(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011605799.9
(22)申请日 2020.12.30
(71)申请人 浙江大学
地址 310013 浙江省杭州市西湖区余杭塘
路866号
(72)发明人 阮晖 丁丽娜 吴渊 胡超凡
刘甜甜 何筱妍
(74)专利代理机构 杭州知闲专利代理事务所
(特殊普通合伙) 33315
代理人 万静
(51)Int.Cl.
A23L 33/00(2016.01)
A23L 29/00(2016.01)
C12N 1/20(2006.01)
C12N 1/18(2006.01)
C12R 1/865(2006.01)C12R 1/25(2006.01)C12R 1/07(2006.01)C12R 1/02(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种富含吡咯喹啉醌和γ‑氨
基丁酸的植物酵素及其制造方法，该方法包括将
糙米、山楂、红枣、沙棘按照比例混合后，得到混
合物；混合物粉碎后，加入麦曲，冲水混合，25～
30℃发酵48～72小时，得到发酵液；将酿酒酵母、
成菌悬液，加入至发酵液中，混匀，25～30℃继续
发酵24～48小时，澄清过滤，获得风味口感优良
且富含吡咯喹啉醌和γ‑
氨基丁酸的植物酵素。权利要求书2页 说明书10页CN 112602926 A 2021.04.06
C N 112602926
A
1.一种富含吡咯喹啉醌和γ‑氨基丁酸的植物酵素的制造方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将糙米、山楂、红枣、沙棘按照比例混合后，得到混合物；混合物粉碎后，加入麦曲，冲水混合，25～30℃发酵48～72小时，得到发酵液；
(2)将酿酒酵母、巴氏醋杆菌、植物乳杆菌和纳豆芽孢杆菌分别制成菌悬液，加入至步骤(1)的发酵液中，混匀，25～30℃继续发酵24～48小时，澄清过滤，获得富含吡咯喹啉醌和γ‑氨基丁酸的植物酵素。
2.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于，步骤(1)的发酵体系中，糙米、山楂、红枣和沙棘的混合比例为10:1:1:1；所述混合物与麦曲、水的比例为10:1:10。
3.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于，步骤(1)中，所述麦曲购自中粮孔乙己酒业有限公司，产品名称和编号为ZLKYJ‑MQ‑2020‑1。
4.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于，步骤(2)中，酿酒酵母菌悬液、巴氏醋杆菌菌悬液、植物乳杆菌菌悬液和纳豆芽孢杆菌菌悬液的制备方法，包括：将斜面菌种接到液体培养基，酿酒酵母接种至YPD液体培养基，巴氏醋杆菌接种至AC液体培养基，植物乳杆菌接种至MRS液体培养基，纳豆芽孢杆菌接种至FB液体培养基，均在33℃～39℃振荡培养20～36h，直至菌液密度为108～109cfu/mL，得到菌悬液。
5.如权利要求4所述的制造方法，其特征在于，步骤(2)中，所述酿酒酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC 2.1543，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心；所述巴氏醋杆菌为巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)CGMCC 1.4546，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心；所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC 1.511，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心；所述纳豆芽孢杆菌为纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ACCC 19833，保藏于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
