《食品工业科技》Science and Technology of Food Industry1997.No.6酶工程技术在食品添加剂生产中的应用 范伟平 欧阳平凯 吴 月
(南京化工大学生物工程与科学系，南京210009)
摘要 酶工程技术广泛应用于食品添加剂生产，不断开发新酶源，研制新产品，固定化酶反应器使生产连续化，设备小型化，生产成本降低，产品易纯化，收率提高。酶工程技术在这个生产领域显示了很大的使用价值和应用潜力。 关键词 酶工程 食品添加剂
1 前言
酶工程技术是利用酶和细胞或细胞器所具有的催化功能来生产人类所需产品的技术。包括酶的研制与生产，酶和细胞或细胞器的固定化技术，酶分子的修饰改造，以及生物传感器。食品工业是应用酶工程技术最早和最广泛的行业。近年来，由于固定化细胞技术应用化、固定化酶反应器的推广应用，促进了食品添加剂新产品的开发，产品品种增加，质量提高，成本下降，为食品工业带来了巨大的社会经济效益。本文对酶工程技术在食品添加剂生中应用推广情况作一概要介绍。 2 研制新酶源，调控酶特性，开发功能性食品添加剂
近年来在发达国家，酶工程技术加快了新酶源的开发，使功能性食品添加剂，如营养调味剂，低热量的甜味剂，食用纤维和脂肪替代品等发展迅速。例如目前国际市场上比较引人注目的新型低聚糖，但过去因为没有高效特异性产三糖以上的生产用酶，所以低聚糖一直难以走上市场。八十年代末，日本陆续开发了具有生成代聚糖特异性，以微生物为来源的酶，促进了低聚糖纯品生产技术快速进入实用化，使品种繁多的新产品相继在市场上出现。单是麦芽低聚糖(M OS)的酶源就开发了十几种。日本自从1988年异构乳糖生产以来，几乎每年向市场推出新的商品。低聚糖的品种不断翻新：如低聚半乳糖、低聚乳果糖、低聚木糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、低聚龙胆糖等等。
国内相继开始了这方面的研究。无锡轻工业学院金其荣、徐云开发利用了根霉菌产生的高温低聚糖酶，制备了一种新型低聚糖浆，与国内外生产的淀粉糖浆和低聚糖不同，具有甜味纯正、口感厚实的特点。华南理工大学利用微生物发酵所生产的B-果糖转移酶和B-呋喃果糖苷酶的催化作用，进行两步酶法催化分子果糖转移反应而生产低聚果糖。其组成主要是蔗果糖(GF2)，蔗果四糖(G F3)和蔗果五糖(G F4)[1]。江苏化工学院全易等[2]自制得选择性优良且价廉的糖化酶和异淀粉酶，生产出低甜度、低热量、高粘度、不被微生物发酵的甜味麦芽糖醇。这是国内开发的另一个功能性低甜度的甜味剂品种。
脂肪酶是只能在异相系统，或不溶性系统的油-水界面上水解酯的酶。由于脂肪酶的不稳定性，底物的水
不稳定性，酶的来源狭窄，提纯困难等原因，较长时期以来，其研究进展与蛋白酶、淀粉酶相比要慢得多，近年来，随着细胞工程、固定化技术、基因工程的兴起，脂肪酶的研究取得了日新月异的进步。目前已纯化应用的微生物脂肪酶的品种已超过二十种[3]，主要集中在根霉、曲霉、假丝酵母、青霉、地霉、毛霉、须霉、假单胞菌和金黄葡萄球菌等。甘油单酯及其衍生物在食品行业广泛用作乳化剂。在国外用于食品工业改善面包质量，诱导或快速形成巧克力面包的香味，改善蛋白发泡的脂肪酶的品种还有不少。
3 固定化酶和细胞技术趋于成熟，在生产中得到广泛应用
应用固定化技术，将酶或细胞通过物理或化学方法固定在水溶性或非水溶性的膜状、颗粒、管状的载体上，一般能明显地提高酶对热、对酸碱度的稳定性。在连续反应过程中不会流失，可用简单的方法回收再生，可使生产连续化，节约能耗，降低成
本，简化环保措施。固定化技术具有诸多的优点，使其在生产中迅速推广。早在1970年中国科学院生物研究所，上海生物化学研究所的酶学工作者同时开始了固定化酶和固定化细胞技术的研究工作，到70年代末这方面的研究已在国内许多科研单位、高等学校和厂矿企业推广和应用，并取得了明显的成果，现在固定化酶和细胞技术已被广泛应用于食品添加剂生产中。
