[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公开说明书
[11]公开号CN 1368553A [43]公开日2002年9月11日
[21]申请号02115486.4[21]申请号02115486.4
[22]申请日2002.01.30[71]申请人武汉大学
地址430072湖北省武汉市武昌珞珈山
[72]发明人陈蔚梅 冯胜彦 郭明雄 艾建宇 吴斌
熊晓然 吴显辉 [74]专利代理机构武汉科宏专利事务所代理人王敏锋
[51]Int.CI 7C12P 19/28
权利要求书 1 页 说明书 8 页
[54]发明名称
[57]摘要
本发明公开了一种抗病毒药物利巴韦林的制备
方法。采用乙酰短杆菌ATCC39311菌株，以淀粉、蛋
白胨、牛肉膏、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、
本发明工艺简便，方法易行，作为酶源的细菌发酵时
间短，生产成本低廉，产物得率高，便于储存和重复
使用。
02115486.4权 利 要 求 书第1/1页
1.一种抗病毒药物利巴韦林的制备方法，包括下列步骤：
A、酶源菌体发酵培养基的配制：
淀粉0.1％～2.0％，蛋白胨0.2％～1.0％，牛肉膏0.05％～0.5％，氯化钠0.01％～0.12％，磷酸氢二钾0.33％，磷酸二氢钾0.10％，消泡剂0.02％，自来水95.95％～99.19％，发酵液pH值控制在7.0-8.5；
B、酶源菌体的发酵：
采用发酵罐；空气流量为1∶0.8～1∶1.5；罐压为0.02MPa～0.05MPa；发酵温度为28℃～32℃；种子培养基及发酵工艺控制与一般发酵控制条件相同；发酵时间为16小时～22小时；
C、酶源菌体的发酵后处理：
细菌出罐经离心分离后，于磷酸缓冲液重悬，备用；
酶反应底物为：肌苷和三氮唑甲酰胺；酶反应底物浓度分别为10m m o l/L ～200mmol/L；投料比：肌苷∶三氮唑甲酰胺＝1∶1～1∶1.5；酶用量：60mg～200mg 湿菌体/ml反应液；反应条件：65℃，24小时；
E、产物的分析测定：反应结束后，离心分离菌体，取上清反应液，用高效液相谱法检测。
02115486.4说 明 书第1/8页
一种抗病毒药物利巴韦林的制备方法
技术领域
本发明涉及一种抗病毒药物利巴韦林的制备方法，该药物是一种广谱抗病毒药物，适用于流感、口腔疱疹、流性出血热疾病的。
背景技术
利巴韦林的合成有三种方法，即化学法、发酵法和酶促法。
化学合成利巴韦林的方法很多。但是这类方法的操作步骤多，副产物多，产率低，成本高。
发酵法参见文献(Journal of The Agricultural Chemical Society，50(9)，430～423(1976)，日本公开专
利17830/1979)。该法弊端为必须每次培养菌体；培养时间长，生产效率低；有多种副产物的积累，产率低；利巴韦林的分离纯化困难。
酶促法由W i t k o w s k i等首创(参见U S P a t e n t 3,976,545/1976)。该法缺陷为需要的核糖-1-磷酸不易买到，纯酶的价格昂贵。
1986年Fujishima等利用5L发酵罐发酵Brevibacterium acetylicum AT-6-7菌体作酶源，以肌苷、胞苷作核糖供体，利巴韦林的转化率分别为75.66％、88.60％；1986年F u j i s h i m a等同时指出，乙酰短杆菌(A T C C39311)是公知的具有最高酶活的菌株(参见US Patent 4614719)。
1989年P o c h o d y l o等发明了浓胶反应的方法。他们利用10L发酵罐发酵Brevibacterium acetylicum ATCC39311菌体作酶源，底物浓度提高到100mmol/L～200m m o l/L，70℃反应，三次抽提，以鸟苷作核糖供体时，利巴韦林的产率达78％～80％(参见European Patent 0307853A2)。
1995年Yamauchi等同样利用500ml摇瓶，在50℃培养Bacillus
stearothermophilus TH6-2(FERM BP-2578)菌体作酶源，以肌苷、鸟苷作核糖供体时，利巴韦林的转化率分别为83.6％、98.4％(参见US Patent 5384251)。 但是，由于目前唯有肌苷的工业生产水平最高，市场价格最低(比其他底物低一倍以上)。所以在目前的生产条件下，只有用肌苷作核糖供体生产利巴韦林，才具有工业价值。
