用于糖基化的蛋白质的电泳的去糖基化方法与流程

用于糖基化的蛋白质的电泳的去糖基化方法
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技术领域
3.本公开涉及生物化学、分子生物学和经由电泳分析蛋白质的领域。
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背景技术：

6.基于毛细管的电泳(ce)和基于微芯片的毛细管电泳(mce)是制药行业常用的分析方法，其用于基于蛋白质大小表征性蛋白质的完整性和纯度，并提供质量控制。虽然标准的、行业推荐的样品制备方法对许多蛋白质都很有效，但由于通过ce和mce的差的分离和定量，高度糖基化的蛋白质是有问题的。此外，mce图谱中的部分糖基化的峰和非糖基化的峰可能与杂质峰重叠，并且干扰定量。因此，本领域需要可以克服使用糖基化的蛋白质工作的挑战的另外的样品制备方法。本发明提供了用于标记高度糖基化的蛋白质的方法，所述方法可以用于制备通过电泳方法如ce和mce进行分析的蛋白质。

技术实现要素：

7.本公开提供了分析包含感兴趣的蛋白质的样品的方法，所述方法包含对所述样品进行变性、荧光标记、淬灭和去糖基化；其中所述变性、标记和淬灭步骤在去糖基化之前发生。本公开的分析样品的方法可以减少或消除由于内切糖苷酶引起的电泳图峰，并且可以减少游离染料干扰，从而提供快速、准确和高度可再现且高通量的方法，通过该方法可以分析糖蛋白。
8.本公开提供了分析包含感兴趣的蛋白质的样品的方法，所述方法包含：(a)使样品变性；(b)用荧光标记物标记样品以产生标记的样品；(c)淬灭标记的样品中未反应的荧光标记物；(d)用内切糖苷酶将标记的样品去糖基化；和(e)对标记的样品进行电泳；其中在步骤(d)中去糖基化之前，在步骤(a)至(c)中对样品进行变性、标记和淬灭。
9.在本公开的方法的一些实施例中，感兴趣的蛋白质包含至少一个糖基化位点。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质是糖基化的蛋白质。在一些实施例中，糖基化的蛋白质包含至少一个附接的聚糖。在一些实施例中，糖基化的蛋白质的总重量的至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％或至少10％包含聚糖(10％w/w)。
10.在本公开的方法的一些实施例中，感兴趣的蛋白质包含抗原结合结构域。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质包含抗体、抗体片段或scfv。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质
包含fc结构域。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质包含受体融合蛋白。在一些实施例中，受体融合蛋白是受体-fc融合蛋白或可溶性tcr-fc融合蛋白。在一些实施例中，受体融合蛋白是陷阱蛋白或微型陷阱蛋白。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质是陷阱蛋白或微型陷阱蛋白。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质是重组人蛋白质。
11.在本公开的方法的一些实施例中，糖基化位点包含asn-x-ser/thr共有序列。在一些实施例中，至少一个附接的聚糖是n连接的。在一些实施例中，至少一个附接的聚糖与糖基化的蛋白质中的天冬酰胺n连接。在一些实施例中，内切糖苷酶催化n-连接的聚糖的去糖基化。在一些实施例中，内切糖苷酶选自由肽-n-糖苷酶f(pngase f)、内切糖苷酶h(endo h)、内切糖苷酶s(endo s)、内切糖苷酶d、内切糖苷酶f1、内切糖苷酶f2和内切糖苷酶f4组成的组。在一些实施例中，内切糖苷酶是pngase f。在一些实施例中，pngase f是快速pngase f。在一些实施例中，快速pngase f是非还原性的。在一些实施例中，pngase f是还原性的。
12.在本公开的方法的一些实施例中，使样品去糖基化包含将样品加热到约35℃持续30分钟。在一些实施例中，使样品去糖基化包含将样品加热到约50℃持续10至30分钟。在一些实施例中，使样品去糖基化包含将样品加热到约50℃持续10分钟。在一些实施例中，使样品去糖基化包含反应混合物，所述反应混合物在10μl反应体积(不包含快速pngase f的体积)中包含0.2-1.5mg的感兴趣的标记的蛋白质和1-5μl的快速pngase f。在一些实施例中，反应混合物包含0.2mg的感兴趣的标记的蛋白质。在一些实施例中，反应混合物包含5μl的快速pngase f。在一些实施例中，反应混合物包含缓冲液。
13.在本公开的方法的一些实施例中，至少一种聚糖是o-连接的聚糖。在一些实施例中，内切糖苷酶催化o-连接的聚糖的去糖基化。在一些实施例中，内切糖苷酶包含内切-α-n-乙酰半乳糖胺酶(o-糖苷酶)。
14.在本公开的方法的一些实施例中，用荧光标记物标记样品包含将样品加热到约35℃持续10-30分钟。在一些实施例中，用荧光标记标记样品包含将样品加热到约35℃持续15分钟。
15.在本公开的方法的一些实施例中，使用还原性溶液使样品变性。在一些实施例中，还原性溶液包含二硫苏糖醇(dtt)。在一些实施例中，使用非还原性溶液使样品变性。在一些实施例中，非还原性溶液包含碘乙酰胺(iam)。在一些实施例中，使样品变性包含将样品加热到40℃至99℃持续1分钟至5小时。在一些实施例中，使样品变性包含将样品加热到50℃至99℃持续1分钟至60分钟。
16.在本公开的方法的一些实施例中，淬灭未反应的荧光标记物包含添加终止溶液。
17.在本公开的方法的一些实施例中，所述方法进一步包含与样品平行地分析参照标准品。
18.在本公开的方法的一些实施例中，电泳选自由凝胶电泳、等电聚焦、毛细管电泳(ce)或微芯片毛细管电泳(mce)组成的组。在一些实施例中，电泳是mce。在一些实施例中，使用mce仪器进行mce。
19.在本公开的方法的一些实施例中，当与使用在去糖基化后标记的样品产生的电泳图相比时，所述方法导致在小于20kda范围内的游离染料干扰减少和电泳图中减少或不存在的内切糖苷酶峰。在一些实施例中，当与使用在去糖基化后标记的样品产生的电泳图相
比时，内切糖苷酶峰减少至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在一些实施例中，当与使用在去糖基化后标记的样品生成的电泳图相比时，在电泳图中不存在内切糖苷酶峰。
20.本公开提供了确定感兴趣的蛋白质的稳定性的方法，其包含：(a)对包含感兴趣的蛋白质的样品进行应激；(b)使应激的样品和包含感兴趣的蛋白质的非应激的样品变性；(c)用荧光标记物标记应激的样品和非应激的样品以产生标记的应激的样品和标记的非应激的样品；(d)猝灭标记的应激的样品和标记的非应激的样品中未反应的荧光标记物；(e)用内切糖苷酶对标记的应激的样品和标记的非应激的样品进行去糖基化；(f)对标记的应激的样品和标记的非应激的样品进行微芯片毛细管电泳(mce)，以产生应激的样品和非应激的样品的电泳图；以及(g)比较来自应激的样品和非应激的样品的电泳图，从而确定感兴趣的蛋白质的稳定性；其中在步骤(e)中去糖基化之前，在步骤(b)至(d)中对应激的样品和非应激的样品进行变性、标记和猝灭。
21.在本公开的方法的一些实施例中，对样品进行应激包含对样品进行热应激。在一些实施例中，对样品进行热应激包含将样品保持在约30℃至约45℃之间持续至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周或至少8周。
22.在本公开的方法的一些实施例中，对样品进行应激包含至少一个冷冻/解冻循环。
23.在本公开的方法的一些实施例中，对样品进行应激包含将样品暴露于储存条件。在一些实施例中，储存条件包含约-80℃至-30℃的温度，持续至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少8个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或至少30个月。在一些实施例中，储存条件包含约2℃至8℃的温度，持续至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少8个月、至少12个月或至少18个月。
24.在本公开的方法的一些实施例中，对样品进行应激包含机械搅动样品。
25.在本公开的方法的一些实施例中，对样品进行应激包含冻干和再水合样品。
26.在本公开的方法的一些实施例中，对样品进行应激包含将样品暴露于光、辐射、单线态氧物质、自由基、高ph条件或低ph条件。
27.在本公开的方法的一些实施例中，感兴趣的蛋白质包含至少一个糖基化位点。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质是糖基化的蛋白质。在一些实施例中，糖基化的蛋白质包含至少一个附接的聚糖。在一些实施例中，糖基化的蛋白质的总重量的至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％或至少10％包含聚糖(10％w/w)。在一些实施例中，糖基化的蛋白质的总重量的至少10％包含聚糖(10％w/w)。
28.在本公开的方法的一些实施例中，感兴趣的蛋白质包含抗原结合结构域。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质包含抗体、抗体片段或scfv。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质包含fc结构域。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质包含受体融合蛋白。在一些实施例中，受体融合蛋白是受体-fc融合蛋白或可溶性tcr-fc融合蛋白。在一些实施例中，受体融合蛋白是陷阱蛋白或微型陷阱蛋白。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质是陷阱蛋白或微型陷阱蛋白。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质是重组人蛋白质。
29.在本公开的方法的一些实施例中，糖基化位点包含asn-x-ser/thr共有序列。在一些实施例中，至少一个附接的聚糖是n连接的。在一些实施例中，至少一个附接的聚糖与糖
基化的蛋白质中的天冬酰胺n连接。在一些实施例中，内切糖苷酶催化n-连接的聚糖的去糖基化。在一些实施例中，内切糖苷酶选自由肽-n-糖苷酶f(pngase f)、内切糖苷酶h(endo h)、内切糖苷酶s(endo s)、内切糖苷酶d、内切糖苷酶f1、内切糖苷酶f2和内切糖苷酶f4组成的组。在一些实施例中，内切糖苷酶是pngase f。在一些实施例中，pngase f是快速pngase f。在一些实施例中，快速pngase f是非还原性的。在一些实施例中，快速pngase f是还原性的。
30.在本公开的方法的一些实施例中，对应激的样品和非应激的样品进行去糖基化包含将样品加热到约35℃持续30分钟。在一些实施例中，对应激的样品和非应激的样品进行去糖基化包含将样品加热到约50℃持续10分钟至30分钟。在一些实施例中，对应激的样品和非应激的样品进行去糖基化包含将样品加热到约50℃持续10分钟。在一些实施例中，对所述应激的样品和非应激的样品进行去糖基化包含在10μl反应体积(不包含快速pngase f的体积)中对于包含0.2-1.5mg的感兴趣的标记的蛋白质和1-5μl的快速pngase f的每个样品的反应混合物。在一些实施例中，用于应激的样品和非应激的样品中的每一个的反应混合物包含5μl的快速pngase f。在一些实施方案中，应激的样品和非应激的样品中的每一个包含0.2mg的感兴趣的标记的蛋白质。在一些实施例中，用于应激的样品和非应激的样品中的每一个的反应混合物包含缓冲液。
31.在本公开的方法的一些实施例中，至少一种聚糖是o-连接的聚糖。在一些实施例中，内切糖苷酶催化o-连接的聚糖的去糖基化。在一些实施例中，内切糖苷酶包含内切-α-n-乙酰半乳糖胺酶(o-糖苷酶)。
32.在本公开的方法的一些实施例中，用荧光标记物标记应激的样品和非应激的样品包含将每个样品加热到约35℃持续30分钟。
33.在本公开的方法的一些实施例中，使用还原性溶液使应激的样品和非应激的样品变性。在一些实施例中，还原性溶液包含二硫苏糖醇(dtt)。在一些实施例中，使用非还原性溶液使应激的样品和非应激的样品变性。在一些实施例中，非还原性溶液包含碘乙酰胺(iam)。在一些实施例中，使应激的样品和非应激的样品变性包含将样品加热到40℃至99℃持续1分钟至5小时。在一些实施例中，使应激的样品和非应激的样品变性包含将样品加热到50℃至99℃持续1分钟至60分钟。
34.在本公开的方法的一些实施例中，淬灭未反应的荧光标记物包含添加终止溶液。
35.在本公开的方法的一些实施例中，所述方法进一步包含与应激的样品和非应激的样品平行地分析参照标准品。在一些实施例中，比较应激的样品和非应激的样品的电泳图包含比较峰的数目、高度、位置、面积或其组合。
附图说明
36.图1是示出方法a，没有去糖基化；方法b，在标记前的去糖基化；以及方法c，在标记后去糖基化的方案的图。nr：非还原性的，r：还原性的，mc：微芯片毛细管电泳。
