(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011318669.7
(22)申请日 2020.11.23
(71)申请人 武汉市农业科学院
地址 430000 湖北省武汉市洪山区白沙洲
大道173号
(72)发明人 杨凯 高银爱 成为为 王青云
夏儒龙 魏辉杰 朱思华 李波
邓国乔
(74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务
所(普通合伙) 11350
代理人 傅海鹏
(51)Int.Cl.
A01K 61/10(2017.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种人工诱导雌性翘嘴鳜性
逆转的方法，包括：（1）翘嘴鳜亲本的选育；（2）翘
嘴鳜的人工催产；（3）斑鳜异源精子的获得；（4）
斑鳜异源精子的遗传失活；（5）翘嘴鳜成熟卵子
的获得；（6）翘嘴鳜人工雌核发育获得雌性个体；
（7）雌核发育鳜人工诱导转性。本发明可以将翘
嘴鳜先进行人工雌核发育诱导获得全雌鳜，然后
将全雌鳜通过人工雄性激素甲基睾丸酮（MT）诱
导产生具备XX基因型的“伪雄鱼”，且伪雄鱼的精
子具备普通雄鱼同样的受精能力，可与普通雌鱼
养殖产量及商业价值。权利要求书2页 说明书5页 附图3页CN 112535123 A 2021.03.23
C N 112535123
A
1.一种人工诱导雌性翘嘴鳜性逆转的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1：翘嘴鳜亲本的选育：翘嘴鳜雌鱼亲本源于长江野生体经过4代选育，斑鳜雄鱼亲本源于江西柘林湖野生斑鳜；
S2：翘嘴鳜的人工催产：采用一针注射，注射剂量为促黄体素释放激素类似物4μg/kg‑6μg/kg和绒毛膜促性腺激素800IU/kg‑1200IU/kg，采用0.7%的生理盐水稀释，亲鱼注射剂量为0.5mL～1.0mL/kg，雄鱼用量为雌鱼用量的一半；
S3：斑鳜异源精子的获得：成熟的斑鳜雄鱼注射性激素12小时后，采用人工挤精的方式获得精液；
S4：斑鳜异源精子的遗传失活：挤出的斑鳜精液按1：4的比例经Hanks液稀释后放入一个直径10cm的培养皿中，在冰盒上手动摇匀后连同冰盒一起放置在水平摇床上，连同摇床一起放入人工诱导雌核发育装置中，用两根15W UV紫外照射管充分照射25分钟，照射强度80mJ/cm2，照射距离为17cm，照射后将灭活的精液虹吸至多个5mL的Ep管中，进行0‑4℃的低温保存，保存期为24h；
S5：翘嘴鳜成熟卵子的获得：雌鱼发情后，将卵子人工挤入干燥的器皿中；
S6：人工雌核发育鳜的受精、孵化：将遗传失活的斑鳜异源精子与翘嘴鳜成熟卵子摇匀混合受精，时间30s，受精完成后，转移到淡水中进行冷休克处理，水温4℃，冷休克诱导处理时间为20‑25min，得到二倍体卵，转入方形孵化槽中孵化，水温25℃，按普通翘嘴鳜苗培育方法管理，得到翘嘴鳜雌核发育二倍体鱼苗，出苗后将鱼苗培育至2.5cm后用于转性； S7：诱导人工雌核发育鳜转性，主要包括以下步骤：
（1）17α‑甲基睾丸酮（MT）溶液的配制：计算出所需MT的总剂量，称取盛放在一棕玻璃瓶中，加入分析纯酒精溶解，母液①：100mg/L，充分振荡溶解后放入4℃冰箱保存；
（2）采用甲基睾丸酮激素溶液（2LH2O：20mL母液①）浸泡丰年虫0.5h；
（3）按照人工雌核发育鳜体重的5%捞取饥饿24h饵料鱼卖鲮至50L水中，然后用步骤（2）的含MT丰年虫投喂麦鲮0.5h；
（4）步骤（3）中摄食丰年虫的卖鲮投喂网箱中的人工雌核发育鳜，每次投喂2次，人工雌核发育鳜转性周期为30天；
（5）1个5m3的网箱可转性“伪雄鱼”300尾，养殖至第二年5月杀鱼取精，与翘嘴鳜卵子受精孵化，获得全雌鱼苗。
