(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.07.30
C N 103951761
A (21)申请号 201410200699.6
(22)申请日 2014.05.13
C08B 37/00(2006.01)
(71)申请人浙江工商大学
地址310018 浙江省杭州市下沙高教园区学
正街18号
(72)发明人周涛 许莉莉
(74)专利代理机构杭州中成专利事务所有限公
司 33212
代理人
金祺
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种酶法降解浒苔多糖的方
法：将浒苔粗多糖或浒苔多糖配置成浓度为1～
20mg/mL 的多糖溶液；然后以糖化酶作为水解酶， 于pH 为3.5～5.5、温度为40～60℃反应1～
5小时，得首次酶解降解多糖溶液；将首次酶解降
解多糖溶液煮沸4～6分钟后，离心以除去糖化
酶，得含有首次酶解降解后浒苔多糖的上清液。将
上述上清液经透析后冷冻干燥，得粉末状的酶解
降解浒苔多糖(分子量范围为7.2～122kDa)。本
发明的方法具有水解效率高，所得多糖体外抗氧
化活性好的特点。
(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书7页 附图2页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书7页 附图2页(10)申请公布号CN 103951761 A
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1.酶法降解浒苔多糖的方法，其特征是：将浒苔粗多糖或浒苔多糖配置成浓度为1～20mg/mL 的多糖溶液；然后以糖化酶作为水解酶，在多糖溶液中加入糖化酶直至糖化酶的终浓度为2～100U/mL ；于pH 为3.5～5.5、温度为40～60℃反应1～5小时，得首次酶解降解多糖溶液；将首次酶解降解多糖溶液煮沸4～6分钟后，离心以除去糖化酶，得含有首次酶解降解后浒苔多糖的上清液。
2.根据权利要求1所述的酶法降解浒苔多糖的方法，其特征是：将含有首次酶解降解后浒苔多糖的上清液用截留分子量为500的透析袋透析，以除去无机盐；得透析液；将透析液冷冻干燥，得粉末状的酶解降解浒苔多糖。
3.根据权利要求1所述的酶法降解浒苔多糖的方法，其特征是：将含有首次酶解降解后浒苔多糖的上清液进行再次水解，所述再次水解包括如下步骤：
在含有首次酶解降解后浒苔多糖的上清液中加入果胶酶，所述果胶酶的用量为浒苔粗多糖或浒苔多糖重
量的1～10％；于pH 为3.5～5.5、温度为45～60℃反应1～5小时，得再次酶解降解多糖溶液；将再次酶解降解多糖溶液煮沸4～6分钟后，离心以除去果胶酶，得含有再次酶解降解后浒苔多糖的上清液。
4.根据权利要求3所述的酶法降解浒苔多糖的方法，其特征是：将含有再次酶解降解后浒苔多糖的上清液用截留分子量为500的透析袋透析，以除去无机盐；得透析液；将透析液冷冻干燥，得粉末状的酶解降解浒苔多糖。权 利 要 求 书CN 103951761 A
酶法降解浒苔多糖的方法
技术领域
[0001] 本发明属于食品生物技术领域，涉及一种酶法降解浒苔多糖的方法。
背景技术
[0002] 浒苔是我国东南沿海的一种大型经济性绿藻，资源丰富，本身可以食用，并含有多种活性物质，如浒苔多糖，脂类素，酚类等。据文献报道，浒苔多糖具有提高哺乳动物免疫力、降血脂、消炎抗菌以及抗氧化等生理功能。因此将浒苔开发成功能食品有很好的前景。浒苔水提多糖主要为水溶性的硫酸多糖，其组成主要是葡萄糖醛酸-木糖-鼠李糖聚合物。浒苔多糖分子量大，如果将其降解成分子量相对较小的产物，则由于游离出更多的活性基团，能会使其生物活性得到提高。
[0003] 据报道，浒苔多糖糖键类型主要是β-1,4、α-1,2、α-1,4、α-1,2,4和β-1,6，还含有较少量的β-1,3和α-1,3糖苷键。