37.图2是在非还原条件下使用蛋白质1，使用无去糖基化的方案(方法a，以红显示)和在蛋白质标记前具有去糖基化的方案(方法b，以蓝显示)产生的电泳图。数字峰标记物指示如通过微芯片毛细管电泳(mce)测量的蛋白质的分子量。快速pngase f(pngase)峰出现在电泳图中指定的位置。
38.图3示出了在非还原的条件下使用蛋白质1使用方法b(在标记前的去糖基化)产生的三个电泳图。在分析之前，在37℃下用热应激处理蛋白质1样品，持续无时间(0，红，顶部)、2周(蓝，中间)或4周(黑，底部)。低分子量1峰(lmw 1)峰随应激增加，并与pngase峰合并。
39.图4是在还原性条件下使用蛋白质1，使用无去糖基化的方案(方法a，以红显示)和在蛋白质标记前具有去糖基化的方案(方法b，以蓝显示)产生的电泳图。数字峰标记物指示如通过mce测量的蛋白质的分子量。pngase f峰出现在方法b电泳图中，如所示。灰阴影框指示游离染料峰。
40.图5是用蛋白质1生成的一对电泳图，其中蛋白质1在标记后被去糖基化(方法c)。顶部：用1μl的快速
tm pngase在50℃下进行去糖基化反应持续10、15、20和30分钟。底部：用2μl的快速
tm pngase在50℃下进行去糖基化反应持续10、15、20和30分钟。
41.图6是使用方法c和蛋白质1生成的电泳图，示出了在50℃下保持10分钟的反应中，用1μl、2μl、3μl或4μl的快速
tm pngase f的去糖基化的结果。插图显示了蛋白质1不完全去糖基化的峰(右肩至主峰)，其中箭头指示糖基化的蛋白随着快速
tm pngase的量增加而减少。游离染料峰由灰阴影框指示。mp，主峰；lmw 1，低分子量1峰。
42.图7是使用方法c(在标记后去糖基化)和蛋白质1生成的一系列四个电泳图，其用1μl、2μl、3μl或4μl的快速
tm pngase(从上到下)去糖基化。指示低分子量(lmw)峰1-5、主峰(mp)和高分子量峰(hmw)。
43.图8是使用通过在37℃下保持蛋白质持续4周(37c 4w，黑)热应激的蛋白质1和未应激的蛋白质1(t＝0，红)由方法c(在标记后去糖基化)产生的电泳图。使用快速
tm pngase f进行去糖基化。
44.图9是使用蛋白质2生成的电泳图，其比较在非还原的条件下在去糖基化(方法c)的情况下和在没有去糖基化(方法a)的情况下标记的蛋白质2。pngase f具有37kda的预期大小，并且该峰不存在。游离染料峰由阴影框指示。
45.图10是使用蛋白质3产生的电泳图，其比较在非还原的条件下在标记后的去糖基化(蓝，方法c)的情况下和在没有去糖基化处理(红，方法a)的情况下处理的蛋白质3。数字峰标记物指示通过mce测量的蛋白质和蛋白质片段的分子量。
46.图11是比较蛋白质3的电泳图，其在还原条件下在标记后的去糖基化(蓝，方法c)的情况下和在没有去糖基化(红，方法a)的情况下处理。数字峰标记物指示通过mce测量的蛋白质和蛋白质片段的分子量。
47.图12是比较在没有去糖基化(方法a，红)的情况下的蛋白质4和在标记后去糖基化(方法c，蓝)的蛋白质4的电泳图。使用非还原(nr)条件使蛋白质4变性。数字峰标记物指示通过mce测量的分子量。lmw：低分子量；dgmp：去糖基化的主峰；gmp：糖基化的主峰。游离染料峰由阴影框指示。
48.图13是比较在没有去糖基化(方法a，红)的情况下标记的蛋白质4和在标记后去糖基化(方法c，蓝)的蛋白质4的电泳图。使用还原(r)条件使蛋白质4变性。lc：轻链；dhc：去糖基化的重链；ghc：糖基化的重链。游离染料峰由阴影框指示。
49.图14示出了使用方法c和蛋白质1测定在非还原的条件下产生的光应激对蛋白质稳定性的影响的三个电泳图。在120万勒克斯小时(mlh)累积曝光(蓝，中间)和2.4mlh累
积曝光(黑，底部)的冷白(cw)荧光灯下对蛋白质1进行光应激，并且与未应激的蛋白质1(红，顶部)进行比较。使用快速
tm pngase f进行去糖基化。lmw：低分子量；mp：主峰；hmw：高分子量。
50.图15示出了使用方法c和蛋白质1测定在非还原的条件下产生的光应激对蛋白质稳定性的影响的三个电泳图。在200瓦时/平方米(蓝，中图)和400瓦时/平方米(黑，下图)的综合近紫外线(uva)能量下对蛋白质1进行光应激，并且与未应激的蛋白质1(红，上图)进行比较。使用快速
tm pngase f进行去糖基化。lmw：低分子量；mp：主峰；hmw：高分子量。
具体实施方式
51.本公开提供了用于制备包含感兴趣的蛋白质的样品以通过电泳进行分析的新的方法。在本文提供的方法中，使感兴趣的蛋白质变性，然后使用荧光染料对蛋白质进行共价标记，并且随后淬灭标记反应。在标记之后，使标记的蛋白质与酶如内切糖苷酶接触，以从感兴趣的蛋白质去除聚糖，而无需进一步纯化。与制备用于电泳的糖基化的蛋白质的先前方法(其在标记前使蛋白质去糖基化)不同，本文所述的方法允许基于质量清楚地分离蛋白质和肽种类。这些方法还消除了微芯片电泳(mce)电泳图中在去糖基化中使用的酶的干扰以及来自标记反应的游离染料。所述方法快速、高度可再现且高通量，并且已成功用于分析糖基化的蛋白质。不希望受理论的束缚，认为本文所述的方法对于高度糖基化的蛋白质是有利的，因为高度糖基化干扰蛋白质在mce或毛细管电泳(ce)分析平台中的迁移，导致蛋白质分子量的不正确测量和不精确的电泳图峰。本文所述的方法可以用于平台方法，所述平台方法适用于通过例如ce和mce的方法分析的任何糖基化的蛋白质，并且用于表征蛋白质或用于质量控制目的。例如，本文所述的方法可以用于测量感兴趣的蛋白质在经受各种条件(例如在各种温度下延长的保持时间)或不同制剂时的稳定性。
52.因此，本公开提供了制备包含感兴趣的蛋白质的样品以使用电泳进行分析的方法，包含(a)使样品变性；(b)用荧光标记物标记样品以产生标记的样品；(c)猝灭标记的样品中未反应的荧光标记物；(d)用内切糖苷酶将标记的样品去糖基化；和(e)对标记的样品进行电泳；其中在步骤(d)中去糖基化之前，在步骤(b)和(c)中对样品进行标记和猝灭。在一些实施例中，电泳是微芯片毛细管电泳(mce)，并且输出是电泳图。
53.定义
54.在描述目前要求保护的发明的上下文中(尤其是在权利要求的上下文中)术语“一个”、“一种”、“所述”和类似的指代词的使用应被解释为涵盖单数和复数两者，除非本文另外指明或与上下文明显矛盾。
55.除非本文另外指明，否则本文中数值范围的列举仅旨在作为分别指代落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值都被并入说明书中，如同所述值在本文中被单独列举那样。
56.术语“约”的使用旨在描述高于或低于所述值的大约+/-10％范围内的值；在其他实施例中，所述值可以在高于或低于所述值的大约+/-5％范围内的值的范围内；在其他实施例中，所述值可以在高于或低于所述值的大约+/-2％范围内的值的范围内；在其他实施例中，所述值可以在高于或低于所述值的大约+/-1％范围内的值的范围内。前述范围旨在通过上下文明确，并且不暗示进一步的限制。
57.如本文所使用的，“蛋白质”是指包含两个或更多个通过肽键彼此连接的氨基酸残基的分子。蛋白质包括多肽和肽，并且还可以包含修饰，诸如糖基化、脂质附接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、烷基化、羟基化和adp-核糖基化。蛋白质可以具有科学或商业意义，包括基于蛋白质的药物，并且蛋白质包括酶、配体、受体、抗体以及嵌合或融合蛋白等等。使用众所周知的细胞培养方法由不同类型的重组细胞产生蛋白质，并且在它可以作为附加体存在或被整合到细胞的基因组中的情况下，通常通过基因工程技术(例如，诸如编码嵌合蛋白的序列或密码子优化的序列，无内含子的序列，等)被引入到细胞中。
58.除非本文另外指明或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行。除非另外要求，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实施是必不可少的。
59.本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度与每个单独的出版物、专利或专利申请被具体且单独地指示通过引用并入相同。
60.变性
61.本公开提供了使样品中感兴趣的蛋白质变性的方法。使蛋白质变性涉及在不足以破坏肽键的条件下破坏二级和三级蛋白质结构，保持一级结构完整。
62.在还原条件和非还原条件下使感兴趣的蛋白质变性的方法都在本公开的范围内。
63.蛋白质还原剂是破坏二硫键的药剂。这些二硫键可以在单个多肽内，或者可以单独的多肽上编码的蛋白质的多个亚基之间。破坏亚基之间的二硫键允许单独地分析多亚基蛋白的单个亚基。还原剂将是本领域普通技术人员已知的。示例性的还原剂包括但不限于二硫苏糖醇(dtt，cas 3483-12-3)、β-巯基乙醇(bme，2bme，2-me，b-mer，cas 60-24-2)、2-氨基乙硫醇(2-mea-hcl，也被称为半胱胺-hcl，cas 156-57-0)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep，cas 5961-85-3)、半胱氨酸盐酸盐(cys-hcl，cas 52-89-1)或2-巯基乙磺酸钠盐(mesna)。用于还原蛋白质键的其它方法在本领域中是已知的，例如包含树脂的固定化的还原剂柱，基于硫醇的还原剂已经被固定到该树脂上，以使得能够固相还原肽和蛋白质二硫键。还设想了还原剂，包括氧化剂，其适合用于减少多肽之间的化学相互作用。
64.在一些实施例中，感兴趣的蛋白质使用还原性溶液变性。在一些实施例中，还原性溶液包含135至155mm的二硫苏糖醇(dtt)。在一些实施例中，还原性溶液还包含磷酸钠和十二烷基硫酸锂。在一些实施例中，还原性溶液包含0.69％的十二烷基硫酸锂(lds)、69mm的磷酸钠和142mm的二硫苏糖醇或者基本上由0.69％的十二烷基硫酸锂(lds)、69mm的磷酸钠和142mm的二硫苏糖醇组成。在一些实施例中，还原性溶液包含40-120mm的dtt、40-80mm的磷酸钠和0.5％至2.0％的lds。在一些实施例中，还原性溶液包含60-100mm的dtt、50-70mm的磷酸钠和0.75％至1.5％的lds。在一些实施例中，还原性溶液包含约80mm的dtt、约60mm的磷酸钠和约1.2％的lds。在一些实施例中，将还原性溶液以按体积计约1:4的比率添加到包含感兴趣的蛋白质的样品中。
65.在一些实施例中，使用非还原性溶液，即在将二硫键保留在感兴趣的蛋白质中的条件下，使感兴趣的蛋白质变性。在一些实施例中，非还原性溶液包含碘乙酰胺(iam)。在一些实施例中，非还原性溶液包含100mm至200mm的碘乙酰胺。在一些实施例中，非还原性溶液进一步包含磷酸钠和十二烷基硫酸锂(lds)。在一些实施例中，非还原性溶液包含166mm的
连接的聚糖包括但不限于o-n-乙酰半乳糖胺(o-galnac)、o-n-乙酰葡糖胺(o-glcnac)、o-甘露糖、o-半乳糖、o-岩藻糖和o-葡萄糖。
72.内切糖苷酶是水解寡糖中内部糖苷键的酶。当寡糖是糖蛋白的一部分时，寡糖由此从糖蛋白中释放。
73.如本文所使用的，“内切糖苷酶”是指从糖蛋白或糖脂中释放聚糖的酶。内切糖苷酶可以切割作为非末端残基的残基之间的多糖变化，因此能够从其同源蛋白质缀合物中释放长链碳水化合物。示例性的内切糖苷酶包括但不限于肽-n-糖苷酶f(pngase f)、内切糖苷酶h(endo h)、内切糖苷酶s(endo s)。内切糖苷酶d、内切糖苷酶f1、内切糖苷酶f2、内切糖苷酶f3、o-糖苷酶和内切β-半乳糖苷酶。
74.在一些实施例中，内切糖苷酶催化n-连接的聚糖的去糖基化。靶向n-连接的聚糖的示例性的内切糖苷酶包括但不限于肽-n-糖苷酶f(pngase f)、内切糖苷酶h(endo h)、内切糖苷酶s(endo s)、内切糖苷酶d、内切糖苷酶f1、内切糖苷酶f2和内切糖苷酶f4。在一些实施例(例如其中所述感兴趣的蛋白质包含n-连接的聚糖的那些实施例)中，所述内切糖苷酶是pngase f。
75.在一些实施例中，内切糖苷酶催化o-连接的聚糖的去糖基化。靶向o-连接的聚糖的示例性的内切糖苷酶包括但不限于内切-α-n-乙酰半乳糖胺酶(o-糖苷酶)。
76.在一些实施例中，内切糖苷酶是pngase f。pngase f是一种在n-连接的糖蛋白中最里面的n-乙酰基-d-葡糖胺(glcnac)和高甘露糖、杂合和复合寡糖的天冬酰胺残基之间裂解的酰胺酶。在一些实施例中，pngase f是重组的。在一些实施例中，pngase f是快速
tm pnpgase f。快速
tm pngase f是本领域已知的，并且可从新英格兰biolabs和其它供应商获得。在一些实施例中，快速
tm pngase f呈非还原形式，其保留感兴趣的蛋白质中的二硫键。在一些实施例中，快速
tm pngase f呈还原形式，其不保留感兴趣的蛋白质中的二硫键。
77.在一些实施例中，对样品进行去糖基化包含反应混合物，所述反应混合物包含0.1mg至3.0mg的感兴趣的标记的蛋白质。在一些实施例中，反应混合物包含0.1mg至2.0mg的感兴趣的标记的蛋白质。在一些实施例中，反应混合物包含0.1mg至1.5mg的感兴趣的蛋白质。在一些实施例中，反应混合物包含0.5mg至1.5mg之间的感兴趣的蛋白质。在一些实施例中，反应混合物包含0.2mg的感兴趣的标记的蛋白质。在一些实施例中，反应混合物在10μl反应体积(不包含酶的体积)中包含1μl至7μl的快速