2.根据权利要求1所述的一种人工诱导雌性翘嘴鳜性逆转的方法，其特征在于，所述步骤S3中Hanks稀释液的配方为：KCL 0.4g，NaCL 8.00g，NaHCO3 0.35g，KH2PO4 0.06g，Na2HPO4•7H2O 0.09g，Na2HPO4•12H2O 0.10g，MgSO4•7H2O 0.10g，MgCL2•6H2O 0.10g，CaCL2 0.14g和Glucose 1.00g。
3.根据权利要求1所述的一种人工诱导雌性翘嘴鳜性逆转的方法，其特征在于，所述步骤S7中所用丰年
虫的孵化方法为：
（1）解冻：孵化前冷藏解冻24小时后用淡水浸泡2小时；
（2）孵化密度：每升水体中加入2g丰年虫卵，每次孵化丰年虫的重量为20g；
（3）孵化盐度：最适孵化盐度为15‰；
（4）孵化温度：控制在26‑28℃，保持恒定；
（5）光照：24小时保持2000lux以上的光照；
（6）PH值：控制在8.2‑8.3，若pH低，可每升水加入0.2‑0.5克碳酸氢钠；
（7）充气：孵化过程中保持连续充气无死角；
（8）孵化条件：保持以上孵化水体的要求，孵化30‑36小时后，将加热设备、通气和照明关掉；
（9）收集：静置10‑20min，丰年虫幼体沉到孵化桶底部，从底部把虫收集。
4.根据权利要求1所述的一种人工诱导雌性翘嘴鳜性逆转的方法，其特征在于，所述步骤S7中一种人工
诱导雌性翘嘴鳜性逆转所用网箱的规格为5m×1m×1m，40目，每个网箱均匀放置三个充气石，保证供氧充足，网箱悬挂于水泥池中，保持微流水，每两天清洗一次。
一种人工诱导雌性翘嘴鳜性逆转的方法
技术领域
[0001]本发明属于鱼类遗传育种领域，具体涉及一种人工诱导雌性翘嘴鳜性逆转的方法。
背景技术
[0002]翘嘴鳜俗称桂花鱼，隶属鲈形目、鮨科，在鳜属鱼类中体型最大、生长速度最快，是原产于中国各主要江河湖泊的名贵食用鱼。在本项目中所说的研究对象“鳜”均指“翘嘴鳜”。据统计，全国鳜鱼养殖年产量达到50万吨以上，直接年产值约300亿元，在淡水名优鱼类养殖中占有非常重要的地位。但是，全国90％的鳜种苗繁育单位不注重鳜亲鱼选育和保种，近亲繁殖严重，养殖期间暴露出种质退化、生长慢、抗病差、畸型率高等突出问题，优质良种的极度缺乏大大制约着鳜养殖业的发展。
[0003]人工雌核发育技术在鱼类遗传育种中的应用已十分广泛，在快速建立纯系、提高生长率、性别控制和品质提升等方面发挥了重要作用，如全雄罗非鱼和全雄黄颡鱼等品种的育成对产业发展产生了划时代的影响。研究资料表明鳜生长存在雌雄二态性，李达等对鄱阳湖鳜生长和性腺发育进行了研究，认为
雌性鳜的生长速度在各龄中均比雄性的要快，性腺发育呈现周年变化，雌性成熟系数周年变化在0.79％～10.07％，雄性为0.24％～3.83％，均在4、5月达到最大。王晓清等则认为体重170g以内时，雌、雄鳜生长无显著差异；170g到800g时，雌鱼的生长速度明显地快于雄鱼；800g以上雌鱼生长减慢，雄鱼生长开始快于雌鱼；1kg以内的鳜雌大雄小,1kg以上时一般雄大雌小。
[0004]鱼类雌雄生长二态性促使单性养殖成为有效育种方法之一，单性养殖可以大大提高养殖产量及商业价值。因此培育全雌性的单性品种，具有直接的生产应用价值。研究发现，翘嘴鳜的遗传决定类型为XX/XY型，培育全雌性品种需要将翘嘴鳜先进行人工雌核发育诱导获得雌性后代，其后代雌鱼(XX型)通过人工雄性激素(MT)诱导产生具备XX基因型的“伪雄鱼”，且伪雄鱼的精子具备同普通雄鱼同样的受精能力，可正常规模化繁育全雌苗作为养殖苗种。
发明内容
[0005]本发明的目的就在于为了解决现有技术中鳜种苗繁育养殖期间存在种质退化、生长慢、抗病差、畸型率高等问题，提供了一种人工诱导雌性翘嘴鳜性逆转的方法，将翘嘴鳜先进行人工雌核发育诱导，其后代雌鱼通过人工雄性激素诱导产生具备XX基因型的“伪雄鱼”，且伪雄鱼的精子具备普通雄鱼同样的受精能力，可实现规模化正常繁育全雌后代作为养殖苗种，解决了上述技术问题。
