(19)国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202210098412.8
(22)申请日 2022.01.21
(83)生物保藏信息
CCTCC NO:M2018465 2018.07.11
(71)申请人 四川高福记生物科技有限公司
地址 610000 四川省成都市郫都区中国川
菜产业化功能区工业园区永和路389
号
(72)发明人 蒲小平 舒梨 邓燕 钟综
谢建将 景晓青 卫娟
(74)专利代理机构 南京普睿益思知识产权代理
事务所(普通合伙) 32475
专利代理师 曹花
(51)Int.Cl.
C12N 1/20(2006.01)
C12N 1/02(2006.01)A23L 33/135(2016.01)A23L 2/52(2006.01)A61K 35/747(2015.01)A61P 37/04(2006.01)C12R 1/25(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
一种后生元及其制备方法与应用，所述后生
物，所述植物乳杆菌LP220的保藏编号为CCTCC
NO:M2018465。
所述后生元的组成成分包括：植物乳杆菌LP220≥1*1011CFU/g，脂磷壁酸≥35ng/
kg，短链脂肪酸≥90μg/g，多肽的含量≥6％，且
分子量<1000DA的小分子肽占总肽含量的80％以
上，有机酸含量≥100mg/g。本发明还公开了后生
元的制备方法，以及该后生元在制备增强免疫力
的膳食补充剂、保健品、药品、食品或固体饮料中
的应用。本发明后生元含有1*1011CFU/g以上植
物乳杆菌菌体，富含小分子肽、短链脂肪酸，有机
酸、氨基酸等功能成分，后生元提高调节机体的
脏器指数、细胞免疫功能和NK细胞活性来显著增
强机体免疫功能。权利要求书2页 说明书14页序列表1页 附图5页CN 114480192 A 2022.05.13
C N 114480192
A
1.一种后生元，其特征在于，所述后生元包括灭活的植物乳杆菌LP220及其发酵代谢产物，所述植物乳杆菌LP220的保藏编号为CCTCC NO:M2018465。
2.如权利要求1所述后生元，其特征在于，所述后生元的组成成分包括：植物乳杆菌LP220≥1*1011CFU/g，脂磷壁酸≥35ng/kg，短链脂肪酸≥90μg/g，多肽的含量≥6.0％，且分子量<1000DA的小分子肽占总肽含量的80％以上，有机酸含量≥100mg/g。
3.如权利要求2所述后生元，其特征在于，所述短链脂肪酸包括乙酸、异戊酸、异丁酸、己酸、丁酸、丙酸、戊酸，所述丁酸的含量≥2.0μg/g，戊酸的含量≥0.5μg/g。
4.一种如权利要求1～3任一项所述后生元的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S2、植物乳杆菌发酵：将S1活化得到的培养菌种转接至发酵培养基中搅拌3～10min，然后在30～38℃静置发酵，直至发酵液OD600≥8且有机酸含量≥20mg/g，停止发酵并在100～120℃下热灭活5～10min；
S3、脱与浓缩：将S2灭活后的发酵液经纳滤膜脱、初级浓缩，再进行双效真空浓缩；
S4、粉剂制备：将S3得到的浓缩液喷雾干燥后再过筛，得到后生元(植物乳杆菌LP220)。
5.如权利要求4所述后生元的制备方法，其特征在于，S1菌种活化采用三代活化培养技术，所述三代活化培养技术的具体操作为：
(1)一代活化培养
在无菌操作台下，用接种环将植物乳杆菌LP220菌种，接入已灭菌、温度在30‑38℃的100ml配置培养基试管内，轻轻振荡使菌种溶解混匀；将已接植物乳杆菌LP220菌种的配置培养基试管放入30‑38℃恒温培养间，静置培养8±2小时，待OD600＞2时，将培养好的一代植物乳杆菌LP220菌种放入冰箱4℃以下冷藏；
(2)二代活化培养
在无菌操作台下，取约100ml一代植物乳杆菌LP220菌种接入已灭菌、温度在30‑38℃的1000ml配置培养基三角瓶中，轻轻摇动至混合均匀；将已接一代植物乳杆菌LP220菌种的配置培养基三角瓶放入30‑38℃的恒温培养间，静置培养8±2小时，待OD600＞2时，将培养好的二代植物乳杆菌LP220菌种放入冰箱4℃以下冷藏；