tm pngase f酶。在一些实施例中，反应混合物在10μl反应体积(不包含酶的体积)中包括1μl至5μl的快速
tm pngase f酶。在一些实施例中，反应混合物包含1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl或7μl的添加到包含感兴趣的标记的蛋白质中的10μl体积中的快速
tm pngase f酶。在一些实施例中，反应混合物在10μl反应体积(不包含酶的体积)中包含5μl的快速
tm pngase f酶。在一些实施例中，反应混合物包含添加到包含感兴趣的标记的蛋白质中的10μl体积中的5μl快速
tm pngase f酶。在一些实施例中，反应混合物包含另外的缓冲液，例如促进pngase f酶的作用的反应缓冲液。在一些实施例中，反应混合物不包含另外的缓冲液。
78.在一些实施例(例如其中内切糖苷酶是pngase f的那些实施例)中，使样品去糖基化包含将样品加热到25℃至65℃持续100分钟至60分钟。在一些实施例中，使样品去糖基化包含将样品加热到30℃至50℃持续20分钟至40分钟。在一些实施例中，使样品去糖基化包含将样品加热到35℃持续30分钟。
79.在一些实施例(例如其中内切糖苷酶是快速
tm pngase f的那些实施例)中，使样品去糖基化包含将样品加热到50℃持续10分钟至30分钟。在一些实施例中，使样品去糖基化包含将样品加热到50℃持续10分钟。
80.蛋白质标记
81.本公开提供了标记感兴趣的蛋白质的方法。在一些实施例中，在去糖基化之前标记感兴趣的蛋白质。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质用荧光标记物(例如荧光染料)标记。任何合适的标记物都被设想为在本公开的范围内。
82.如本文所使用的，“可检测的标记物”或“标记物”是指用于促进目标物质(例如感兴趣的蛋白质)的鉴定和/或定量的化学品。说明性的标记物包括可以直接观察或测量或间接观察或测量的标记物。这类标记物包括但不限于可以用辐射计数装置测量的放射性标记物；可以用分光光度计目视观察或测量的颜料、染料或其他原；可以通过基于光电倍增管的仪器或照相胶片测量的化学发光标记物，可以用自旋标记分析仪测量的自旋标记物；和荧光部分，其中输出信号通过合适的分子加合物的激发而产生，并且可以通过被染料吸收的光的激发而显现，或者可以用标准荧光计或成像系统测量。标记物可以是发光物质，例如磷光体或荧光原；生物发光物质；化学发光物质，其中通过信号化合物的化学修饰产生输出信号；含金属的物质；或酶，其中发生依赖于酶的二次信号产生，例如从无底物形成有产物或从合适的前体形成自发化学发光产物。术语标记物还可以指“标签”或半抗原，其可以选择性地结合到标记的分子上，使得标记的分子在随后添加时用于产生可检测的信号。
83.许多标记物是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于微粒、荧光染料、半抗原、酶和它们的生、荧光和化学发光底物以及其它标记物，所述其他标记物在richard p.haugland的《荧光探针和研究化学品的分子探针手册》(molecular probes handbook of fluorescent probes and research chemicals)第6版编写(1996)及其随后分别于1999年11月和2001年5月发行在cd rom上的第7版和第8版更新(其内容通过引用并入)中以及在其他公开的来源中描述。
84.示例性的荧光标记物包括但不限于荧光染料。如本文所使用的，“荧光染料”是指吸收光并以更长的波长发射光的非蛋白质分子。示例性的荧光染料包括但不限于alexa染料、荧光素异硫氰酸酯(fitc)、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(tritc)、dylight荧光剂、cy染料、ir染料、hilyte染料、磺化和/或聚乙二醇化的香豆素染料、磺化和/或聚乙二醇化的呫吨染料、磺化和/或聚乙二醇化的菁染料以及磺化和/或聚乙二醇化的芘染料。
85.另外的可检测的标记物包括但不限于dyomics dy-631nhs ester。可以使用的其它可检测的标记物包括其它染料、荧光团、发团、质量标签、量子点等，以及在美国专利第6,924,372号(其通过引用以其整体并入)中描述的那些。
86.示例性的荧光标记物还包括但不限于生物荧光团(例如绿荧光蛋白质)以及纳米级晶体(例如量子点)。
87.另外的示例性荧光标记物可从perkin elmer获得，作为pico蛋白质试剂盒(也被称为蛋白质pico测定试剂盒，零件号760498)的一部分。在一些实施例中，荧光标记物包含perkin elmer pico标记染料。在一些实施例中，标记感兴趣的蛋白质包含以按体积计约1:1的比率将4-20μm的pico染料溶液添加到包含感兴趣的蛋白质的样品中。在一些实施例中，标记感兴趣的蛋白质向包含感兴趣的蛋白质的样品中添加4μm、5μm、6μm、10μm、12μm、14μm、
15μm、16μm、18μm、20μm或25μm的pico染料溶液。在一些实施例中，将pico染料溶液以按体积计约1:5染料与样品、按体积计1:4染料与样品、按体积计1:3染料与样品、按体积计1:2染料与样品、按体积计1:1染料与样品、按体积计2:1染料与样品、按体积计3:1染料与样品、按体积计4:1染料与样品或按体积计5:1染料与样品的比率添加到包含感兴趣的蛋白质的样品中。在一些实施例中，标记感兴趣的蛋白质包含以按体积计约1:1的比率将16μm的pico染料溶液添加到包含感兴趣的蛋白质的样品中。在一些实施例中，所述方法包含加热所述样品和染料。
88.在一些实施例中，荧光标记物或染料被共价附接到感兴趣的蛋白质。在一些实施例中，荧光标记物包含胺反应性基团，并且被共价附接到感兴趣的蛋白质中的游离胺。在一些实施例中，标记物通过高亲和力相互作用被非共价附接到感兴趣的蛋白质。
89.用于蛋白质标记的额外合适的试剂盒将是本领域普通技术人员已知的。示例性的试剂盒包括但不限于来自medchemexpress的抗体/蛋白质标记试剂盒-fitc和(快速)alexa缀合试剂盒。
90.任何共价附接的荧光标记物和附接荧光标记物的任何方法被设想为在本方法的范围内。
91.在一些实施例中，将样品和染料加热到约30℃至40℃持续约5分钟至40分钟。在一些实施例中，将样品和染料加热到约30℃至40℃持续约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟或约40分钟。在一些实施例中，将样品和染料加热到约35℃持续约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟或约40分钟。在一些实施例中，将样品和标记物加热到约35℃持续约15分钟。该加热步骤可以产生包含变性的感兴趣的标记的蛋白质的样品。可任选地从样品中去除过量的标记物，例如通过使用自旋过滤器。
92.在一些实施例中，标记反应在去糖基化反应(淬灭)之前停止。例如，在其中荧光标记物是perkin elmer pico标记染料的那些实施例中，可以通过向标记反应中加入等体积的perkin elmer pico终止缓冲液来停止标记反应。在一些实施例中，通过向标记反应中加入5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、11μl、12μl、13μl、14μl、15μl、16μl、17μl、18μl、19μl或20μl的适当的终止溶液来淬灭标记反应。在一些实施例中，染料是perkin elmer pico标记染料，并且通过向标记反应中添加5μl的perkin elmer pico终止溶液来淬灭标记反应。另外的示例性的终止缓冲液，例如当标记物包含胺反应性荧光染料时，包括1.5m羟胺，ph 8.5。普通技术人员将能够选择用于各种染料标记反应的适当的终止缓冲液。不希望受理论的束缚，认为淬灭所述标记反应防止了用于后续去糖基化步骤的内切糖苷酶的标记。这防止或减少用于使标记的样品可视化的电泳图中的标记的内切糖苷酶峰。
93.感兴趣的蛋白质
94.本公开提供了制备包含感兴趣的蛋白质的样品以用于使用电泳进行分析的方法。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质是糖基化的。在一些实施例中，所述方法包含标记感兴趣的蛋白质，随后进行去糖基化。
95.包含翻译后修饰(例如n-连接的或o-连接的糖基化)的所有感兴趣的蛋白质都被认为在本公开的范围内。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质是性蛋白质，例如性抗体，其可以是药物物质、配制的药物物质或药物产品。
96.在一些实施例中，感兴趣的蛋白质包含抗原结合结构域。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质是融合蛋白。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质包含抗体、抗体片段或单链可变片段(scfv)。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质是抗体、抗体片段或scfv。
97.在一些实施例中，感兴趣的蛋白质包含重组人蛋白质。例如，感兴趣的蛋白质可以包含人抗体或抗体片段，或人源化抗体或抗体片段。
98.如本文所使用的，“抗体”是指由四条多肽链(通过二硫键相互连接的两条重(h)链和两条轻(l)链)组成的免疫球蛋白分子。每条重链都具有重链可变区(hcvr或vh)和重链恒定区。重链恒定区含有三个结构域：ch1、ch2和ch3。每条轻链都具有轻链可变区和轻链恒定区。轻链恒定区由一个结构域(cl)组成。vh和vl区还可以细分为高变区(称为互补决定区(cdr))，所述高变区之间散布有更保守的区域(称为构架区(fr))。每个vh和vl由从氨基末端到羧基末端按照下述次序排列的三个cdr和四个fr组成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。术语“抗体”包括对任何同种型或亚类的糖基化的和非糖基化的免疫球蛋白的提及。术语“抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的抗体分子，诸如从转染以表达抗体的宿主细胞中分离的抗体。术语抗体还包括双特异性抗体，所述双特异性抗体包括可以结合至多于一个不同的表位的异源四聚体免疫球蛋白。双特异性抗体一般描述于美国专利第8,586,713号中，所述专利通过引用并入本技术中。
99.抗体(或“抗体片段”)的术语“抗原结合部分”是指保留特异性地结合至抗原的能力的抗体的一个或多个片段。在抗体的术语“抗原结合部分”内涵盖的结合片段的实例包括(i)fab片段，由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab')2片段，包含通过在铰链区处的二硫键连接的两个fab片段的二价片段；(iii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iv)由抗体的单个臂的vl和vh结构域组成的fv片段，(v)由vh结构域组成的dab片段(ward等人(1989)《自然(nature)》241:544-546)，(vi)经分离的cdr，以及(vii)scfv，其由fv片段的两个结构域vl和vh组成，所述两个结构域vl和vh通过合成接头连接以形成单条蛋白质链，其中vl和vh区配对以形成单价分子。其它形式的单链抗体例如双抗体也涵盖在术语“抗体”下(参见例如holliger等人.(1993)《美国国家科学院院刊》90:6444-6448；poljak等人.(1994)《结构(structure)》2:1 121-1123)。
100.更进一步，抗体或其抗原结合部分可以是更大的免疫粘附分子的一部分，其通过抗体或抗体部分与一种或多种其它蛋白质或肽的共价或非共价缔合形成。此类免疫粘附分子的实例包括使用链霉亲和素核心区来制备四聚体scfv分子(kipriyanov等人.(1995)《人抗体和杂交瘤(human antibodies and hybridomas)》6:93-101)，以及使用半胱氨酸残基、标记肽和c-末端多组氨酸标签来制备二价和生物素化的scfv分子(kipriyanov等人.(1994)《分子免疫学(mol.immunol.)》31:1047-1058)。抗体部分，如fab和f(ab')2片段，可以使用常规技术从全抗体制备，如通过木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化全抗体。此外，可以使用本领域中通常已知的标准重组dna技术来获得抗体、抗体部分和免疫粘附分子(参见sambrook等人,1989)。
101.术语“人抗体”包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括例如在cdr中以及特别是在cdr3中，不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。
102.本文所用的术语“人源化抗体”包括这样的抗体，其中来自另一种哺乳动物物种
