(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.04.23
C N 103735557
A (21)申请号 201410007437.8
(22)申请日 2014.01.08
A61K 31/7024(2006.01)
A61P 35/00(2006.01)
(71)申请人扬州大学
地址225009 江苏省扬州市大学南路88号
(72)发明人孙云 刘畅 葛玲甜 王娟
(74)专利代理机构南京知识律师事务所 32207
代理人
卢亚丽
(54)发明名称
毛冬青皂苷Ilexsaponin A1在制备抗肿瘤药 物中的用途
(57)摘要
本发明公开了从海南冬青等植物中获得的单
体成分毛冬青皂苷Ilexsaponin A1在抗肿瘤方
面的医药新用途，即毛冬青皂苷Ilexsaponin A1
途。同时，也公开了以毛冬青皂苷Ilexsaponin A1
为原料制备成胶囊剂、片剂、滴丸剂、注射剂等药
物剂型。体外实验表明，在一定浓度范围内，毛冬
青皂苷Ilexsaponin A1对多种肿瘤细胞株具有 很强的抑制作用。因此，可以用于制备成抗肿瘤药
物以及预防肿瘤发生的药物或保健食品。
(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书3页 附图2页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书3页 附图2页(10)申请公布号CN 103735557 A
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1.毛冬青皂苷Ilexsaponin A1在制备和预防肿瘤药物或保健食品中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述抗肿瘤肝癌和胃癌。
3.一种药物制剂，其特征在于含有有效剂量的毛冬青皂苷Ilexsaponin A1和一种或多种药学上可接受的药用赋形剂，或可与毛冬青皂苷Ilexsaponin A1组方的其他药物。
4.根据权利要求3所述的药物制剂，其特征在于含有1%～99%的毛冬青皂苷Ilexsaponin A1和99%～1%的药用赋形剂或其他可组方的药物。
5.根据权利要求4所述的药物制剂，其特征在于含有30%～80%的毛冬青皂苷Ilexsaponin A1和70%～20%的药用赋形剂或其他可组方的药物。
6.根据权利要求5所述的药物制剂，其特征在于含有60%～70%的毛冬青皂苷Ilexsaponin A1和40%～30%的药用赋形剂或其他可组方的药物。
7.根据权利3所述的药物制剂，其特征在于所说的药物剂型选自于胶囊剂、片剂、滴丸剂、口服液体制剂、注射剂当中的任何一种。 权 利 要 求 书CN 103735557 A
毛冬青皂苷Ilexsaponin A1在制备抗肿瘤药物中的用途
技术领域
[0001] 本发明涉及医药技术领域，尤其涉及毛冬青皂苷Ilexsaponin A1的抗肿瘤活性以及毛冬青皂苷Ilexsaponin A1在制备抗肿瘤药物中的新用途。
背景技术
[0002] 毛冬青为冬青科冬青属植物毛冬青的根或叶，毛冬青皂苷Ilexsaponin A1是从毛冬青中提取的一种五环三萜皂苷（熊友香，等.中药材，2002，25(5)：371-374；昌艳艳，等.现代中西医结合杂志，2002，11(21)：2198-2199）。过去报道其具有一定的心血管药理作用，小鼠耳廓微循环实验表明毛冬青皂苷Ilexsaponin A1能显著延长小鼠出血以及凝血时间，大鼠FeCl
诱导血栓实验表明Ilexsaponin A1可减少大鼠腹主动脉血栓生成质量（周
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园，等.中药材，2011，34(5)：765-767）。我们研究发现毛冬青皂苷Ilexsaponin A1具有良好的抗肿瘤作用，特别是对人肝癌及胃癌等，在一定浓度范围内，对肿瘤细胞具有杀伤作用而不影响正常T细胞的活力及功能。此外，尚未见有文献报道将毛冬青皂苷Ilexsaponin A1制备成抗肿瘤药物。