6.如权利要求4所述的制造方法，其特征在于，步骤(2)中，以体积百分数计，四种菌悬液接种至发酵液的接种量均为0.8％～1.2％。
7.如权利要求4所述的制造方法，其特征在于，所述的YPD液体培养基，以1L计，包括以下组分：
该培养基的pH值调节至6.8～7.2；
所述的AC液体培养基，以1L计，包括以下组分：
该培养基的pH值调节至6.4～7.0。
8.如权利要求4所述的制造方法，其特征在于，所述的MRS培养基，以1L计，包括以下组分：
该培养基的pH值调节至6.0～6.8；
所述的FB培养基，以1L计，包括以下组分：
该培养基的pH值调节至pH 7.2～7.4。
9.一种如权利要求1～8任一项所述的制造方法制得的富含吡咯喹啉醌和γ‑‑氨基丁酸的植物酵素。
一种富含吡咯喹啉醌和γ‑氨基丁酸的植物酵素及其制造
方法
技术领域
[0001]本发明涉及食品加工技术领域，尤其涉及一种富含吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline Quinone，PQQ)和γ‑氨基丁酸(γ‑Aminobutyrate，GABA)的植物酵素及其制造方法。
背景技术
[0002]吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline Quinone，PQQ)是继黄素核苷酸(FMN，FAD)和烟酰胺核苷酸(NAD，NADP)之后，在膜束缚的细菌脱氢酶中发现的第3种辅基。PQQ虽然在生物体内含量非常低，但作用重要，不仅是新发现的一种线粒体呼吸链组分，参与催化生物体内氧化还原反应，还具有非常多样的生物活性，缺乏时会引起哺乳动物诸多代谢障碍。欧洲食品监管部门(EFSA Panelon Dietetic Products,Nutrition and Allergies)经过严谨详尽评估，已充分认定P Q Q的安全性，批准其作为功能性物质在食品中添加，批准号为Regulation(EC)No 258/97(Turck D,et al.Safety of pyrroloquinoline quinone disodium salt as a novel food pursuant to Regulation(EC)No258/97[J].EFSA J, 2017,15(11):UNSP 5058.)
[0003]浙江工商大学申报的发明专利“一种微生物共培养发酵生产含有吡咯喹啉醌食醋的方法(CN 201910796795.4)”，利用酿酒酵母、生丝微菌和巴氏醋杆菌构建共培养体系，生产富含PQQ的食醋，其中含有微量PQQ。吴银娣申报的发明专利“一种提高吡咯喹啉醌产量的方法”(CN 201611152572.7)，通
过对浅绿黄假单胞菌产PQQ的营养因子进行分析，控制培养基中特定氨基酸含量以及维生素含量，有效提高PQQ产量。福建师范大学申报的发明专利“定向驯化选育高产吡咯喹啉醌的甲基营养菌”(CN 201610059296.3)，提供了一种定向驯化选育高产PQQ的甲基营养菌突变株的方法，通过逐步提高培养基中的甲醇浓度对甲基营养菌进行应激驯化，提高了选育正突变率以及PQQ产量增加幅度。海正药业申报的发明专利“一种生丝微菌和吡咯喹啉醌的制备方法(CN 201510262476.7)”，其PQQ产率达到1783mg/ L，但该菌属于甲基营养菌，发酵时需要甲醇。目前进行PQQ发酵的微生物均不属于常用的食品发酵微生物。