(如小鼠)的种系的cdr序列已被移植到人框架序列上，或者以其他方式被修饰以增加其与在人类中天然产生的抗体变体的相似性。
103.在一些实施例中，感兴趣的蛋白质是抗体。在一些实施例中，抗体选自由以下组成的组：抗程序性细胞死亡1抗体(例如，抗pd1抗体，如在美国专利申请公开号us2015/0203579a1中所述)、抗程序性细胞死亡配体-1(例如，抗pd-l1抗体，如在美国专利申请公开号us2015/0203580a1中所述)、抗d114抗体、抗血管生成素2抗体(例如，抗ang2抗体，如在美国专利第9,402,898号中所述)、抗血管生成素样3抗体(例如，抗angpt13抗体，如在美国专利第9,018,356号中所述)、抗血小板源性生长因子受体抗体(例如，抗pdgfr抗体，如在美国专利第9,265,827号中所述)、抗erb3抗体、抗催乳素受体抗体(例如，抗prlr抗体，如在美国专利第9,302,015号中所述)、抗补体5抗体(例如，抗cs抗体，如在美国专利申请公开号us2015/0313194a1中所述)、抗tnf抗体、抗表皮生长因子受体抗体(例如，抗egfr抗体，如在美国专利第9,132,192号中所述，或者抗egfrviii抗体，如在美国专利申请公开号us2015/0259423a1中所述)、抗前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin-9抗体(例如，抗pcsk9抗体，如在美国专利第8,062,640号或美国专利第9,540,449号中所述)、抗生长和分化因子-8抗体(例如，抗gdf8抗体，也被称为抗肌肉生长抑制素抗体，如在美国专利第8,871,209号或第9,260,515号中所述)、抗胰高血糖素受体(例如，抗gcgr抗体，如在美国专利申请公开号us2015/0337045a1或us2016/0075778a1中所述)、抗vegf抗体、抗il1r抗体、白介素4受体抗体(例如，抗il4r抗体，如在美国专利申请公开号us2014/0271681a1或美国专利第8,735,095号或第8,945,559号中所述)、抗白介素6受体抗体(例如，抗il6r抗体，如在美国专利第7,582,298、8,043,617或9,173,880号中所述)、抗il1抗体、抗il2抗体、抗il3抗体、抗il4抗体、抗il5抗体、抗il6抗体、抗il7抗体、抗白介素33(例如，抗il33抗体，如在美国专利第9,453,072或9,637,535号中所述)、抗呼吸道合胞病毒抗体(例如，抗rsv抗体，如在美国专利申请公开号9,447,173中所述)、抗分化簇3(例如，抗cd3抗体，如在美国专利第9,447,173和9,447,173号以及美国申请号62/222,605中所述)、抗分化簇20(例如，抗cd20抗体，如在美国专利第9,657,102号和us20150266966a1以及美国专利第7,879,984号中所述)、抗cd19抗体、抗cd28抗体、抗分化簇48(例如，抗cd48抗体，如在美国专利第9,228,014号中所述)、抗fel d1抗体(例如如在美国专利第9,079,948号中所述)、抗中东呼吸综合征病毒(例如，抗mers抗体，如在美国专利申请公开号us2015/0337029a1中所述)、抗埃博拉病毒抗体(例如如在美国专利申请公开号us2016/0215040中所述)、抗寨卡病毒抗体、抗淋巴细胞活化基因3抗体(例如，抗lag3抗体或抗cd223抗体)、抗神经生长因子抗体(例如，抗ngf抗体，如在美国专利申请公开号us2016/0017029和美国专利第8,309,088号和第9,353,176号中所述)和抗蛋白质y抗体。在一些实施例中，双特异性抗体选自由以下组成的组：抗cd3 x抗cd20双特异性抗体(如在美国专利申请公开号us2014/0088295a1和us20150266966a1中所述)、抗cd3 x抗粘蛋白16双特异性抗体(例如，抗cd3 x抗-muc16双特异性抗体)和抗cd3x抗前列腺特异性膜抗原双特异性抗体(例如，抗cd3 x抗psma双特异性抗体)。
104.在一些实施例中，感兴趣的蛋白质选自由以下组成的组：阿昔单抗(abciximab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿达木单抗-阿托(adalimumab-atto)、阿多-曲妥珠单抗(ado-trastuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿利西尤单抗(alirocumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝利木单抗
(belimumab)、贝那利珠单抗(benralizumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、贝佐洛单抗(bezlotoxumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、本妥昔单抗维汀(brentuximab vedotin)、布罗达单抗(brodalumab)、卡纳单抗(canakinumab)、卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide)、塞妥珠单抗聚乙二醇(certolizumab pegol)、西米普利单抗(cemiplimab)、西妥昔单抗(cetuximab)、地诺单抗(denosumab)、迪妥昔单抗(dinutuximab)、度普利尤单抗(dupilumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、依库珠单抗(eculizumab)、埃洛妥珠单抗(elotuzumab)、艾米希组单抗(emicizumab-kxwh)、美坦新阿利西尤单抗(emtansinealirocumab)、依维那珠单抗(evinacumab)、依洛尤单抗(evolocumab)、法西单抗(fasinumab)、戈利木单抗(golimumab)、古塞库单抗(guselkumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、依达赛珠单抗(idarucizumabn)、英夫利昔单抗(infliximab)、英夫利昔单抗-阿伯达(infliximab-abda)、英夫利昔单抗-dyyb(infliximab-dyyb)、伊匹单抗(ipilimumab)、依奇珠单抗(ixekizumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、奈斯伐单抗(nesvacumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥必托昔单抗(obiltoxaximab)、阿托珠单抗(obinutuzumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、瑞西巴库单抗(raxibacumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、雷珠单抗(rinucumab)、利妥昔单抗(rituximab)、沙利鲁单抗(sarilumab)、苏金单抗(secukinumab)、塞妥昔单抗(siltuximab)、托珠单抗(tocilizumab)、托珠单抗(tocilizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、曲弗单抗(trevogrumab)、优特克单抗(ustekinumab)、和维多珠单抗(vedolizumab)。
105.感兴趣的蛋白质可以通过本领域已知的任何手段产生或分离。这些包括重组手段，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的蛋白质(例如抗体)。作为感兴趣的蛋白质的抗体可以从重组的组合人抗体文库中分离，所述抗体文库从对于人免疫球蛋白基因是转基因的动物(例如小鼠)中分离(参见例如，taylor等人.(1992)《核酸研究(nucl.acids res.)》20:6287-6295)，或通过涉及人免疫球蛋白基因序列与其他dna序列剪接的任何其他手段制备、表达、产生或分离。这样的重组人抗体具有从人种系免疫球蛋白序列衍生出的可变区和恒定区。在某些实施例中，对重组人抗体进行体外诱变(或，当使用对于人ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，并且因此重组抗体的vh和vl区域的氨基酸序列是这样的序列：其虽然源自人种系vh和vl序列并与人种系vh和vl序列有关，但是不可能天然存在于体内人抗体种系谱系内。
106.在一些实施例中，感兴趣的蛋白质包含片段可结晶(fc)结构域。例如，感兴趣的蛋白质可以是受体-fc融合蛋白或可溶性tcr-fc融合蛋白。在一些实施例中，受体-fc融合蛋白是陷阱蛋白。
107.融合蛋白包含蛋白质的两个或更多个部分，这些部分否则在自然界中不一起发现。例如，“fc融合蛋白”可以包含免疫球蛋白分子的fc部分，其融合至另一个异源结构域，例如受体配体结合结构域。包含融合至抗体源性多肽的各个部分(包括fc结构域)的异源性多肽的融合蛋白的制备已有所描述，例如ashkenazi等人,《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.scl usa)88:10535,1991；byrn等人,《自然》344:677,1990；和
hollenbaugh等人,"免疫球蛋白融合蛋白的构建(construction of immunoglobulin fusion proteins)",在《当前免疫学方案(current protocols in immunology)》补编4，第10.19.1-10.19.11页,1992中。“受体fc融合蛋白”包含偶联至fc部分的受体的一个或多个胞外结构域，在一些实施例中，所述胞外结构域包含铰链区，然后是免疫球蛋白的ch2和ch3结构域。在某些实施例中，所述fc-融合蛋白包含结合至一个或多个配体的两个或更多个不同的受体链。例如，fc-融合蛋白是一种陷阱，例如白细胞介素1(il-1)陷阱(例如利纳西普，其含有与融合至hlgg1的fc的il-1r1胞外区融合的il-1racp配体结合区；参见美国专利第6,927,004号)，或血管内皮生长因子a(vegf)陷阱(例如阿柏西普，其含有与融合至hlgg1的fc的vegf受体flk1的ig结构域3融合的vegf受体flt1的ig结构域2；参见美国专利第7,087,411号和第7,279,159第)。
108.在一些实施例中，感兴趣的蛋白质是融合蛋白，例如受体融合蛋白。受体融合蛋白尤其可以包括陷阱蛋白和微型陷阱蛋白。
109.术语“融合蛋白”指包含两种或更多种蛋白质或其片段的分子，所述蛋白质或其片段通过共价键经由它们各自的肽主链连接，任选地通过编码融合蛋白的多核苷酸分子的遗传表达产生。
110.在一些实施例中，感兴趣的蛋白质是陷阱蛋白或微型陷阱蛋白。在一些实施例中，陷阱蛋白是工程化的性蛋白，其能够用作诱饵受体以结合至靶蛋白并且拮抗或调节靶蛋白的活性。示例性的陷阱蛋白包含一种或多种受体组分，所述一种或多种受体组分模拟与人igg恒定区融合的其靶蛋白的受体的结合结构域(例如，flt-1的vegf受体ig结构域2和ig结构域3)，任选地包括额外的结构域，例如接头、二聚化或多聚化结构域和切割位点。在一些实施例中，例如通过蛋白质切割来截短或减小陷阱蛋白质的大小(微型陷阱)，这可以有助于微型陷阱的组织穿透。陷阱蛋白的非限制性实例包括il-1陷阱(例如，利纳西普，其含有与il-1r1胞外区融合的il-lracp配体结合区，il-1r1胞外区又与hlggl的fc融合)(例如，seq id no:1)(参见美国专利号6,927,004)，或vegf陷阱(例如，阿柏西普，其含有与vegf受体flkl的ig结构域3融合的vegf受体fltl的ig结构域2，所述vegf受体flkl又与hlggl的fc融合。参见例如美国专利第7,087,411号、第7,279,159号；还可参见关于依那西普(tnf陷阱)的美国专利第5,610,279号，每个专利的内容通过引用以其整体并入本文。
111.蛋白质产生
112.通过本文所述的方法测定的感兴趣的蛋白质可以通过本领域已知的任何方法产生。例如，感兴趣的蛋白质可以通过细胞培养产生。细胞培养可以是“补料分批细胞培养”或“补料分批培养”，其指的是分批培养，其中首先将细胞和培养基供应到培养容器，并且在培养期间向培养物中以不连续的增量缓慢地供给另外的培养营养物，在培养终止之前有或没有周期性的细胞和/或产物收获。补料分批培养包括“半连续补料分批培养”，其中定期除去整个培养物(其可能包括细胞和培养基)并用新鲜的培养基代替。补料分批培养不同于简单的“分批培养”，而在分批培养中在培养过程开始时将用于细胞培养的所有组分(包括动物细胞和所有培养营养物)都提供给培养容器。补料分批培养可能不同于“灌注培养”，只要在标准补料分批过程中未从培养容器中除去上清液，而在灌注培养中，通过例如过滤将细胞保留在培养物中，并连续地或间歇地将培养基引入培养容器和从培养容器中除去。但是，考虑了在补料分批细胞培养过程中出于试验目的而取出样品。补料分批过程继续直到确定达
到最大工作容积和/或蛋白产量并随后收获为止。