发明内容
[0003] 本发明目的之一提供了毛冬青皂苷Ilexsaponin A1的抗肿瘤新用途；本发明目的之二提供了毛冬青皂苷Ilexsaponin A1的药物剂型。
[0004] 本发明提供了毛冬青皂苷Ilexsaponin A1在制备和预防肿瘤的药物或保健食品中的用途。
[0005] 本发明所指的肿瘤肝癌、胃癌等多种肿瘤。毛冬青皂苷Ilexsaponin A1可剂量依赖性地抑制肝癌、胃癌细胞活性但不影响正常T细胞分化，因此毛冬青皂苷Ilexsaponin A1具有高效抗肿瘤且低毒等特点。
[0006] 本发明的药物制剂含有1%～99%的毛冬青皂苷Ilexsaponin A1和99%～1%的药用赋形剂（包括其他可组方的药物），优选含30%～80%的毛冬青皂苷IlexsaponinA1和70%～20%的药用赋形剂（包括其他可组方的药物），最好含有60%～70%的毛冬青皂苷Ilexsaponin A1和40%～30%的药用赋形剂（包括其他可组方的药物）。
[0007] 按药剂学方法，可以将本发明的毛冬青皂苷Ilexsaponin A1制备成多个临床药物剂型用于抗肿瘤，包括口服制剂和非肠道给药的剂型。所指的口服制剂选自于胶囊剂、片剂、滴丸剂、口服液体制剂中的任意一种，所指的非肠道给药剂型为注射剂。
[0008] 本发明的抗肿瘤药物中的辅料是指常规的赋形剂，如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着剂、粘合剂等。本发明抗肿瘤药物中的其他配伍用的药物，指的是有效剂量的毛冬青皂苷Ilexsaponin A1为一定的药物原料，再配伍其他已允许合用的中药或化学药品。
附图说明
[0009] 图1是毛冬青皂苷Ilexsaponin A1的化学结构式
[0010] 图2是毛冬青皂苷Ilexsaponin A1作用于人肝癌细胞株HepG2（A）以及SMMC77210～72h（B）的抑制率图。
[0011] 图3是毛冬青皂苷Ilexsaponin A1作用于人胃癌细胞株SGC79010～72h的抑制率图。
[0012] 图4是毛冬青皂苷Ilexsaponin A1对小鼠正常T细胞分化的影响。
具体实施方式
[0013] 下面通过具体实施例来对本发明作进一步的说明，但这些实施例只是为了说明，而不是对本发明的限制。
[0014] 毛冬青皂苷Ilexsaponin A1的分子式C36H56O11，化学结构如图1。
[0015] （本发明用的毛冬青皂苷Ilexsaponin A1为中国药科大学生药教研室王强教授提供；对照品四川标准物质中心可以购买）
[0016] 实施例一：采用MTT比法检测毛冬青皂苷Ilexsaponin A1对人肝癌细胞株HepG2的活力影响：取对数生长期的肝癌细胞株HepG2，0.25%胰蛋白酶消化，收集消化状态下的细胞，计数细胞，用DMEM培养基稀释成103-104个/100μl浓度的单细胞悬液，每孔100μl，接种到96孔板上，置37℃，5%CO2，饱和湿度的细胞培养箱中，培养12h后。空白对照组加入缓冲液PBS，阴性对照组用等体积DMEM培养液，阳性对照组加入不同浓度的顺铂溶液，实验组加入不同浓度的毛冬青皂苷Ilexsaponin A1（20、40、80、160μg/ml），每个浓 、饱和湿度的细胞培养箱中，培养4h后，度设6个复孔，每孔20μl。96孔板置37℃、5%CO
2
加入5mg/mlMTT，每孔10μl，培养4h，每孔加入150μl DMSO，摇床振荡10min，酶标仪上测定其吸光
度(A值)，吸收波长为570nm。分别测定24、48、72h的OD值，并计算相对抑制率，公式如下：抑制率(%)=(1-A实验组/A对照组)×100%。结果见图2A。
