOD聚合酶，其是如下A)或
B)：A)所示的聚合酶为将野生型KOD型DNA聚合酶
氨基酸序列中第675、385、710、674、735、736、
606、709、347、349、590、676、389、589、680、384、
496和383位这18位中至少一位的氨基酸残基进
的聚合酶为将A)所示蛋白的氨基酸序列末端添
加标签序列且具有DNA聚合酶活性的由A)衍生的
蛋白质。CN 112639089 A 2021.04.09
C N 112639089
A
2..
(51)国际专利分类号：CZ,D E，D J，D K，DM,DO,D Z，EC,EE,E G，E S，FI,GB，
C12N9/12(2006.01)C12N15/63(2006.01)GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR，I S，C12N15/52(2006.01)JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,L C，L K，
(21)国际申请号：PCT/CN2018/103764L R，LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,
MY,MZ,NA,N G，NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL，
(22)国际申请日：2018年9月3日(03.09.2018)PT，QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL，
(25)申请语言：中文SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,U G，
US,UZ,VC,VN,Z A，ZM,Z W。
(26)公布语言：中文
(84)指定国(除另有指明，要求每一种可提供的地区
(71)申请人：深圳华大生命科学研究院(BGI保护)：
ARIPO(BW，GH，GM，K E，L R，L S，MW,M Z，SHENZHEN)[CN/CN]：中国广东省深圳盐
NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW)，欧亚(AM，田区盐田街道北山工业区综合楼,
AZ,BY,KG,KZ,RU,T J，TM)，欧洲(AL,AT,B E，B G，Guangdong518083(CN)。
CH，CY,CZ,D E，D K，EE,ES,FI,FR，GB，GR，H R，HU,
(72)发明人：翟莉莉(ZHAI,Lili)；中国广东省深圳市IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,
盐田区盐田街道北山工业区综合楼,Guangdong RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OAPI(BF,BJ,CF,CG,Cl,
518083(CN)。王林(WANG,Lin)；中国广东省CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG)。=深圳市盐田区盐田街道北工业区综合
=楼，Guangdong518083(CN)。章文蔚(ZHANG，本国际公布：
-包括国际检索报告(条约第21条(3))。
Wenwei)；中国广东省深圳市盐田区盐田街道
北山工业区综合楼，Guangdong518083(CN)。-包括说明书序列表部分(细则5.2(a))0
董宇亮(DONG,Yuliang)；中国广东省深圳市盐
田区盐田街道北山工业区综合楼,Guangdong
=518083(CN)。郑越(ZHENG,Yue)；中国广东省
深圳市盐田区盐田街道北山工业区综合楼,
Guangdong518083(CN)。刘芬(LIU,Fen)；中国
=广东省深圳市盐田区盐田街道北山工业区
综合楼，Guangdong518083(CN)。
=(74)代理人：北京纪凯知识产权代理有限公司(JEEKAI
&PARTNERS)；中国北京市丰台区广安路9号
5号楼15A层，Beijing100055(CN)。
_(81)指定国(除另有指明，要求每一种可提供的国家
保护)：AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,
=BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,
(54)Title：RECOMBINANT KOD POLYMERASE
(54)发明名称：重组型KOD聚合酶
(57)Abstract:Provided i s a recombinant KOD polymerase,which i s the following A)or B):the polymerase shown in A)i s a protein
having DNA polymerase activity that i s obtained by modifying amino acid residues in at least one of the following18positions in a wild-type KOD DNA polymerase amino acid sequence:675th,385th,710th,674th,735th,736th,606th,709th,347th,349th,590th, 676th,389th,589th,68
0th,384th,496th and383rd;the polymerase described by B)i s a protein having DNA polymerase activity that
i s derived from A)by adding a tag sequence t o an end of the amino acid sequence of the protein shown i n A).