[0004]γ‑氨基丁酸(γ‑Aminobutyrate，GABA)具有极其重要的生理功能，具有健脑益智、抗癫痫、促进睡眠、美容润肤、延缓衰老、降血压等功效。每日补充微量GABA有利于缓解高血压，促进体内氨基酸代谢平衡，调节免疫功能。闽南师范大学申报的专利“一种发芽糙米富集γ‑氨基丁酸的方法”(CN 202010513634.2)通过将糙米冷激处理后发芽富集GABA。吉林农业大学申报的专利“一种富含γ‑氨基丁酸啤酒的酿造工艺”(CN 202010042953.X)使用发芽糙米和向麦芽汁中加入假丝酵母菌株Y6发酵，得到富含GABA啤酒。天津科技大学申报的发明专利“一种高产γ‑氨基丁酸的乳杆菌及其分离培养方法和应用”(C N 201911184419.6)涉及一种高产GABA的植物乳杆菌及其分离培养方法和应用。
[0005]食用植物酵素是指以植物性食品原料，添加或不添加辅料，经过微生物发酵制得
的含有特定生物活性成分，可供食用的酵素产品。浙江大学申报的发明专利“一种改善哮喘的植物酵素及其制备方法”(CN 201710475099.4)以蓝莓、桑椹、柿子、冬虫夏草的天然植物原料各自不同时间与温度独立发酵，将发酵后的发酵料渣与发酵原液依照比例复配，得到二次发酵原酱酵素或复合植物酵素食品。北京中医药大学申报的发明专利“沙棘复合发酵液及其制备方法、保健饮品、植物酵素”(CN 202010183760.6)所述沙棘复合发酵液包括沙棘提取液、食物酶解液、培养液以及发酵剂，对酒精性肝损伤有明显改善效果。
[0006]纳豆是一种以纳豆芽孢杆菌为主、多种微生物参与共同发酵的健康食品，富含PQQ，但纳豆芽孢杆菌纯菌发酵时，产物中PQQ含量很低，这是因为纳豆芽孢杆菌虽然具有与PQQ合成相关的关键酶，但代谢途径并不完整，需要其它微生物如酵母、乳酸菌、醋酸菌等提供相关功能基因。乳酸菌则是制造酵素和合成GABA的重要微生物，基于此，将植物原料优化复配，通过食品级微生物如酵母、乳酸菌、醋酸菌和纳豆芽孢杆菌共发酵，可望获得富含PQQ 和GABA、并且风味浓郁丰富的植物酵素。
发明内容
[0007]本发明提供了一种富含吡咯喹啉醌(PQQ)和γ‑氨基丁酸(GABA)的植物酵素及其制造方法，该植物酵素的制备方法不仅简单，而且获得的产品中吡咯喹啉醌含量高达100μg/mL以上，γ‑氨基丁酸含量高达1.50μg/mL以上。
[0008]具体技术方案如下：
[0009]本发明提供了一种富含PQQ和GABA的植物酵素的制造方法，包括以下步骤：[0010](1)将糙米、山楂、红枣、沙棘按照比例混合后，得到混合物；混合物粉碎后，加入麦曲，冲水混合，25～30℃发酵48～72小时，得到发酵液；
[0011](2)将酿酒酵母、巴氏醋杆菌、植物乳杆菌和纳豆芽孢杆菌分别制成菌悬液，加入至步骤(1)的发酵液中，混匀，25～30℃继续发酵24～48小时，澄清过滤，获得富含PQQ和GABA的植物酵素。
[0012]本发明以糙米为发酵主料，以山楂、红枣、沙棘为配料进行调味，第一阶段以麦曲为糖化发酵剂，营造一个糖化充分且排除致病菌等杂菌从而微生态稳定的发酵环境，第二阶段加入食品级微生物如酵母、乳酸菌、醋酸菌和纳豆芽孢杆菌共发酵，制成植物酵素，在这个过程中，乳酸菌合成GABA，同时，纳豆芽孢杆菌的PQQ合成途径得到来自酵母、乳酸菌、醋酸菌的功能基因补充从而完整，能够高效合成PQQ。
[0013]进一步地，步骤(1)的发酵体系中，糙米、山楂、红枣和沙棘的混合比例为10:1:1: 1；所述混合物与麦曲、水的比例为10:1:10。
[0014]进一步地，步骤(1)中，所述麦曲购自中粮孔乙己酒业有限公司，产品名称和编号为ZLKYJ‑MQ‑2020‑1。
[0015]进一步地，步骤(2)中，酿酒酵母菌悬液、巴氏醋杆菌菌悬液、植物乳杆菌菌悬液和纳豆芽孢杆菌菌悬液的制备方法，包括：将斜面菌种接到液体培养基，酿酒酵母接种至YPD 液体培养基，巴氏醋杆菌接种至AC液体培养基，植物乳杆菌接种至MRS液体培养基，纳豆芽孢杆菌接种至FB液体培养基，均在33℃～39℃振荡培养20～36h，直至菌液密度为108～109cfu/mL，得到菌悬液。
[0016]进一步地，步骤(2)中，所述酿酒酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
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