[0017] 结论：如图2A所示，毛冬青皂苷Ilexsaponin A1与HepG2细胞作用后，随这毛冬青皂苷Ilexsaponin A1的增加，其抑制率上升，在20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml和160μg/ml浓度时对HepG2细胞增殖有明显的抑制作用，与阴性对照组比较有显著性差异(P<0.05)，呈剂量依赖关系；同时，随着时间推移，毛冬青皂苷Ilexsaponin A1对HepG2细胞抑制率逐步增加，呈时间依赖关系。
[0018] 实施例二，采用MTT比法检测毛冬青皂苷Ilexsaponin A1对人肝癌细胞株SMMC7721的活力影响：方法学部分参照实施例一，结果见图2B。
[0019] 结论：如图2A所示，毛冬青皂苷Ilexsaponin A1与SMMC7721细胞作用后，随这毛冬青皂苷Ilexsaponin A1的增加，其抑制率上升，在20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml 和160μg/ml浓度时对SMMC7721细胞增殖有明显的抑制作用，与阴性对照组比较有显著性差异(P<0.05)，呈剂量依赖关系；同时，随着时间推移，毛冬青皂苷Ilexsaponin A1对SMMC7721细胞抑制率逐步增加，呈时间依赖关系。
[0020] 实施例三，采用采用MTT比法检测毛冬青皂苷Ilexsaponin A1对胃癌细胞株SGC7901的活力影响：方法学部分参照实施例一，结果见图3。
[0021] 结论：如图3所示，毛冬青皂苷Ilexsaponin A1与SGC7901细胞作用后，随这毛冬青皂苷Ilexsaponin A1的增加，其抑制率上升，在20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml和160μg/ml浓度时对SGC7901细胞增殖有明显的抑制作用，与阴性对照组比较有显著性
差异(P<0.05)，呈剂量依赖关系；同时，随着时间推移，毛冬青皂苷Ilexsaponin A1对SGC7901细胞抑制率逐步增加，呈时间依赖关系。
[0022] 4.实施例四，体外毛冬青皂苷Ilexsaponin A1对T细胞分化的影响
[0023] 按常规方法磁珠阴性选择法分离获得CD4+T细胞，分选的初始CD4+T细胞以109/ L密度接种于96孔培养板中，每个培养条件设复孔，用含L-谷氨酰胺、胎牛血清的1640培养液培养，培养板预先用含10μg/ml CD3单抗的PBS4℃包被过夜，再加入2.0μg/ml CD28可溶性单抗培养使初始T细胞活化，加入TGF(5ng/ml)和不同浓度（0、10、30、100、300μg/ ml）的毛冬青皂苷Ilexsaponin A1，共同孵育72h，固定、穿膜，缓冲液处理，加PE-CD25、Percp5.5-CD4和Foxp3-APC，进行FACS检测，结果见图4。
[0024] 结论：在0～300μg/ml浓度范围内，毛冬青皂苷Ilexsaponin A1对正常T细胞分化没有影响。
[0025] 实施例5.胶囊的制备毛冬青皂苷Ilexsaponin A1250g，淀粉2500g，将干燥好的淀粉与毛冬青皂苷
Ilexsaponin A1充分混合，过120目筛，充分混匀后制备胶囊1000粒，每粒含毛冬青皂苷Ilexsaponin A1250mg。
[0026] 实施例6.滴丸的制备600g聚乙二醇水浴溶化，加入毛冬青皂苷Ilexsaponin A1200g，充分搅拌后置于保温管中，后采用液体石蜡包裹，吸干石蜡油后加入少量滑石粉混匀，制备滴丸1000丸
[0027] 实施例7.片剂的制备毛冬青皂苷Ilexsaponin A1100g，淀粉1000g，糖粉200g，适量乙醇制粒后，经整粒机处理后，压片分装。
[0028] 实施例7.注射剂的制备毛冬青皂苷Ilexsaponin A110g，丙二醇20ml，聚乙二醇40ml，注射用水200ml，混合后水浴加热0.5h，注射用水加至500ml，超声处理10min，水浴加热0.5h，调节PH5.5～6.5，过滤澄明，灌封灭菌即得。
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