3.1 在甜味剂生产中应用
1982年黎高翔等用黑曲霉A S3.4309葡萄糖淀粉酶共价偶联到戊二醛活化的烷基微孔玻璃上的技术，在杭州味精厂中试生产中，酶半衰期为179d。每公斤固定化酶可糖化2106kg淀粉以上，得到DE96左右的葡萄糖液。王惠莲等用戊二醛直接交联菌成功地用于生产，使用寿命达60～80d，生产能力可达5.6～5.9t/kg固定化细胞，在1984年已用于千吨/年高果糖浆生产，次年已用于年产万吨的高果糖浆生产。目前采用间隙式或用固定化葡萄糖异构酶在生物反应器内进行连续生产，制取果葡萄糖浆，则是酶工程在工业生产中最成功，规模最大的应用。
3.2 在调味剂生产中的应用
近年来在日本和美国利用酶水解蛋白制取的营养型调味剂和氨基酸复配调味品占调味剂市场很大的比重。其销售量已超过传统调味剂的数倍。在我国，利用酶生产新型调味剂才刚刚起步，江苏无锡三和水解蛋白有限公司，江苏锡成油脂化工有限公司和浙江力营养源厂等已开始向市场推出动植物水解蛋白产品。
1980年袁中一等将A BSE-纤维素固定化5-磷酸二酯酶用于5′-核苷酸的中试生产。每天降解2000L核酸液(10kg纯核酸)。酶利用效率比发酵法降解提高了30倍，成功地填补了我国核酸工业固定化酶制剂的空白。
3.3 在酸味剂生产中的应用
1974年日本田边制药公司首先采用固定化富马酸酶的方法建厂进行小批量生产L-苹果酸，之后逐年改进，采用卡拉胶固定黄短杆菌方法1000L反应器中转化富马酸底物,L-苹果酸日产量达10t以上。国内1980年，杨廉婉等首先以聚丙烯酰胺包埋产延胡索酸酶分皱褶丝酵母，转化延胡索酸铵为L-苹果酸，转化率在85%左右。连续工作稳定一个月，酶工作半衰期为95d。南京化工大学在80年代末也成功地开发了卡拉胶包埋黄短杆菌连续生产L-苹果酸的技术，现在固定化细胞反应器生产苹果酸技术已在工业生产中广泛应用。
采用酶法生产酒石酸可用大量廉价的无水马来酸为工业原料，工艺上具有操作简单，速率高，易制和高纯度酒石酸，经济效益高，安全性好等优点，所以目前世界上广泛采用该法生产酒石酸。国内已有江苏省微生物研究所成功地将中试成果推广到工业生产中。乳酸是食品工业中广泛使用的性能优良的酸味剂和防腐剂。国外关于海藻酸钙包埋乳酸菌生产乳酸的报道较多。这种方法具有操作简单，无毒性，不漏细胞，细胞固定后能长时间用于生产等优点。
3.4 在食品抗氧防腐剂生产中的应用
采用低浓度的乙醇、氨基酸和溶菌酶复酶添加入食品的杀菌防腐的方法越来越受到人们的重视，并在食品加工业中广泛推广。随着近年来酒精需求量的上升，固定化细胞技术应用于酒精工业生产方面的研究也变得非常活跃。日本协和发酵公司的固定化酵母连续发酵系统，半衰期可长达3个月，酒精产值接近理论值，已进入工业生产阶段。我国酶学者在这方面的研究也很活跃。
酶还可以直接作为食品抗氧防腐剂使用。在食品贮藏中，利用葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶加配葡萄糖、琼脂制成凝胶，封入聚乙烯膜小袋，放入食品的容器，可以除去残留氧，防止褐变。
3.5 在营养强化剂生产中应用
功能性营养强化剂主要包括氨基酸、维生素和微量元素等，此外还包括一些膳食纤维，功能性多糖，脂肪替代品和不饱和脂肪酸等。
1973年,L-天门冬氨酸是最早用固定化细胞在工业上大规模生产的氨基酸。用于固定大肠杆菌细胞的方法有聚丙烯胺凝胶法、琼脂凝胶包埋法、明胶-戊二醛固定法和卡拉胶固定法等。1982年，日本田边制药公司利用固定化细胞L-天门冬氨酸、B-脱羧酶催化合成L-丙氨酸也投入了工业生产。使用卡拉胶作为固定化载体。1978年国内孟广震等也开始了固定化酶法生产天门冬氨酸的研究。该技术现已在国内应用于工业生产。目前已经可以利用固定化细胞生产的氨基酸还有L-异亮氨酸、L-瓜氨酸、L-赖氨酸、L-氨酸、L-精氨酸、L-苯丙氨酸等等。
L-肉碱或称维生素B T也是一种新型功能性食品添加剂，它的主要作用是作为载体，将长链脂肪酸从线粒体膜外输送到膜内促进脂肪酸的B-氧