上述表明，采用现有的技术，都存在一定的局限，利巴韦林的产率已经受到了核苷磷酸化酶活性的限制。所以，以肌苷作核糖供体时，利巴韦林的产率都低于85％；其工业化也受到了菌体发酵原料和反应底物成本的限制。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种抗病毒药物利巴韦林的制备方法，方法易行，工艺简便，生产成本低廉，缩短了生产周期，提高了生产效率。
利巴韦林(Ribavirin，RBV)的化学名称是1-β-D-呋喃核糖苷-1，2，4-三氮唑-3-甲酰胺(1-β-D-ribofuranosyl-1，2，4-triazole-3-carboxamide)。利巴韦林是国家医药总局确定载入《国家基本药物》所用的名称。它的商品名为病毒唑。文献检索通常用“Ribavirin或RBV”作为关键词。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施，其步骤如下：
1)酶源菌体发酵培养基的配制：
淀粉0.1％～2.0％，蛋白胨0.2％～1.0％，牛肉膏0.05％～0.5％，氯化钠(NaCl) 0.01％～0.12％，磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)0.33％，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.10％，消泡剂(普通食用油)0.02％(V/V)，自来水95.95％～99.19％。发酵液p H值控制在7.0～8.5。
2)酶源菌体的发酵：
①采用发酵罐；
②空气流量为1∶0.8～1∶1.5；
③罐压为0.02MPa～0.05MPa；
④发酵温度为28℃～32℃；
⑤种子培养基及其它发酵工艺控制与一般发酵控制条件大致相同；
⑥发酵时间为16小时～22小时。
3)酶源菌体的发酵后处理：
细菌出罐经离心分离后，于磷酸缓冲液重悬，备用。
4)底物反应：
①酶反应底物为：肌苷和三氮唑甲酰胺；
②酶反应底物浓度分别为10mmol/L～200mmol/L；
③投料比：肌苷∶三氮唑甲酰胺＝1∶1～1∶1.5；
④酶(完整菌体)用量：60mg～200mg湿菌体/ml反应液；
⑤反应条件：65℃，24小时。
5)产物的分析测定：
反应结束后，离心分离菌体。取上清反应液，用高效液相谱法检测。工作条件为：日本S h i m a d z u S P D-6A V型高效液相谱仪；C-18柱(4.6m m×250mm，大连物化所)；流动相：水∶甲醇＝95∶5(V/V)；柱温：室温；流速：1ml/min；监测波长：220nm。
利巴韦林的转化率定义为：
本发明所涉及的A T C C39311菌株(公知菌株)，购自中国典型培养物保藏中心(武汉)。所用菌株的主要特征如下：
1)形态特征：培养温度为28℃～30℃。不同的培养时间菌体大小相差很大，生长早期为杆状，以后则近似球状，细胞常以多个聚合在一起，未见内生孢子形成；运动，革兰氏阳性。在平板上形成较小的菌落，圆形、扁平、边缘整齐；菌苔表面颜为乳白，基质未见水溶性素分泌。
2)生理生化特性：
①接触酶试验为阳性。
②糖发酵产酸阳性为：葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖、甘油等。
阴性为：阿拉伯糖、半乳糖、乳糖、山梨糖、木糖等。
本发明到了适应乙酰短杆菌A T C C39311菌株生理特点的发酵控制工艺，利用肌苷和三氮唑甲酰胺为底物进行反应，利巴韦林的转化率为95.1％。经连续3罐发酵所得菌体，进行酶促反应，利巴韦林平均转化率为94.4％。同时利用同一罐发酵所得菌体，进行连续60次反应，利巴韦林平均转化率为91.5％(见表2)。达到了缩短发酵周期、降低发酵成本，提高利巴韦林转化率的目的。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1)发酵培养基成本低。其特征为：本发明中培养基的碳源以淀粉为主，另加少量的牛肉膏。
2)发酵周期短，经16小时～22小时发酵培养即可得到较高酶活的利巴韦林合成细菌，比现有技术中24小时的发酵时间缩短了2小时～8小时。
3)本发明中作为酶源的菌体用量为60m g～200m g湿菌体/m l反应液，虽然
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议