113.细胞培养可以是“连续细胞培养”，其是一种通常在特定生长阶段用于连续生长细胞的技术。例如，如果需要恒定的细胞供应，或者需要生产特定的感兴趣的蛋白质，则细胞培养可能需要维持在特定的生长阶段。因此，必须连续地监测和调节条件以将细胞维持在该特定阶段。
114.细胞在细胞培养基中培养。术语“细胞培养基”和“培养基”是指用于生长哺乳动物细胞的营养物溶液，其通常提供必要的营养物以增强细胞的生长，诸如碳水化合物能源，必需氨基酸(例如苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和组氨酸)和非必需氨基酸(例如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸)、痕量元素、能源、脂质、维生素等。细胞培养基可以含有提取物，例如血清或蛋白胨(水解物)，它们提供支持细胞生长的原材料。培养基可能含有酵母衍生的提取物或大豆提取物，而不是动物衍生的提取物。化学成分确定的培养基表示其中所有化学组分都已知的(即，具有已知的化学结构)的细胞培养基。化学成分确定的培养基完全不含动物衍生的组分，诸如血清-或动物-衍生的蛋白胨。在一个实施例中，所述培养基是化学成分确定的培养基。
[0115]“细胞系”是指通过细胞的连续传代或传代培养从特定谱系衍生出的一个或多个细胞。术语“细胞”与“细胞体”可互换使用。术语“细胞”包括适合用于表达重组核酸序列的任何细胞。细胞包括原核生物和真核生物的细胞，诸如细菌细胞、哺乳动物细胞、人细胞、非人动物细胞、禽细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细胞融合物，例如，杂交瘤或四源杂交瘤。在某些实施例中，所述细胞是人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在其它实施例中，所述细胞选自下述细胞：中国仓鼠卵巢(cho)(例如cho k1、dxb-11cho、veggie-cho)、cos(例如cos-7)、视网膜细胞、vero、cv1、肾(例如，hek293、293ebna、msr 293、mdck、hak、bhk21)、hela、hepg2、wi38、mrc 5、colo25、hb 8065、hl-60、淋巴细胞，例如jurkat(t淋巴细胞)或daudi(b淋巴细胞)、a431(表皮)、u937、3t3、l细胞、c127细胞、sp2/0、ns-0、mmt细胞、干细胞、肿瘤细胞和从前述细胞衍生出的细胞系。在一些实施例中，细胞包含一个或多个病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如per.细胞)。在某些实施例中，所述细胞是cho细胞。在其它实施例中，所述细胞是cho k1细胞。
[0116]
可以使用本领域已知的任何方法，包括但不限于转化、转染、电穿孔等，用编码感兴趣的蛋白质的异源多核苷酸转化细胞。
[0117]
术语“异源多核苷酸”指编码在野生型细胞中未发现的异源核苷酸序列的多核苷酸序列，其可以包括编码感兴趣的蛋白质的序列。示例性的异源多核苷酸包括包含编码感兴趣的蛋白质的序列的载体，包括但不限于质粒、噬菌体和病毒粒子。任选地，载体允许将特定核酸分子转移到细胞。当引入到适当的细胞中时，表达载体包含指导感兴趣的蛋白质的表达所必需的遗传元件。示例性的载体可以包括转录启动子元件(即，表达控制序列)，其可操作地连接到编码感兴趣的蛋白质的序列。载体可以由dna或rna或两种的组合(例如dna-rna嵌合体)组成。任选地，载体可以包括多腺苷酸化序列、一个或多个限制位点以及一个或多个可选择性标志物，例如磷酸转移酶或潮霉素磷酸转移酶。另外，取决于所选的细胞类型和所采用的载体，其他遗传元件(例如复制起点、另外的核酸限制位点、增强子和赋予转录的诱导性的序列)也可以被并入到载体中。合适的载体和转化方法的选择对本领域普
通技术人员来说将是显而易见的。
[0118]
糖基化
[0119]
在一些实施例中，感兴趣的蛋白质是糖基化的。糖基化可以包括n-连接的糖基化、o-连接的糖基化或其组合。在细胞培养中产生的许多感兴趣的蛋白质和多肽是糖蛋白，所述糖蛋白包含共价连接的碳水化合物结构，包括寡糖链(聚糖)。这些寡糖链通过n-键或o-键与内质网和高尔基体中的蛋白质连接。寡糖链可以包含糖蛋白的质量的重要部分。寡糖链可以发挥作用，包括促进糖蛋白的正确折叠、介导蛋白质-蛋白质相互作用、赋予稳定性、赋予有利的药效学和/或药代动力学性质、抑制蛋白水解消化、将糖蛋白靶向至适当的分泌途径以及将糖蛋白靶向至特定的一个或多个器官。
[0120]
在一些实施例中，感兴趣的蛋白质包含n-连接的糖基化。通常，n-连接寡糖链被添加到内质网的腔内的新生的易位蛋白质中。寡糖被添加到靶共有序列(如asn-x-ser/thr或在一些情况下asn-x-cys，其中x可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸)中包含的天冬酰胺残基的侧链上的氨基基团中。初始寡糖链通常由内质网中的特定糖苷酶修剪，产生由两个n-乙酰葡糖胺和三个甘露糖残基组成的短支链核心寡糖。
[0121]
在内质网中的初始加工之后，糖蛋白可以在被分泌到细胞表面之前经受另外的加工。n-连接的寡糖链可以通过添加甘露糖残基来修饰，产生高甘露糖寡糖。可替代地，可以将n-乙酰葡糖胺的一个或多个单糖单元添加到核心甘露糖亚基中以形成复合寡糖。可以将半乳糖添加到n-乙酰葡糖胺亚基上，并且可以将唾液酸亚基添加到半乳糖亚基上，产生以唾液酸、半乳糖或n-乙酰葡糖胺残基终止的链。另外，可以将岩藻糖残基添加到核心寡糖的n-乙酰葡糖胺残基中。这些添加中的每一种都通过特异性糖基转移酶催化。
[0122]
除了被n-连接的糖基化途径修饰之外，糖蛋白也可以在它们在高尔基体中被加工时，通过向特定的丝氨酸或苏氨酸残基添加o-连接的寡糖链而被修饰。一次添加一个o-连接的寡糖的残基，并且每个残基的添加都由特定的酶催化。与n-连接的糖基化相比，o-连接的糖基化的共有氨基酸序列定义不太明确。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质包含o-连接的糖基化。在一些实施例中，o连接的糖基化包含糖分子与感兴趣的蛋白质的丝氨酸(ser)或苏氨酸(thr)氨基酸的附接。
[0123]
在一些实施例中，感兴趣的蛋白质是糖基化的蛋白质。在一些实施例中，糖基化的蛋白质包含至少一个附接的聚糖。在一些实施方案中，感兴趣的蛋白质包含至少1个附接的聚糖、至少2个附接的聚糖、至少3个附接的聚糖、至少4个附接的聚糖、至少5个附接的聚糖、至少6个附接的聚糖、至少7个附接的聚糖、至少8个附接的聚糖、至少9个附接的聚糖、至少10个附接的聚糖、至少11个附接的聚糖、至少12个附接的聚糖、至少15个附接的聚糖、至少20个附接的聚糖或至少25个附接的聚糖。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个附接的聚糖。在一些实施例中，聚糖是n连接的。在一些实施例中，聚糖是o-连接的。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质包含n-连接的聚糖和o-连接的聚糖。
[0124]
在一些实施例中，感兴趣的蛋白质是糖基化的蛋白质。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质包含至少一个糖基化位点。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质包含至少一个糖基化位点、至少两个糖基化位点、至少3个糖基化位点、至少4个糖基化位点、至少5个糖基化位点、至少6个糖基化位点、至少7个糖基化位点、至少8个糖基化位点、至少9个糖基化位点、至
少10个糖基化位点、至少10个糖基化位点、至少11个糖基化位点、至少12个糖基化位点、至少15个糖基化位点、至少20个糖基化位点或至少25个糖基化位点。在一些实施例中，至少糖基化位点是n连接的糖基化位点，例如n连接的糖基化共有序列内的天冬酰胺。在一些实施例中，至少一个糖基化位点是o-连接的糖基化位点，例如丝氨酸或苏氨酸。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质包含至少一个n-连接的糖基化位点和至少一个o-连接的糖基化位点两者。
[0125]
在一些实施例中，聚糖占糖基化的蛋白质的总重量的至少至少0.5％、1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％或至少75％(5％重量/重量或w/w)。在一些实施例中，聚糖占糖基化的蛋白质的总重量的至少5％(5％w/w)。在一些实施例中，聚糖占糖基化的蛋白质的总重量的至少10％(10％w/w)。确定由聚糖组成的蛋白质重量百分比的方法对本领域普通技术人员来说将是显而易见的，并且包括但不限于将由氨基酸序列得到的预期重量与通过本文所述的电泳分析方法确定的实际重量进行比较。
[0126]
参照标准品
[0127]
在一些实施例中，参照标准品经受与包含感兴趣的蛋白质的样品平行的相同制备方法，并且平行于包含感兴趣的蛋白质的样品进行分析。在一些实施例中，方法包含将感兴趣的蛋白质的一个或多个特征与参照标准品进行比较。例如，所述方法可以包括比较感兴趣的蛋白质和参照标准品的电泳图。
[0128]
如本文所使用的，“参照标准品”是指包含先前已经使用本领域已知的方法分析并且其特征是已知的蛋白质的样品。已知的特征可以由参照标准品的氨基酸序列(例如，预测的分子量)确定或者通过实验确定(例如，电泳图图谱)。这些特征可以包括但不限于预期的和实验确定的分子量、使用本文所述的方法或本领域已知的方法产生的电泳图、等电点、消光系数(感兴趣的蛋白质在给定波长下吸收光的强度的度量)、糖基化位点的数目和附接的聚糖的分子量。参照标准品在一个或多个特征上可以类似于感兴趣的蛋白质。例如，感兴趣的蛋白质和参照标准品两者可以是单克隆抗体，或者可以包含fc结构域、具有相似的分子量等。
[0129]
在一些实施例中，参照标准品包含感兴趣的蛋白质。例如，参照标准品可以来自与样品不同的感兴趣的蛋白质的单独的批次，其已经先前被表征并在受控的条件下储存以防止降解。
[0130]
在一些实施例中，本公开提供了制备包含感兴趣的蛋白质和参照标准品的样品以用于使用电泳进行分析的方法，包含(a)使样品和参照标准品变性；(b)用荧光标记物来标记感兴趣的蛋白质和参照标准品，以产生标记的样品和标记的参照标准品；(c)淬灭感兴趣的蛋白质和参照标准品的标记反应，(d)用内切糖苷酶将标记的样品和标记的参照标准品去糖基化；和(e)对标记的样品和标记的参照标准品进行电泳；其中在步骤(d)中去糖基化之前，在步骤(b)和(c)中对样品和参照标准品进行标记和猝灭。
[0131]
在一些实施例中，电泳是微芯片毛细管电泳(mce)，并且输出是电泳图。在一些实施例中，所述方法包含确定感兴趣的蛋白质和参照标准品的主峰强度，以及比较感兴趣的蛋白质的主峰和参照标准品的主峰的强度值。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质或参照标准品的主峰是糖基化的。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质或参照标准品的主峰不是糖基
化的，即，在使用本文所述的方法标记后已经被去糖基化。在一些实施例中，确定主峰包含确定主峰的高度。在一些实施例中，确定主峰包含确定主峰的面积。在一些实施例中，确定主峰包含确定主峰的时间校正面积，其为峰面积除以其迁移时间。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质的主峰强度在参照标准品的主峰强度的50％至150％、50％至140％、50％至130％、50％至120％、50％至110％、50％至100％、50％至90％、60％至150％、70％至150％、80％至150％、90％至150％、100％至150％、110％至150％、120％至150％、130％至150％、140％至150％、60％至140％、70％至140％、70％至130％、70％至120％、70％至110％、80％至140％、80％至130％、80％至120％、80％至110％、80％至100％、90％至140％、90％至130％、90％至120％、90％至110％或90％至100％内。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质的主峰强度在参照标准品的主峰强度的60％至140％、70％至130％、80％至120％或90％至110％内。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质的主峰强度在参照标准品的主峰强度的70％至130％内。确定感兴趣的蛋白质相对于参照标准品的主峰强度可以确保通过ce或mce仪器的适当的分离，以及数据质量。
[0132]
电泳
[0133]
本文提供了使用电泳分析包含使用本文所述的方法制备的感兴趣的蛋白质的样品的方法。
[0134]
用于分析蛋白质的基于电泳的方法包括但不限于基于凝胶的方法，诸如十二烷基(月桂基)硫酸钠(sds)聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)、在十二烷基硫酸锂的存在下的聚丙烯酰胺凝胶电泳、自由流动电泳、等电聚焦、毛细管凝胶电泳、毛细管电泳(ce)和微芯片毛细管电泳(mce)。