化。目前L-肉碱仅在瑞士、意大利、日本等少数国家能够生产。其制备方法有多种，其中酶法也有多种。
1991年，瑞士K ulla H报道了其突变株HK1349在400L反应器中试规模下，细胞循环方法连续转化C-丁基甜菜碱底物制备L-毒碱的结果，产L-肉碱达到60g/l，转化率95%以上，可连续数周生产。此方法转化率高，产物分离容易，产品纯度亦高。
4 非水相酶催化反应技术的应用
八十年代后期，界面酶学和非水酶学的研究取得突破性进展，极大地促进了脂肪酶多功能催化作用的开发。随着油脂加工业的发展和高品味的脂肪食品的开发，有机相的生物催化成为目前酶工程学的研究热点之一。在食品添加剂生产领域内，利用固定在有机相中的脂肪酶催化作用，把廉价的棕榈油和乌柏脂经酯交换反应，变成香味可口的类可可脂，用于巧克力糖果的生产，是一个诱人的研究课题。华南理工大学食品系[4]已经通过了小试，取得了可喜的成果。
日本富士油脂公司已得到有关生产技术的发明专利[5]。国外利用酶促酯交换反应把廉价的油脂改成高品质的食用油脂的很活跃。Eigtv ed等用人造奶油和不饱和脂肪酸的交换反应，使人造奶油熔点降低，改良了人造奶油质量[6]。山根等人用脂肪酶选择性水解鱼油，使鱼油中n-3PU F A含量由原来的15%～30%提高到50%。O kada等[7]用脂肪酶在微水介质中催化鱼油的酯交换反应也得到富含n-3P U F A的甘油三酯。Yo shimoto等用PEC-li-pase催化廿碳五烯酸(EPA)和DP PL的酯交换反应，制备了廿碳五烯酰棕榈卵磷脂(EP PC)。这种含高不饱和脂肪酸的卵磷酯具有细胞分化诱导作用，可作为癌症药物已引起瞩目。总之，非水溶剂中酯催化反应技术在食品添加剂生产中的应用具有很大的潜力。
5 固定化载体材料不断更新，生物反应器继续改进综合上述介绍实例可见，固定化细胞的制备方法大体可以分成吸附法、包埋法、共价结合法、交联法、多孔物质包络法、超过滤法等几十类。其中以包埋法使用最为普遍。采用戊二醛、甲苯二氰酸酯、双重氮联苯胺等直接与细胞表面的反应基团反应，使细胞彼此交联形成网状结构而固定化细胞的方法也是常用的固定化细胞的方法。利用金属丝网、棉布、尼龙布、海绵和泡沫塑料等多孔载体固定丝状真菌和放线菌，组成转盘式生物反应器，具有酶活下降少、酶活能长期保持的特点。已在果糖浆、糖化酶等产品连续工业生产中应用。由于发酵液中糖类产物粘性较大，利用超过滤膜固定化细胞的方法在食品添加剂较少被应用。为了提高固定化颗粒的强度，改善固定化颗粒的传递特性，调节固定化颗粒的比重，减少固定化过程中的活性损失，国内外酶学者进行不懈地努力，近一、二十年代来有关这方面的报道大量涌现。其中固定化成型机械的研究也不少，有滴落式、重力式、气压式、交流液压式、挤压固定式等等，南京化工大学研制出一种旋转挤出颗粒成型机,95年已通过江苏省科委中试鉴定，并已投入使用。
目前用食品添加剂生产中的生物反应器有：连续搅拌全混反应器、气升式和鼓泡式反应器、填充床反应器、流化床反应器、中空纤维膜反应器、转盘式生物反应器、筛板式反应器、交叉流动反应器、循环床反应器等等，品种繁多。由于生物反应物系理化性质复杂各异，迄今为止还没有一种通用的理想的反应器。譬如搅拌反应器，由搅拌产生的较大的剪切力，常常会破坏固定化细胞。气升式反应器中气泡容易凝并而造成气含率不足的现象，而填充床的传质系数和传热系数较低，容易产生给排气体不足的现象。
膜反应器成本高，而且当细胞浓度高时，常常会引起膜破裂，反应液需预处理等等。总之，生物反应器的结构设计还不断地被改进以适应生产工艺需要。
6 展望
综上所述，酶工程技术在食品添加剂生产中已经得到广泛的应用，固定化酶和细胞技术走向成熟，并已获得显赫的经济效益和社会效益。开发新的酶源和酶的新用途的研究不断增添食品添加剂新的品种，固定化方法和固定化载体材料不断更新，为食品添加剂工业生产的连续化和自动化创造了条件，降低了生产成本。非水相酶催化反应的理论和应用研究为食品添加剂的品种增加、产品结构改变开辟了新的渠道。酶工程技术在食品添加剂生产中应用前景十分广阔。