[0004] 酸降解是多糖降解的传统方法，可通过调节酸度、温度和作用时间得到不同降解程度的水解产物。但硫酸多糖在降解过程中其硫酸基易被水解脱落，硫酸基含量的降低会导致多糖的生理活性降低；该方法的降解率为40.05％；分子量范围一般为5.32～95.6kDa。
[0005] 氧化降解虽可减少多糖在降解过程中的硫酸基脱落，但氧化产物相对较复杂，增加了分离纯化的难度。该方法的降解率为61.32％；分子量范围一般为2.28～55.9kDa。[0006] 酶法降解作用条件温和，也可避免硫酸基的脱落，但不易得到水解效率高的酶。但目前对浒苔多糖的酶法降解很少有见报道。
发明内容
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种水解效率高、体外抗氧化活性好的酶法降解浒苔多糖的方法。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种酶法降解浒苔多糖的方法，将浒苔粗多糖或浒苔多糖配置成浓度为1～20mg/mL(较佳为4～6mg/mL)的多糖溶液；然后以糖化酶(葡萄糖淀粉酶)作为水解酶，在多糖溶液中加入糖化酶直至糖化酶的终浓度为2～100U/ mL(较佳为10～20U/mL)；于pH为3.5～5.5、温
度为40～60℃反应1～5小时(较佳为于pH为4.5，49℃反应2小时)，得首次酶解降解多糖溶液；将首次酶解降解多糖溶液煮沸4～6分钟后，离心以除去糖化酶，得含有首次酶解降解后浒苔多糖的上清液。
[0009] 备注说明：将浒苔粗多糖或浒苔多糖配置成浓度为1～20mg/mL的多糖溶液，即为：当选用浒苔粗多糖时，浒苔粗多糖的浓度为1～20mg/mL；当选用浒苔多糖时，浒苔多糖的浓度为1～20mg/mL。
[0010] 离心是指：7000～9000r/s离心4～6min。
[0011] 作为本发明的酶法降解浒苔多糖的方法的改进：将含有首次酶解降解后浒苔多糖的上清液用截留分子量为500的透析袋透析，以除去无机盐；得透析液；将透析液冷冻干
燥，得粉末状的酶解降解浒苔多糖(分子量较低，分子量范围为7.2～122kDa之间)。[0012] 备注说明：上述透析时间为20～28小时；冷冻干燥是指在-45～-55℃干燥20～28小时。
[0013] 作为本发明的酶法降解浒苔多糖的方法的另一种改进：将含有首次酶解降解后浒苔多糖的上清液进行再次水解，所述再次水解包括如下步骤：
[0014] 在含有首次酶解降解后浒苔多糖的上清液中加入果胶酶，所述果胶酶的用量为浒苔粗多糖或浒苔多糖重量的1～10％(较佳为6～9％)；于pH为3.5～5.5、温度为45～60℃反应1～5小时(较佳为pH为4.5，温度为56℃反应3小时)，得再次酶解降解多糖溶液；将再次酶解降解多糖溶液煮沸4～6分钟后，
离心以除去果胶酶，得含有再次酶解降解后浒苔多糖的上清液。
[0015] 备注说明：果胶酶的酶活为30U/mg。离心是指：7000～9000r/s离心4～6min。[0016] 作为本发明的酶法降解浒苔多糖的方法的进一步改进：
[0017] 将含有再次酶解降解后浒苔多糖的上清液用截留分子量为500的透析袋透析，以除去无机盐；得透析液；将透析液冷冻干燥，得粉末状的酶解降解浒苔多糖(分子量较低，分子量范围为7.2～122kDa之间)。
[0018] 备注说明：上述透析时间为20～28小时；冷冻干燥是指在-45～-55℃干燥20～28小时。
[0019] 在本发明中，可用pH3.5～5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液进行pH值的调节控制。[0020] 本发明所使用的浒苔粗多糖的纯度(质量含量)为75～80％。
[0021] 在本发明中，浒苔粗多糖或浒苔多糖均可通过公知技术获得，例如，浒苔粗多糖也可通过如下方法制备而得：
[0022] 1)、将干燥(含水率≤8.21％，质量％)后的浒苔用捣碎机进行粉碎，过120目筛，得浒苔粉末。
[0023] 2)、乙醇除杂：