(3)三代活化培养
在无菌操作台下，取约500ml二代植物乳杆菌LP220菌种接入已灭菌、温度在30‑38℃的10000ml培养基中，振摇混合均匀；将已接二代植物乳杆菌LP220菌种的培养基发酵罐在30‑38℃的恒温静置培养8±2小时，待OD600＞2时，即得到培养好的三代植物乳杆菌LP220菌种，放入冰箱4℃以下冷藏，贮存期限：3天。
6.如权利要求4所述后生元的制备方法，其特征在于，S3的具体操作为：将S2灭活后的发酵液冷却至45℃以下，用膜分子量200‑300Da的纳滤膜进行脱、初级浓缩，当灭活发酵液固形物含量30‑40％时，初级浓缩完成，转入进行双效真空浓缩，真空度≥‑0.07MPa，温度65‑70℃，当浓缩液浓度达到50‑60％时，停止浓缩，并用无菌氢氧化钙，将浓缩液pH调至4.5‑5.0，备用。
7.如权利要求4所述后生元的制备方法，其特征在于，S4的具体操作为：将S3得到的浓缩液喷雾干燥后的后生元(植物乳杆菌LP220)粉，经60～100目旋转振荡筛筛分，过筛的后生元(植物乳杆菌LP220)粉储
藏在不锈钢储罐中，不能通过振荡筛的筛上物料再经粉碎机
粉碎后装入不锈钢储罐中。
8.如权利要求4～7任一项所述后生元的制备方法，其特征在于，所述后生元的制备方法还包括：S5、包装检测：将S4得到的后生元(植物乳杆菌LP220)抽入装袋机，通过管道输入至自动包装机内，按每袋1kg自动称量，热合、喷码后封袋传送至成品暂存间进行抽样检测，其中后生元外观白或类白、无异味、菌数不低于1*1011CFU/g，分散性溶解实验不沉降，水分低于5％，多肽的含量≥6.0％。
9.一种含如权利要求1～3所述的后生元的膳食补充剂或固体饮料。
10.如权利要求1～3任一项所述的后生元在制备增强免疫力的膳食补充剂、保健品、药品、食品或固体饮料中的应用。
一种后生元及其制备方法与应用
技术领域
[0001]本发明涉及微生物应用技术领域，尤其是涉及一种后生元及由其制备方法与应用。
背景技术
[0002]后生元是指对宿主健康有益的无生命微生物和/或其成分的制剂。后生元是人为灭活的微生物细胞，可添加已被证明有益健康的代谢物或细胞成分，亦可不添加，根据分类，后生元主要有代谢产物和菌体成分两大类物质，代谢产物包括：有机酸、短链脂肪酸、细胞内多糖、维生素、蛋白质、酵素、脂质；菌体成分包括：脂壁酸、磷壁酸、肽聚醣、细胞表面蛋白、多醣、细胞膜蛋白、细胞外多糖。后生元相对益生菌粉运输和储存都更加方便，且使用后生元可以在获得益生菌类似益生功效的同时，避免了活菌本身应用行业窄、生物利用度低、效果不稳定、易传递耐药基因等问题，因此，后生元现在被广泛应用到保健食品、食品加工等行业。
[0003]但是，目前国内后生元主要依靠日本及欧美进口，且现有后生元功能不明确，有效组分缺乏，产品质量不稳定，颜较深，有异味，特别是稳定性和分散性差，不能大规模生产，因此，亟需开发组分与功能明确、可工业规模化生产的后生元，并结合后生元的特性，探究工业化制备方法具有迫切的技术需求。
[0004]此外，现有的后生元大部分与多种菌种或其他成分进行混合使用，如 CN113854461A公开的一种复合后生元固体饮料及其制备方法，CN112544721A 公开的后生元奶片及其制备方法，由于涉及多种益生菌的后生元制备，其制备方法复杂，产品性能不稳定，此外，现有技术中极少报道由单一菌种发酵制备且具备增强免疫功能的后生元，因此，亟需开发新的后生元。
发明内容
[0005]本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种组分明确及其质量稳定的后生元及由其组成后生元的制备方法，以及采用该制备方法获得的后生元的应用。[0006]本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
[0007]一种后生元，所述后生元包括灭活的植物乳杆菌LP220及其发酵代谢产物，所述植物乳杆菌LP220的保藏编号为CCTCC NO:M2018465，植物乳杆菌LP220 的保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2018年7月11日，分类命名为：Lactobacillus plantarum LP220。