[0135]
在一些实施例中，电泳是ce。在一些实施例中，ce包含十二烷基硫酸锂(lds)缓冲液。
[0136]
在一些实施例中，电泳是mce。术语“mce”或“微芯片毛细管电泳”和“毛细管电泳(ce)”是指毛细管电泳(ce)及其微流体对应物(mce)，它们用于分离样品中的分析物。mce技术可以用于分离、鉴定和定量感兴趣的蛋白质、蛋白质样品中的杂质，并且分析感兴趣的蛋白质的分解产物，例如蛋白质片段。当向样品施加电压时，ce和mce基于电泳迁移率分离分析物。凝胶基质(例如，凝胶电泳)的存在将基于大小以及电荷来分离分析物。样品中的杂质包括但不限于蛋白质聚集体、蛋白质片段、蛋白质多聚体和测定污染物。
[0137]
在mce中，稀释感兴趣的变性的标记的蛋白质，并且使其经受mce以在微芯片毛细管电泳系统上分离稀释的蛋白质样品以产生电泳图。因为多个样品可以在相同的微芯片上并行运行，所以基于mce的方法容易适应高通量方法。此外，mce是快速的，并且使用最小的样品体积。
[0138]
如本文所使用的，电泳图是由电泳方法例如ce或mce得到的图。电泳图包含对应于感兴趣的蛋白质和杂质的峰。
[0139]
分析电泳图的方法是本领域已知的，并且包括比较单独的峰下的位置、大小和面积。计算电泳图的峰面积(峰下面积)的方法是本领域已知的，并且包括例如积分以估计峰下面积。可以使用诸如empower的软件计算峰面积。
[0140]
用于进行所公开的mce测定的仪器是可商购获得的。在一些实施例中，所公开的mce测定使用labchip gxii、labchip gxii touch
tm
、labchip gxii touch tm ht和蛋白质
表达测定labchip(ht蛋白质表达芯片)进行。
[0141]
用于进行所公开的ce测定的仪器也是可商购获得的。例如，可以使用beckman coulter毛细管电泳系统(例如pa800plus药物分析系统)来执行ce测定。
[0142]
在本文所述的方法的一些实施例中，所述方法进一步包含标记和运行蛋白质标准分子量梯以评估感兴趣的蛋白质的大小。蛋白质分子量梯将是本领域普通技术人员已知的，并且包括可从thermofisher获得的pageruler、mark12、benchmark、pageruler high range和pageruler low range，以及来自perkinelmer的蛋白质pico测定试剂盒的ht pico蛋白质表达梯。基于感兴趣的蛋白质的大小选择合适的梯对本领域普通技术人员来说将是显而易见的。
[0143]
应用
[0144]
本公开提供了使用本文所述的标记、去糖基化和电泳的方法来表征感兴趣的蛋白质的方法。
[0145]
分析感兴趣的蛋白质可以包括但不限于表征由ce或mce生成的电泳图中的一个或多个峰的数目、位置、高度、宽度、强度、大小或面积。
[0146]
表征电泳图中的峰的数量和位置可以确定在样品中是否存在感兴趣的蛋白质的降解产物，例如分子量小于主峰的分子量的峰。比较由非去糖基化的感兴趣的蛋白质产生的峰，以及使用本文所述的方法的去糖基化和标记的感兴趣的蛋白质，可以确定在样品中是否存在感兴趣的蛋白质的糖基化的形式，因为感兴趣的蛋白质的去糖基化的主峰将具有比感兴趣的蛋白质的糖基化的主峰更低的分子量。
[0147]
本公开的方法可以用于测定感兴趣的蛋白质在各种条件下的稳定性。这些包括已经被配制为原料药(drug substance)或药物产物的感兴趣的蛋白质的储存条件。峰数和峰面积的比较，例如包含感兴趣的蛋白质的参照样品和其应激的样品之间的比较，可以用于确定感兴趣的蛋白质随时间和在各种条件(例如高或低ph，或暴露于光)下的稳定性。
[0148]
因此，本公开提供了使用本文描述的标记和去糖基化感兴趣的蛋白质的方法来确定感兴趣的蛋白质的稳定性的方法。在一些实施例中，所述方法包含(a)对包含感兴趣的蛋白质的样品进行应激；(b)将应激的样品和包含感兴趣的蛋白质的非应激的样品变性；(c)用荧光标记物标记应激的样品和非应激的样品中的感兴趣的蛋白质以产生标记的应激的样品和标记的非应激的样品；(d)猝灭标记的应激的样品和标记的非应激的样品中未反应的荧光标记物；(e)用内切糖苷酶将标记的应激的样品和标记的非应激的样品去糖基化；(f)对标记的应激的样品和标记的非应激的样品进行微芯片毛细管电泳(mce)，以产生应激的样品和非应激的样品的电泳图；和(g)比较来自应激的样品和非应激的样品的电泳图；其中在步骤(e)中去糖基化之前，在步骤(c)和(d)中对应激的样品和非应激的样品进行标记和猝灭。
[0149]
任何对样品中感兴趣的蛋白质进行应激的方法设想为在本公开的方法内，包括但不限于化学品、ph、辐射、光、冷冻-解冻循环、冻干和加热。
[0150]
在一些实施例中，对包含感兴趣的蛋白质的样品进行应激包含对样品进行热应激。对样品进行热应激可以包括模拟配制为原料药或配制的药物产物的感兴趣的蛋白质的储存条件，即，应激的样品分别被保持在约-80℃至-30℃或约2℃至约8℃下。在其它实施例中，对样品进行热应激包含模拟样品的处理和运输条件。在其它实施例中，对样品进行热应
激包含例如通过增加样品所暴露于的温度来诱导样品的强制降解。
[0151]
在一些实施例中，对包含感兴趣的蛋白质的样品进行应激包含对样品进行热应激。在一些实施例中，热应激包含将样品保持在25℃至45℃之间。在一些实施例中，热应激包含将样品保持在2℃、4℃、6℃、8℃、10℃、12℃、14℃、16℃、18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、35℃、37℃或40℃下。在一些实施例中，热应激包含将样品保持在37℃下。在一些实施例中，热应激包含将样品保持在22℃至26℃下。在一些实施例中，热应激包含将样品保持在30℃下。在一些实施例中，热应激包含将蛋白质保持在约25℃至45℃之间。在一些实施例中，热应激包含将应激的样品保持持续至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或一年。在一些实施例中，将应激的样品保持持续2周。在一些实施例中，将应激的样品保持持续4周。
[0152]
在一些实施例中，对样品进行热应激包含将样品保持在约25℃至约45℃之间持续至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周或至少8周。在一些实施例中，对样品进行热应激包含将样品保持在约30℃至约45℃之间持续至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周或至少8周。
[0153]
在一些实施例中，对样品进行应激包含至少一个冷冻/解冻循环。例如，从液体样品开始，降低温度直到样品冻结，然后在将样品返回到在分析之前其为液体的温度。
[0154]
在一些实施例中，对样品进行应激包含使样品暴露于储存条件。在一些实施例中，储存条件包含约-80℃至-30℃的温度，持续至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少8个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或至少30个月。在一些实施例中，储存条件包含约2℃至8℃的温度，持续至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少8个月、至少12个月或至少18个月。
[0155]
在一些实施例中，对样品进行应激包含例如使用涡旋或磁力搅拌器机械搅动样品。
[0156]
在一些实施例中，对样品进行应激包含冻干和再水合样品。将包含感兴趣的蛋白质的样品冻干的方法将为本领域普通技术人员已知的，并且包括例如冷冻干燥和喷雾干燥。
[0157]
在一些实施例中，对样品进行应激包含使样品暴露于光、辐射、单线态氧物质、自由基、高ph条件或低ph条件。示例性的低ph条件尤其包括将样品暴露于小于7.0的ph，例如小于6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.0、1.5或1.0的ph。示例性的高ph条件尤其包括将样品暴露于大于7.0的ph，例如大于8.0、8.5、9.0、9.5或10.0的ph。
[0158]
在一些实施例中，对样品进行应激包含将样品暴露于光。暴露于光可以包括任何波长或任何波长范围的光。在示例性的实施例中，样品被暴露于冷白荧光灯或近紫外光。示例性的冷白荧光灯包含具有约4,100至约4,500开尔文(k)的相关温(cct)的混合波长的光。在一些方面中，冷白荧光灯具有4,100k的cct。在一些方面中，将样品暴露于光包含将样品暴露于约50万、60万、70万、80万、90万、100万、110万、120万、130万、140万、150万、160万、170万、180万、190万、200万、210万、220万、230万、240万、250万、260万、270万、280万、290万或300万勒克斯小时的冷白光的累积的暴露。在一些方面中，将样品暴露于光包含将样品暴露于约120万或约240万勒克斯小时的冷白光的累积的暴露。示例性的近紫外光具有约300nm到约400nm的波长。在一些方面中，近紫外光具有约100瓦时/平方米至约600
瓦时/平方米的综合能量(integrated energy)。在一些方面中，近紫外光具有约100、200、300、400、500或600瓦时/平方米的综合能量。
[0159]
参考样品与其应激形式之间的主峰面积的减小可以例如指示通过降解在主峰中的感兴趣的蛋白质的减小。在一些实施例中，与非应激的感兴趣的蛋白质的主峰相比，感兴趣的应激的蛋白质的主峰的面积减少至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％或至少40％。类似地，与参考样品相比，应激的参考样品中低分子量峰面积的增加可以指示感兴趣的蛋白质的降解，因为表示感兴趣的蛋白质的降解产物的较低分子量物质的丰度增加。在一些实施例中，与非应激的感兴趣的蛋白质的至少一个低分子量峰相比，应激的感兴趣的蛋白质的至少一个低分子量峰的面积增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％或至少40％。
[0160]
试剂盒和制造的制品
[0161]
本公开提供了试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种在本文所述的去糖基化和标记的方法中使用的所公开的缓冲液、酶、染料和参照标准品。试剂盒可以包括用于成分的容器。缓冲液可以以溶液或冻干的形式。在一些实施例中，试剂盒包括含有用于冻干的制剂的稀释剂或重构溶液的第二容器；以及任选地，使用溶液或重构和/或使用冻干的缓冲液或粉末状成分的说明书。
[0162]
本文所述的试剂盒可以进一步包括执行所公开的mce测定所需的额外试剂，包括缓冲液、稀释剂和过滤器中的一种或多种。缓冲液和试剂可以在瓶、小瓶或试管中。
[0163]
在一些实施例中，试剂盒包括使用说明书。
[0164]
本发明的描述阐述了许多示例性的配置、方法、参数等。然而，应认识到，此类描述不旨在作为对本公开的范围的限制，而是作为示例性实施例的描述而提供。
[0165]
实例
[0166]
实例1：试剂
[0167]
材料和设备
[0168]
表1.材料(也可以使用等效物品)
[0169]
[0170]
表2.化学品(也可以使用等效物品)
[0171][0172][0173]
表3.设备
[0174]
[0175][0176]
表4.试剂溶液
[0177]
[0178][0179]
表5.mce方法的总结
[0180][0181]
表6.在实例中使用的蛋白质的总结
[0182][0183]
实例2：无去糖基化的微芯片毛细管电泳的方案(方法a)
[0184]
本方案描述了使用gxii仪器通过非还原型(nr)和还原型(r)微芯片毛细管电泳(mce)分析测试蛋白质以估计纯度和杂质水平的制备方法。这些方法用于蛋白质表征或确定蛋白质样品中的片段化水平。这些常规方法在无去糖基化的情况下进行。
[0185]
程序
[0186]
有关本程序的仅有的信息流程图，参见图1。
[0187]
(1)变性.用水将蛋白质参比标准品或测试制品稀释至约0.2-2.0mg/ml。在96孔板中，以4:1的体积比(体积可以变化)添加蛋白质样品和非还原(nr)/还原(r)溶液。用聚丙烯密封件密封板，并且在蛋白特异性变性温度(通常为50℃至99℃)下加热板持续优化的时间(通常为1分钟至60分钟)。
[0188]
(2)标记.如表4中所述制备5μm染料。将5μm的染料以1:1的体积比(体积可以变化)添加到变性的蛋白质溶液中。将96孔板在热循环器中在35℃下加热持续30分钟。为了淬灭标记反应，将105μl的稀释的终止溶液(根据表4制备)和5μl的标记的蛋白质添加到新的96孔板中并很好地混合。
[0189]
(3)在gx-ii上运行.准备mce仪器和芯片，并且根据制造商的说明进行测量。
[0190]
实例3：在蛋白质标记前具有去糖基化的微芯片毛细管电泳的方案(方法b)
[0191]
该方法适用于在进行mce测量之前需要去糖基化的糖蛋白。除非另有说明，否则所有方案、化学品、试剂和分析与实例1-2中所述的相同。
[0192]
表7.另外的试剂
[0193][0194]
程序
[0195]