[0024] 将无水乙醇与浒苔粉末按照20ml/1g的料液比，于90℃水浴条件下搅拌从而除去海藻中的脂溶性成分，所述除杂过程重复2～4次(每次搅拌约30分钟)，过滤，取滤饼。[0025] 3)、水提浒苔多糖：
[0026] 将步骤2)所得的滤饼按照《浒苔水溶性多糖提取的工艺研究》中的“浒苔水溶性多糖提取工艺”，制备得到浒苔粗多糖水溶液。
[0027] 4)、蛋白的去除：
[0028] 将步骤3)所得的浒苔粗多糖水溶液按照《浒苔多糖脱蛋白方法的研究》中的“浒苔多糖酶法脱蛋白工艺”进行酶法脱蛋白：木瓜蛋白酶的用量为3％(W：V)，pH值为6.5，温度50℃，酶解时间为2.5h。
[0029] 再将所得的酶解液利用Sevag法除蛋白多次，离心直至上层几乎无蛋白，减压旋蒸除去氯仿与正丁醇，加入无水乙醇使得其纯度不低于80％，在4℃冰箱醇沉12h后，再离心，沉淀用无水乙醇、乙醚、丙酮的顺序多次洗涤，最后进行冷冻干燥，得浒苔粗多糖。其中，多糖的质量含量为75.45％，即纯度为75.45％。
[0030] 采用本发明方法制备而得的酶解降解浒苔多糖粉末，分子量范围为7.2～122kDa 之间。
[0031] 采用本发明方法制备而得的酶解降解浒苔多糖粉末，测定其抗氧化活性，用高效凝胶渗透层析法测定分子量。
[0032] 本发明具有如下技术效果：
[0033] 1.与酸降解等传统方法相比，采用本发明的方法降解浒苔多糖作用条件温和，反应时间短。
[0034] 2.得到的降解多糖分子量较低；分子量范围为7.2～122kDa之间。
[0035] 3.与未降解的浒苔多糖相比，具有更好的体外抗氧化活性。
附图说明
[0036] 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
[0037] 图1是由本发明实施例1-1得到的酶解浒苔多糖以及未降解多糖的DPPH自由基清除能力的测试结果。
[0038] 图2是由本发明实施例1-1得到的酶解浒苔多糖以及未降解多糖的超氧阴离子自由基清除能力的测试结果。
[0039] 图3是由本发明实施例1-1得到的酶解浒苔多糖以及未降解多糖的羟基自由基清除能力的测试结果。
[0040] 图4是本发明实施例1-1得到的酶解浒苔多糖的高效凝胶渗透谱图。
具体实施方式
[0041] 实施例1-1、酶法降解浒苔多糖的方法：
[0042] 取纯度为75.45％的浒苔粗多糖用pH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲液(乙酸和乙酸钠的总浓度为0.1mol/L)溶解成浒苔粗多糖浓度为5mg/mL的粗多糖溶液。
[0043] 先将10×104U/mL的糖化酶(葡萄糖淀粉酶)用pH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲液(乙酸和乙酸钠的总浓度为0.1mol/L)稀释至100U/mL，得糖化酶酶溶液。取710μL糖化酶酶溶液用蒸馏水补足至1mL，得稀释后糖化酶酶溶液。
[0044] 然后在4mL粗多糖溶液中加入1ml稀释后糖化酶酶溶液，从而使糖化酶的浓度为14.2U/mL，浒苔粗多糖的浓度为4mg/mL；此时pH为4.5，于温度为49℃反应时间2小时。[0045] 将酶解后的多糖溶液煮沸5min，离心除去酶(8000r/s，5min)，然后将所得上清液用截留分子量为500的透析袋透析24h，以除去无机盐；得透析液；最后将透析液进行冷冻干燥(即在真空冷冻干燥器中干燥24h，温度为-50℃)。得到降解率为7.6％的酶解浒苔多糖(即，得酶解降解浒苔多糖)。
[0046]
[0047] 备注说明：
[0048] 1、“酶解多糖”，即指最终所得的“酶解浒苔多糖”。
[0049] 2、“浒苔多糖”指未酶解的“浒苔粗多糖”。
[0050] 实施例1-2、将浒苔多糖用糖化酶酶解：
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