[0008]所示植物乳杆菌LP220是从天津农家玉米秆中分离纯化得到。植物乳杆菌 LP220在BMRS琼脂培养基上菌落呈圆形、菌落大小中等、乳白、向上凸起、菌落边缘较为整齐。革兰氏染后显微镜下呈阳性，扫描电镜下呈杆状。
[0009]将分离得到的乳酸菌送至中国典型培养物保藏中心进行16S rDNA鉴定，通过采用细菌通用引物27F和1492R对其16S rDNA进行扩增，将扩增后的16S r DNA序列输入NCBI数
据库进行比对，与G e n e b a n k中的标准菌株L a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m s u bs p.pla n ta r um A T C C14917相似率达100％，可初步鉴定该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。植物乳杆菌LP220的16S rDNA鉴定序列如 SEQ ID.1所示。[0010]所述后生元的组成成分包括：植物乳杆菌LP2
20≥1*1011CFU/g，脂磷壁酸≥35ng/ kg，短链脂肪酸≥90μg/g，多肽的含量≥6％，且分子量<1000DA的小分子肽占总肽含量的80％以上，有机酸含量≥100mg/g。
[0011]所述短链脂肪酸包括乙酸、异戊酸、异丁酸、己酸、丁酸、丙酸、戊酸，所述丁酸的含量≥2.0μg/g，戊酸的含量≥0.5μg/g。
[0012]本发明解决其技术问题所采用的另一技术方案是：
[0013]一种后生元的制备方法，包括以下步骤：
[0014]S1、菌种活化；
[0015]S2、植物乳杆菌发酵：将S1活化得到的培养菌种转接至发酵培养基中搅拌 3～10min，然后在30～38℃静置发酵，直至发酵液OD600≥8且有机酸含量≥ 20mg/g，停止发酵并在100～120℃下热灭活5～10min；
[0016]S3、脱与浓缩：将S2灭活后的发酵液冷却至45℃以下，用膜分子量200‑300Da 的纳滤膜进行脱、初级浓缩，当灭活发酵液固形物含量30‑40％时，初级浓缩完成；然后转入进行双效真空浓缩，真空度≥‑0.07MPa，温度65‑70℃，当浓缩液浓度达到50‑60％时，停止浓缩，并用无菌氢氧化钙，将浓缩液pH调至4.5‑5.0，备用；
[0017]S4、粉剂制备:
[0018](1)喷雾干燥
[0019]喷雾干燥过程中，进风温度自动控制在100‑150℃之间，出风温度自动控制在 60‑80℃之间。
[0020](2)筛分
[0021]经喷雾干燥塔喷干后的后生元(植物乳杆菌LP220)粉经过60～100目旋转振荡筛过筛后，储藏在不锈钢储罐中，不能通过振荡筛的物料经粉碎机粉碎后装入不锈钢储罐中。[0022]S5、包装检测：将不锈钢储罐中的后生元(植物乳杆菌LP220)抽入装袋机，通过管道输入至自动包装机内，按每袋1kg自动称量，热合、喷码后封袋传送至成品暂存间进行抽样检测，其中后生元外观白或类白、无异味、菌数不低于1*1011CFU/g，分散性溶解实验不沉降，水分低于5％，多肽的含量≥6.0％。。
[0023]6、入库：包装后的检测合格后，进行入库。
[0024]S1菌种活化采用三代活化培养技术，所述三代活化培养技术的具体操作为：[0025](1)一代活化培养
[0026]在无菌操作台下，用接种环将植物乳杆菌LP220菌种，接入已灭菌、温度在 30‑38℃的100ml配置培养基试管内，轻轻振荡使菌种溶解混匀。
[0027]将已接植物乳杆菌LP220菌种的配置培养基试管放入30‑38℃恒温培养间，静置培养8±2小时，待OD600＞2时，将培养好的一代植物乳杆菌LP220菌种放入冰箱4℃以下冷藏。[0028](2)二代活化培养
[0029]在无菌操作台下，取约100ml一代植物乳杆菌LP220菌种接入已灭菌、温度在入30‑38℃的1000ml配置培养基三角瓶中，轻轻摇动至混合均匀。
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