(1)去糖基化.用0.1％的rapigest sf将总共100μg的蛋白质样品稀释至90μg。蛋白质重量可以通过基于uv的方法确定。添加10μl的neb pngase f储备液，并且制备100μl的去糖基化混合物，涡旋并向下旋转。在加热模块上以每分钟400转(rpm)的振荡将混合物在37℃下孵育3小时。
[0196]
(2)变性.如实例2所述继续进行上述去糖基化的样品的变性。
[0197]
(3)标记.如实例2中所述继续标记变性的样品。
[0198]
(4)在gx-ii上运行.准备mce仪器和芯片，并且根据制造商的说明进行测量。
[0199]
实例4：在蛋白质标记后具有去糖基化的微芯片毛细管电泳的方案(方法c)
[0200]
该方法适用于在进行mce测量之前需要去糖基化的糖蛋白。除非另有说明，否则所有方案、化学品、试剂和分析与实例1-3中所述相同。
[0201]
在图1中可以看到在蛋白质标记后去糖基化的方案的图。
[0202]
表8另外的试剂
[0203]
试剂供应商信息快速
tm pngase f(非还原形式)新英格兰生物实验室neb#p07105x快速
tm pngase f缓冲液(非还原形式)新英格兰生物实验室neb#b0717s
[0204]
程序
[0205]
(1)变性.如实例2所述稀释和变性样品。
[0206]
(2)标记.如表4中所述制备5μm染料。将5μm染料和上述变性的蛋白质溶液以1:1的体积比混合。例如，如果样品的体积为10μl，则添加10μl的5μm染料。用聚丙烯密封件密封96孔板，并且在热循环器中在35℃下加热30分钟。为了淬灭标记反应，获得未使用的96孔板。根据样品运行设置，将2.5μl的终止缓冲液(来自pico蛋白试剂盒的橙盖小瓶，使用来自试剂盒的原始溶液)添加到空板的孔中。将2.5μl的标记的样品转移至含有终止溶液的板孔中。用移液管吸取每个孔中的混合样品，并保持持续至少3分钟。
[0207]
(3)去糖基化.向每个孔中加入3μl的milliq水和2μl的5x快速
tm pngase缓冲液(来自neb的非还原形式)，以制备10μl的反应体积。向每个孔中加入1-4μl快速
tm pngase(来自neb的非还原形式)。用聚丙烯密封件密封96孔板，并且在热循环器中在50℃下加热10-30分钟。在去糖基化后，向每个孔中加入17μl的样品缓冲液(来自pico蛋白试剂盒的白盖小瓶)和80μl的milliq水。
[0208]
(4)在gx-ii上运行.准备mce仪器和芯片，并且根据制造商的说明进行测量。
[0209]
实例5：使用含有蛋白质的高度糖基化的唾液酸，在蛋白质标记之前比较无去糖基化和去糖基化
[0210]
蛋白质1是二硫连接的重组融合蛋白，其大小按肽质量计为49kda，并且具有8个预测的n-糖基化位点(注意，并非所有位点都将预期是糖基化的)。
[0211]
一个目标是开发基于微芯片毛细管电泳的方法，以表征和监测高度糖基化的含唾液酸的蛋白质(例如蛋白质1)的低分子量(lmw)片段，以用于研究稳定性研究和用于质量控制(qc)研究。
[0212]
蛋白质1的特征在下表9中示出：
[0213]
表9.蛋白质1的分子特性
[0214]
无聚糖的分子量(完整ms)49kda含有聚糖的分子量(sec-mals)64kda预测的n连接的糖基化位点8
[0215]
缩写：完整ms，完整蛋白质质谱法；sec-mals，尺寸排阻谱法多角度激光散射。
[0216]
在图1中示出了没有去糖基化的方案(方法a，实例2)和在标记前具有去糖基化的方案(方法b，实例3)的比较。分别在图2中示出了对于非还原的(nr)条件，由方法a和方法b产生的蛋白质1的电泳图的比较，并且在图4中示出了对于还原的(r)条件，由方法a和方法b产生的蛋白质1的电泳图的比较。对于nr条件，作为方法a(无去糖基化)的结果，在电泳图中存在没有峰分离度的宽峰(即，主峰、高分子量(hmw)峰和低分子量(lmw)峰未分离)。另外，基于正交方法，峰的位置在比在约64kda处预期的高得多的分子量(mw)区(70kda-120kda)处出现。当蛋白质被糖基化时，mce测定可能会以较大的误差不准确地估计大小(由engel等人在《电泳(electrophoresis)》,2015年8月；36(15):1754-8中描述)。另外，在《20kda处存在游离染料峰干扰，其可以掩蔽低于20kda的任何lmw峰。
[0217]
相比之下，作为方法b的结果，其中去糖基化在标记之前发生(实例3)，存在峰分离度和峰之间的基线分离(主峰、hmw峰、lmw峰)。主峰出现在预期的mw附近(约49kda)。方案是稳定性指示的，并且在分子分级方面更加准确。然而，方法b的方案也需要3小时的去糖基化，这限制了测定的总吞吐量。此外，pngase峰(约36kda)干扰lmw 1和2峰(来自蛋白质1的片段的杂质峰)。尤其对于热应激的蛋白质1样品，lmw 1峰增加并变宽，与pngase峰合并(图3)。另一个附近的伪影是在《20kda处的游离染料峰干扰。当定量杂质时，这些伪影的组合可能导致不准确的积分，并且限制测定作为稳定性指示的能力。
[0218]
对于还原的条件，发现了类似的观察结果(图4):糖蛋白的去糖基化是精确确定主峰、lmw峰和hmw峰的大小、分离和分辨主峰、lmw峰和hmw峰所必需的。
[0219]
实例6：使用高度糖基化的含唾液酸的蛋白质进行蛋白质标记后的去糖基化
[0220]
在图1中示出了在标记前(方法b)和在标记后(方法c)具有去糖基化的方案的比较。
[0221]
为了开发在标记后具有去糖基化的方案，去糖基化反应条件被优化，因为最初用30分钟去糖基化反应观察到糖基化的峰的不完全去除。改变温度、时间、浓度和缓冲液条件以确定蛋白质1的最佳去糖基化。
[0222]
去除蛋白质1的nr电泳图中不完全去糖基化的峰的优化对方案产生了几个改进。
这些包括使用neb快速
tm pngase f和在50℃的高温下进行去糖基化持续10分钟(使用常规的pngase f需要在37℃下孵育3小时)，增加内切糖苷酶浓度，并且添加来自neb pngase试剂盒的糖蛋白缓冲液。
[0223]
实验显示，增加的反应时间在去糖基化中没有明显的改善。图5示出了在50℃下，用1μl或2μl的快速
tm pngase f(非还原形式，neb p0711)使用蛋白质1生成的电泳图，其中反应时间从10分钟至30分钟变化。如从图5中可以看到的，在反应时间超过10分钟的情况下，没有明显的改善(即，不完全去糖基化的峰的减少)。
[0224]
增加快速
tm pngase f浓度改善了去糖基化。使用标记后去糖基化的方案，将1μl、2μl、3μl或4μl的快速
tm pngase f添加到去糖基化反应中，并且允许反应在50℃下继续10分钟。结果在图6和图7中示出。如在图6的插图中可以看到的，增加快速
tm pngase f的浓度减少蛋白质1的不完全-去糖基化肩峰。
[0225]
添加1-4μl的快速
tm pngase f提供了稳健的结果。在图7中示出了使用1μl、2μl、3μl或4μl的快速
tm pngase f去糖基化的参考蛋白质1产生的电泳图。使用empower对所示峰下的面积进行积分，并且结果在下表10中提供。
[0226]
表10.使用不同量的快速
tm pngase f生成的蛋白质1峰的积分
[0227]
快速
tm pngaselmw2-5lmw 1mphmw1μl2.274.0993.010.622μl1.944.2393.240.603μl1.714.0593.750.504μl1.784.1093.380.75％rsd12.951.900.3316.64
[0228]
rsd％代表相对标准差百分比。
[0229]
积分结果显示，尽管在较高的快速
tm pngase f浓度下观察到主峰后的肩峰(不完全去糖基化的蛋白质1)逐渐减少，但主峰(mp)的总积分百分比在约3μl时达到最高值。从1μl至4μl的pngase，mp的rsd％为0.33％，表明每个反应使用1-4μl的快速
tm pngase f浓度提供了稳健的结果。遵循这一趋势，使用更多快速
tm pngase预期将提供类似的结果。
[0230]
方法c(其中去糖基化在标记后发生)使得这种mce测定是精确的和稳定性指示的。通过将蛋白质溶液在37℃保持4周对蛋白质1进行应激(与“rs”或非应激的参照标准品相比，表11和12中的应激的参照标准品或“srs”、“37℃4w”)，并且在标记方案和本文描述的mce后使用脱糖基化进行测定。将这种应激的蛋白质1与非应激的蛋白质1进行比较(时间等于0或t0，即无37℃保持)。生成了应激的和非应激的蛋白质1的电泳图(图8)，并且使用empower对指示的峰进行积分。针对三个复制品(s1-s3)重复测量，并且结果在下表11和12中示出。
[0231]
表11.使用标记后去糖基化方案比较应激的(srs)和非应激的(rs)蛋白质1
[0232][0233]
表12.应激的和非应激的蛋白质1的相对标准差百分比(rsd％)(n＝3)
[0234][0235]
对rs和srs的三次重复的测量显示，在运行之间一致地识别出多个lmw峰和hmw峰，并且对于lmw峰和mp峰以小于1％的rsd进行积分。从rs到srs，所有的变化都是显著的。来自通过方法c制备的应激的和非应激的蛋白质1的电泳图的比较(图8)表明，该方法是精确的和稳定性指示的。
[0236]
当在染料标记之前用pngase f进行去糖基化时(方法b)，pngase f峰在电泳图图谱中可见，并干扰lmw 1和lmw 2峰。使用长的去糖基化时间(3小时)，并且存在游离染料干扰(《20kda)。
[0237]
当在用染料标记后用快速
tm pngase f进行去糖基化时(方法c)，在电泳图中未观察到pngase峰。存在快速且完全的去糖基化(例如，在10分钟内)。实现了mp、hmw和lmw峰的分离度，以及低至约10kda区域的最小游离染料干扰(例如，在图8中，lmw 5峰为11kda，并且是从游离染料峰伪像中基线分离的)。
[0238]
总之，使用在染料标记后去糖基化的mce方法(例如方法c)具有良好的分离度，是稳定性指示的、高通量、可再现的，并避免了由pngase f峰干扰和游离染料干扰造成的测定伪影。所述方法还显示出良好的精度、线性和稳健性。这些测定可以以适用于质量控制目的的基于板的高通量形式使用。
[0239]
实例7：使用蛋白质2在去糖基化和没有去糖基化的情况下产生的mce结果的比较
[0240]
蛋白质2是单链重组(fab')2样蛋白，其包含单链融合蛋白，所述单链融合蛋白包含通过序列ggggsggggsggggsggggsggggsggggs(seq id no:1)的接头连接的配体结合结构域。蛋白质具有48kda的预测的分子量(肽主链)。蛋白质2具有8个n-糖基化位点。
[0241]
在非还原的条件和还原的条件下，使用没有去糖基化(方法a，实例2)和在标记后具有去糖基化(方法c，实例4)的方案生成蛋白质2的mce电泳图。如在图9中可以看到的，在没有去糖基化的情况下，在mw区域(90kda-140kda)处仅存在没有分离的宽峰，其远大于理论值(约48kda)。相反，去糖基化在预期的mw(48kda)附近产生主峰，并且清晰地分辨出lmw峰。此外，在电泳图中未出现pngase峰(约36kda)。
[0242]
实例8：使用蛋白质3在去糖基化的情况下和在没有去糖基化的情况下产生的mce结果的比较
[0243]
蛋白质3是通过重组半胱氨酸蛋白酶在特异性位点处切割的重组人igg1fc亚基。
蛋白质具有23kda的预测的分子量。蛋白质具有一个n-糖基化位点。
[0244]
在非还原的条件下，使用没有去糖基化(方法a，实例2)和在标记后具有去糖基化(方法c，实例4)的方案生成mce电泳图。结果可以在图10中看到。在非去糖基化图谱中，发现两个主峰(mp)，其代表原始样品中的非糖基化的体(mp1，左)和糖基化的体(mp2，右)。在去糖基化图谱中，仅观察到非糖基化的峰，并且分辨出几个hmw峰。还在还原条件下进行相同的比较(图11)。
[0245]
实例9：单克隆抗体的稳定性评估
[0246]
蛋白质4是基于人igg4的单克隆抗体，其具有145kda的分子量和2个n连接的糖基化位点。
[0247]
对于使用没有去糖基化的方案(方法a，在图12和13中)和使用在标记后具有去糖基化的方案(方法c，在图12和13中)制备的蛋白质4样品，生成mce电泳图。使用在非还原条件(图12)和还原条件(图13)下的变性来测定蛋白质。如在图13中可以看出，由聚糖的去除，去糖基化将糖基化的主峰(gmp)移动到较低分子量的去糖基化的主峰(dgmp)。在图13中，去糖基化降低重链(hc)峰的大小，如通过比较去糖基化的重链(dghc)和糖基化的重链(fghc)峰可以看到的。
[0248]
实例10：光应激的蛋白质1的稳定性评估
[0249]
通过将蛋白溶液暴露在具有120万和240万勒克斯小时(mlh)累积暴露量的冷白(cw)荧光灯光下(图14)，或暴露在具有200和400瓦时/平方米的能量的集成近紫外线(uva)下(图15)，对蛋白质1进行光应激。按照如实例1和4中所述的标记方案(方法c)和mce，使用去糖基化来测定样品。将应激的蛋白质1样品与非应激的蛋白质1对照(其在相同条件下孵育，但用铝箔覆盖)进行比较。对于应激的和非应激的蛋白质1生成电泳图，并且使用empower对指示的峰进行积分。结果在表13中示出。cw和uva暴露均导致lmw峰的略微增加和hmw峰的显著增加，这可能是由于光引发的共价键二聚体和多聚体的形成引起的。结果显示，这种方法是稳定性指示的，并且能够评估在应激条件下蛋白质的断裂和共价键合的hmw形成。
[0250]
表.14.使用标记后去糖基化方案比较光应激的和非应激的蛋白质1(方法c)。
[0251][0252]