参考文献
1 林伟峰，赵谋明.酶法生产低聚果糖技术的探讨.食品与发酵工业,1996(4):76～86
2 全易等.麦芽糖醇的生产与应用.精细石油化工,1990(5):44～49
(下转第71页)
以C6∶0为内标，用标准脂肪酸溶液求得相对重量校正因子，其结果如表2所示。
表2 各脂肪酸组份的相对重量校正因子
脂肪酸C6∶0C8∶0C10∶0C12∶0相对重量校正因子C6∶0 1.53341.14400.98710.9835 3.3 氯仿与石油醚萃取法的结果比较
用壬酸作为内标物，经谱定量分析得到氯仿与石油醚萃取的结果，如表3所示。
由表3可看出，用氯仿萃取优于石油醚萃取，而且在实验过程中，石油醚易使啤酒中多糖物质形成絮状凝胶，使分层相当困难，需要静置很长时间，因此选用氯仿法较好。
3.4 回收实验
由于某些脂肪酸的含量是微量的，要得到好的定量结果，其回收率是十分重要的，回收实验测定了C6∶0、C8∶0、C10∶0、C12∶0系列脂肪酸的含量，其实验结果如表4所示。
其回收率除C10∶0为83.89%，其余均达90%以上，表明了本方法的可行性和正确性。
3.5 几种市售啤酒的测定结果
运用该方法对几种市售啤酒的测定结果如表5所示。
表3 青岛啤酒中各脂肪酸组份的含量
脂 肪 酸C6∶0C8∶0C10∶0C12∶0
氯仿萃取(mg/ml) 1.703×10-3 1.362×10-3 3.970×10-4 5.850×10-5石油醚萃取(mg/ml) 4.552×10-4 1.622×10-3 4.232×10-4 2.961×10-5
表4 脂肪酸在太湖水啤酒中的回收率
脂 肪 酸C6∶0C8∶0C10∶0C12∶0平均回收率(%)94.61102.197.0483.89相对偏差 2.8% 1.6% 2.6% 4.9%
表5 几种市售啤酒中脂肪酸组份的含量表
脂 肪 酸C6∶0C8∶0C10∶0C12∶0
太湖水啤酒(mg/ml) 1.012×10-3 5.380×10-3 3.334×10-3 2.566×10-4青岛啤酒(mg/ml) 1.703×10-3 1.362×10-3 3.970×10-4 5.850×10-5贝克啤酒(mg/ml) 1.391×10-3 3.750×10-3 5.645×10-4 4.697×10-4
4 结论
4.1 采用氯仿萃取啤酒中游离脂肪酸较简捷、快速、准确，大大优于石油醚萃取法。
4.2 毛细管谱分析具有不需衍生化，定量准确，分析速度快的优点，该方法的建立对于啤酒风味与品质的控制具有重要的实际意义。
参考文献
1 顾国贤主编.啤酒发酵.
2 Er nest C.H.,Chen A.M.T he R elease o f Fat-ty A cids as a Co nsequence o f YeastA uto ly sis
3 J.K rupcik,et al J.Chr o matog ra.Sci.vo l14, 478(1976)
(上接第83页)
3 张胜利，陈贵连.微生物胞外脂肪酶研究进展.工业微生物,1990,20(5):29～37
4 尹顺义，宗敏华等.有机相中脂肪酶催化棕榈油酯交换反应生产类可可酯的研究.食品与发酵工业,1995(2):17～215 曹淑桂.脂肪酶的底物特异性及其应用潜力.生物化学与生物物理进展,1995,22(1):9～13
6 山根桓夫，星野保.Bio Industr y,1990,7(7):47 7 O kada K,T akahashi K,Hatano M et al.,J.Jpn O il Chem.Soc.(Y U KA G AK U),1990(39):50
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议