寸(57)摘要：提供一种重组型KOD聚合酶，其是如下A)或B):A)所示的聚合酶为将野生型KOD型DNA聚合®酶氨基酸序列中第675、385、710、674、735、736、606、709、347、349、590、676、389、589、680、384、®496和383位这18位中至少一位的氨基酸残基进行修饰，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白；B)所述的聚合酶®为将A)所示蛋白的氨基酸序列末端添加标签序列且具有DNA聚合酶活性的由A)衍生的蛋白质。
o
重组型K0D聚合酶
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种重组型K㈤聚合酶。
背景技术
DNA聚合酶的作用是快速而准确地复制DNA，对于生命体能够精准的传递遗传信息并且维持遗传物质稳定性具有重要的作用。在大肠杆菌中有五种DNA 聚合酶，根据DNA聚合酶的序列同源性的不同，又分为A，B，C等几种类型。DNA 聚合酶的总折叠结构类似人手，分为手掌、拇指和手指三部分，虽然不同种类的DNA聚合酶的手指和手掌的结构域的结构会有变化会很大，但催化的手掌区域差异较小。DNA聚合酶的活性位点的主要的氨基酸序列是保守的，但是这些保守的酶活性位点也是相对容易改变的，能够加入非天然的特定dNTP而保持DNA聚合酶的活性不显著下降（参见Patel等的专利号6602695）。
M）D DNA聚合酶属于B-fami l y DNA聚合酶，能够快速准确的复制DNA，是种耐热的DNA聚合酶，应用范围广泛，其中最重要的一个应用就是应用于基因组测序中，例如：SBS测序。SBS测序方法中使用在3’糖羟基具有修饰的核苷酸，从而阻断其它核苷酸的加入。使用带有3’阻断基团的核苷酸允许以受控方式将核苷酸掺入多核苷酸链中。在加入每个核苷酸后，3’阻断基团的存在阻止其它核苷酸加入所述链中。在去除阻断基团后，恢复天然游离的3’羟基基团用于加入下一个核苷酸。但是目前SBS测序也存在很多技术问题，如：测序的读长较短，反应的速率太慢等。K0D聚合酶是针对这些技术问题进行专门改进的酶产品，其去除了野生型K0D聚合酶的3’-5’外切酶活性，并通过对该聚合酶的DNA结合区域、dNTP催化位点，蛋白其他结构域的计算机模拟和预测，筛选出一定量的优化突变位点，并对突变后的K0D聚合酶进行实验筛选，得到一批可用的突变位点信息，并发现可以添加部分非天然氨基酸对K0D聚合酶进行改造，目前此类产品已应用于测序中（参见刘芬等的专利号）。
发明公开
本发明的一个目的提供一种重组型K㈤聚合酶。
本发明提供的重组型K㈤聚合酶，为一种蛋白，是如下A）或B）:
A）所示的蛋白为将野生型K㈤型DNA聚合酶氨基酸序列中第675、385、
710、674、735、736、606、709、347、349、590、676、389、589、680、384、496和383位这18位中至少一位的氨基酸残基进行修饰，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白；
B）所7K的蛋白为将A）所7K蛋白的氨基酸序列末端添加标签序列且具有DNA聚合酶活性的由A）衍生的蛋白质。
上述蛋白中，A）所示的蛋白为将野生型K0D型DNA聚合酶氨基酸序列中第675、385、710、674、735、736、606、709、347、349、590、676、389、589、680、384、496和383位这18位中至少2位的氨基酸残基进行修饰，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白。
上述蛋白中，A）所示的蛋白为将野生型K0D型DNA聚合酶氨基酸序列中第675、385、710、674、735、736、606、709、347、349、590、676、389、589、680、384、496和383位这18位中至少3位的氨基酸残基进行修饰，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白。
上述蛋白中，A）所示的蛋白为将野生型K0D型DNA聚合酶氨基酸序列中第675、385、710、674、735、736、606、709、347、349、590、676、389、589、680、384、496和383位这18位中至少4位的氨基酸残基进行修饰，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白。
上述蛋白中，A）所示的蛋白为将野生型K0D型DNA聚合酶氨基酸序列中第675、385、710、674、735、736、606、709、347、349、590、676、389、589、680、384、496和383位这18位中至少5位的氨基酸残基进行修饰，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白。
上述蛋白中，A）所示的蛋白为将野生型K0D型DNA聚合酶氨基酸序列中第675、385、710、674、735、736、606、709、347、349、590、676、389、589、680、384、496和383位这18位中至少6位的氨基酸残基进行修饰，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白。
上述蛋白中，所述氨基酸置换为如下至少一种：
第675位的丙氨酸置换为苯丙氨酸或甲硫氨酸；
第385位的谷氨酸置换为甲硫氨酸或氨酸；
第710位的异亮氨酸置换为丝氨酸或组氨酸；
第674位的赖氨酸置换为亮氨酸或半胱氨酸；
第735位的天冬酰胺置换为组氨酸；
第736位的谷氨酰胺置换为谷氨酸或丙氨酸；
第606位的精氨酸置换为组氨酸或甲硫氨酸；
第709位的精氨酸置换为丝氨酸或组氨酸；
第347位的丝氨酸置换为异亮氨酸或甲硫氨酸；
第349位的苏氨酸置换为苯丙氨酸或异亮氨酸；
第590位的苏氨酸置换为赖氨酸或亮氨酸；
第676位的苏氨酸置换为赖氨酸或酪氨酸；
第389位的缬氨酸置换为异亮氨酸或甲硫氨酸；
第589位的缬氨酸置换为组氨酸或谷氨酰胺；
第680位的缬氨酸置换为甲硫氨酸或谷氨酸；
第384位的酪氨酸置换为苯丙氨酸或氨酸；
第496位的酪氨酸置换为亮氨酸或异亮氨酸；
第383位的丝氨酸置换为苏氨酸。
上述蛋白中，所述野生型K0D型DNA聚合酶的氨基酸序列为序列1。
上述A）所示的蛋白为K0D型DNA聚合酶点突变体，具体为实施例中表1的单点突变体或者实施例中表2的多点突变体。
编码上述蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围。
含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系也是本发明保护的范围。
上述蛋白在作为DNA聚合酶中的应用也是本发明保护的范围；
或上述DNA分子或上述表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备DNA聚合酶中的应用也是本发明保护的范围。
上述蛋白或上述DNA分子或上述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞在测序中的应用也是本发明保护的范围；上述测序具体为DNA测序。
或上述蛋白或上述DNA分子或上述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞在制备用于测序的产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述产品为试剂盒。
本发明对K0D聚合酶行了动力学模拟与统计推断为基础，获得了可用于实
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