[0006]本发明通过以下技术方案来实现上述目的，一种人工诱导雌性翘嘴鳜性逆转的方法，该方法包括
以下步骤：
[0007]S1：翘嘴鳜亲本的选育：翘嘴鳜雌鱼源于长江野生体经过4代选育的雌鱼，斑鳜雄鱼源于江西柘林湖野生斑鳜；
[0008]S2：翘嘴鳜的人工催产：采用一针注射，注射剂量为促黄体素释放激素类似物4μg/ kg‑6μg/kg和绒毛膜促性腺激素800IU/kg‑1200IU/kg，采用0.7％的生理盐水稀释，亲鱼注射剂量为0.5mL～1.0mL/kg，雄鱼用量较雌鱼用量减半；
[0009]S3：斑鳜异源精子的获得：成熟的斑鳜雄鱼注射性催产激素12小时后，采用人工挤精的方式获得精液；
[0010]S4：斑鳜异源精子的遗传失活：挤出的斑鳜精液按1：4的比例经Hanks液稀释后放入一个直径10cm的培养皿中，在冰盒上手动摇匀后连同冰盒一起放置在水平摇床上，连同摇床一起放入人工诱导雌核发育装置中，用两根15W UV紫外照射管充分照射25分钟，照射强度80mJ/cm2，照射距离为17cm，照射后将灭活的精液虹吸至多个5mL的Ep管中，进行0‑4℃的低温保存，保存期为24h；
[0011]S5：翘嘴鳜成熟卵子的获得：雌鱼发情后，将卵子人工挤入干燥的器皿中；[0012]S6：人工雌核发育鳜的受精、孵化：将遗传失活的斑鳜异源精子与翘嘴鳜成熟卵子摇匀混合受精，时间30s，受精完
成后，转移到淡水中进行冷休克处理，水温4℃，冷休克诱导处理时间为20‑25min，得到二倍体卵，转入方形孵化槽中孵化，水温25℃，按普通翘嘴鳜苗培育方法管理，得到翘嘴鳜雌核发育二倍体鱼苗，出苗后将鱼苗培育至2.5cm后用于转性；[0013]S7：人工诱导雌核发育鳜转性，主要包括以下步骤：
[0014](1)17α‑甲基睾丸酮(MT)溶液的配制：计算出所需MT的总剂量，称取盛放在一棕玻璃瓶中，加入分析纯酒精溶解，母液①：100mg/L，充分振荡溶解后放入4℃冰箱保存；[0015](2)采用甲基睾丸酮激素溶液(2LH2O：20mL母液①)浸泡丰年虫0.5h；
[0016](3)按照人工雌核发育鳜体重的5％捞取饥饿24h饵料鱼卖鲮至50L水中，然后用步骤(2)的含MT丰年虫投喂麦鲮0.5h；
[0017](4)步骤(3)中摄食丰年虫的卖鲮投喂网箱中的人工雌核发育鳜，每次投喂2次，人工雌核发育鳜转性周期为30天；
[0018](5)1个5m3的网箱可转性“伪雄鱼”300尾，养殖至第二年5月杀鱼取精，与翘嘴鳜卵子受精孵化，获得全雌鱼苗。
[0019]上述的一种人工诱导雌性翘嘴鳜性逆转的方法，所述步骤S3中Hanks稀释液的配方为：KCL 0.4g，NaCL 8.00g，NaHCO3 0.35g，KH2PO4 0.06g，Na2HPO4·7H2O 0.09g，Na2HPO4·12H2O 0.10g，MgSO4·7H2O 0.10g，MgCL2·6H2O 0.10g，CaCL2 0.14g和Glucose 1.00g。
[0020]上述的一种人工诱导雌性翘嘴鳜性逆转的方法，所述步骤S7中所用丰年虫的孵化方法为：
[0021](1)解冻：孵化前冷藏解冻24小时后用淡水浸泡2小时；
[0022](2)孵化密度：每升水体中加入2g丰年虫卵，每次孵化丰年虫的重量为20g；[0023](3)孵化盐度：最适孵化盐度为15‰；
[0024](4)孵化温度：控制在26～28℃，保持恒定；
[0025](5)光照：24小时保持2000lux以上的光照；
[0026](6)PH值：控制在8.2‑8.3，若pH低，可每升水加入0.2‑0.5克碳酸氢钠；
[0027](7)充气：孵化过程中保持连续充气无死角；
[0028](8)孵化条件：保持以上孵化水体的要求，孵化30‑36小时后，将加热设备、通气和
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