技术特征：

1.一种分析包含感兴趣的蛋白质的样品的方法，所述方法包含：a.使所述样品变性；b.用荧光标记物标记所述样品以产生标记的样品；c.淬灭所述标记的样品中的未反应的荧光标记物；d.用内切糖苷酶对所述标记的样品进行去糖基化；以及e.对所述标记的样品进行电泳；其中在步骤(d)中去糖基化之前，在步骤(a)至(c)中对所述样品进行变性、标记和淬灭。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质包含至少一个糖基化位点。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质是糖基化的蛋白质。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述糖基化的蛋白质包含至少一个附接的聚糖。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质包含抗原结合结构域。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质包含抗体、抗体片段或scfv。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质包含fc结构域。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质包含受体融合蛋白。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述受体融合蛋白是受体-fc融合蛋白或可溶性tcr-fc融合蛋白。10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述受体融合蛋白是陷阱蛋白或微型陷阱蛋白。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质是重组人蛋白。12.根据权利要求2至11中任一项所述的方法，其中所述糖基化位点包含asn-x-ser/thr共有序列。13.根据权利要求4至12中任一项所述的方法，其中所述至少一个附接的聚糖是n连接的。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述至少一个附接的聚糖与所述糖基化的蛋白质中的天冬酰胺n连接。15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述内切糖苷酶催化n-连接的聚糖的去糖基化。16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述内切糖苷酶选自由肽-n-糖苷酶f(pngase f)、内切糖苷酶h(endo h)、内切糖苷酶s(endo s)、内切糖苷酶d、内切糖苷酶f1、内切糖苷酶f2和内切糖苷酶f4组成的组。17.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述内切糖苷酶是pngase f。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述pngase f是快速pngase f。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述快速pngase f是非还原性的。20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中对所述样品进行去糖基化包含将所述样品加热到约50℃持续10分钟。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中对所述样品进行去糖基化包含反应混合物，所述反应混合物在10μl反应体积(不包含快速pngase f的体积)中包含0.2-1.5mg的标记的感兴趣的蛋白质和1-5μl的快速pngase f。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述反应混合物包含0.2mg的标记的感兴趣的蛋白质。23.根据权利要求21所述的方法，其中所述反应混合物包含5μl的快速pngase f。24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包含缓冲液。25.根据权利要求4至11中任一项所述的方法，其中所述至少一种聚糖是o-连接的聚糖。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述内切糖苷酶催化o-连接的聚糖的去糖基化。27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述内切糖苷酸酶包含内切-α-n-乙酰半乳糖胺酶(o-糖苷酶)。28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中用所述荧光标记物标记所述样品包含将所述样品加热到约35℃持续10-30分钟。29.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中用所述荧光标记物标记所述样品包含将所述样品加热到约35℃持续约15分钟。30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中使用还原性溶液使所述样品变性。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述还原性溶液包含二硫苏糖醇(dtt)。32.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中使用非还原性溶液使所述样品变性。33.根据权利要求32所述的方法，其中所述非还原性溶液包含碘乙酰胺(iam)。34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中使所述样品变性包含将所述样品加热到40℃至99℃持续1分钟至5小时。35.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中使所述样品变性包含将所述样品加热到50℃至99℃持续1分钟至60分钟。36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其中淬灭所述未反应的荧光标记物包含添加终止溶液。37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其进一步包含平行于所述样品分析参照标准品。38.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述电泳选自由凝胶电泳、等电聚焦、毛细管电泳(ce)或微芯片毛细管电泳(mce)组成的组。39.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述电泳是mce。40.根据权利要求39所述的方法，其中所述mce使用mce仪器进行。41.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中当与使用在去糖基化后标记的样品生成的电泳图相比时，所述方法导致在小于20kda范围内的减少的游离染料干扰和在电泳图中减少的或不存在的内切糖苷酶峰。42.根据权利要求41所述的方法，其中当与使用在去糖基化后标记的样品生成的电泳图相比时，所述内切糖苷酶峰减少至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
43.根据权利要求41所述的方法，其中当与使用在去糖基化后标记的样品生成的电泳图相比时，在电泳图中不存在所述内切糖苷酶峰。44.一种确定感兴趣的蛋白质的稳定性的方法，其包含：a.对包含所述感兴趣的蛋白质的样品进行应激；b.使所述应激的样品和包含所述感兴趣的蛋白质的非应激的样品变性；c.用荧光标记物标记所述应激的样品和所述非应激的样品，以产生标记的应激的样品和标记的非应激的样品；d.淬灭所述标记的应激的样品和所述标记的非应激的样品中的未反应的荧光标记物；e.用内切糖苷酶去糖基化所述标记的应激的样品和所述标记的非应激的样品；f.对所述标记的应激的样品和所述标记的非应激的样品进行微芯片毛细管电泳(mce)，以生成所述应激的样品和所述非应激的样品的电泳图；以及g.比较来自所述应激的样品和所述非应激的样品的电泳图，从而确定所述感兴趣的蛋白质的稳定性；其中在步骤(e)中去糖基化之前，在步骤(b)至(d)中对所述应激的样品和所述非应激的样品进行变性、标记和淬灭。45.根据权利要求44所述的方法，其中对所述样品进行应激包含对所述样品进行热应激。46.根据权利要求45所述的方法，其中对所述样品进行热应激包含将所述样品保持在约30℃至约45℃持续至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周或至少8周。47.根据权利要求44所述的方法，其中对所述样品进行应激包含至少一个冷冻/解冻循环。48.根据权利要求44所述的方法，其中对所述样品进行应激包含将所述样品暴露于储存条件。49.根据权利要求48所述的方法，其中所述储存条件包含约-80℃至-30℃的温度，持续至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少8个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或至少30个月。50.根据权利要求48所述的方法，其中所述储存条件包含约2℃至8℃的温度，持续至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少8个月、至少12个月或至少18个月。51.根据权利要求44所述的方法，其中对所述样品进行应激包含机械搅动所述样品。52.根据权利要求44所述的方法，其中对所述样品进行应激包含冻干和再水合所述样品。53.根据权利要求44所述的方法，其中对所述样品进行应激包含将所述样品暴露于光、辐射、单线态氧物质、自由基、高ph条件或低ph条件。54.根据权利要求44至53中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质包含至少一个糖基化位点。55.根据权利要求44至53中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质是糖基化的蛋白质。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述糖基化的蛋白质包含至少一个附接的聚糖。57.根据权利要求44至56中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质包含抗原结合结构域。58.根据权利要求57所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质包含抗体、抗体片段或scfv。59.根据权利要求44至58中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质包含fc结构域。60.根据权利要求44至59中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质包含受体融合蛋白。61.根据权利要求60所述的方法，其中所述受体融合蛋白是受体-fc融合蛋白或可溶性tcr-fc融合蛋白。62.根据权利要求60或61所述的方法，其中所述受体融合蛋白是陷阱蛋白或微型陷阱蛋白。63.根据权利要求44至62中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质是重组人蛋白。64.根据权利要求54至63中任一项所述的方法，其中所述糖基化位点包含asn-x-ser/thr共有序列。65.根据权利要求56至64中任一项所述的方法，其中所述至少一个附接的聚糖是n连接的。66.根据权利要求65所述的方法，其中所述至少一个附接的聚糖与所述糖基化的蛋白质中的天冬酰胺n连接。67.根据权利要求44至66中任一项所述的方法，其中所述内切糖苷酶催化n-连接的聚糖的去糖基化。68.根据权利要求44至67中任一项所述的方法，其中所述内切糖苷酶选自由肽-n-糖苷酶f(pngase f)、内切糖苷酶h(endo h)、内切糖苷酶s(endo s)、内切糖苷酶d、内切糖苷酶f1、内切糖苷酶f2和内切糖苷酶f4组成的组。69.根据权利要求44至67中任一项所述的方法，其中所述内切糖苷酶是pngase f。70.根据权利要求69所述的方法，其中所述pngase f是快速pngase f。71.根据权利要求70所述的方法，其中所述快速pngase f是非还原性的。72.根据权利要求44至71中任一项所述的方法，其中对所述应激的样品和非应激的样品进行去糖基化包含将所述样品加热到约50℃持续10分钟。73.根据权利要求44至72中任一项所述的方法，其中对所述应激的样品和非应激的样品进行去糖基化包含用于各样品的反应混合物，所述反应混合物在10μl反应体积(不包含所述快速pngase f的体积)中包含0.2-1.5mg的标记的感兴趣的蛋白质和1-5μl的快速pngase f。74.根据权利要求73所述的方法，其中用于所述应激的样品和非应激的样品中的每一者的所述反应混合物包含5μl快速pngase f。75.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述应激的样品和非应激的样品中的每一者包含0.2mg的标记的感兴趣的蛋白质。
76.根据权利要求73至75中任一项所述的方法，其中用于所述应激的样品和非应激的样品中的每一者的所述反应混合物包含缓冲液。77.根据权利要求44至63中任一项所述的方法，其中所述至少一种聚糖是o-连接的聚糖。78.根据权利要求77所述的方法，其中所述内切糖苷酶催化o-连接的聚糖的去糖基化。79.根据权利要求77或78所述的方法，其中所述内切糖苷酸酶包含内切-α-n-乙酰半乳糖胺酶(o-糖苷酶)。80.根据权利要求44至79中任一项所述的方法，其中用所述荧光标记物标记所述应激的样品和非应激的样品包含将各样品加热到约35℃持续10-30分钟。81.根据权利要求44至79中任一项所述的方法，其中用所述荧光标记物标记所述应激的样品和非应激的样品包含将各样品加热到约35℃持续约15分钟。82.根据权利要求44至81中任一项所述的方法，其中使用还原性溶液使所述应激的样品和非应激的样品变性。83.根据权利要求82所述的方法，其中所述还原性溶液包含二硫苏糖醇(dtt)。84.根据权利要求44至81中任一项所述的方法，其中使用非还原性溶液使所述应激的样品和非应激的样品变性。85.根据权利要求84所述的方法，其中所述非还原性溶液包含碘乙酰胺(iam)。86.根据权利要求44至85中任一项所述的方法，其中使所述应激的样品和非应激的样品变性包含将所述样品加热到40℃至99℃持续1分钟至5小时。87.根据权利要求44至85中任一项所述的方法，其中使所述应激的样品和非应激的样品变性包含将所述样品加热到50℃至99℃持续1分钟至60分钟。88.根据权利要求44至87中任一项所述的方法，其中淬灭所述未反应的荧光标记物包含添加终止溶液。89.根据权利要求44至88中任一项所述的方法，其进一步包含平行于所述应激的样品和非应激的样品分析参照标准品。90.根据权利要求44至89中任一项所述的方法，其中比较所述应激的样品和非应激的样品的电泳图包含比较峰的数目、高度、位置、面积或其组合。

技术总结

本公开涉及使用电泳分析翻译后修饰的感兴趣的蛋白质的方法，所述方法包含在标记后将感兴趣的蛋白质去糖基化。感兴趣的蛋白质去糖基化。感兴趣的蛋白质去糖基化。

技术研发人员：

赵一鸣 H

受保护的技术使用者：

瑞泽恩制药公司

技术研发日：

2021.01.20

技术公布日：

2022/11/24