(19)国家知识产权局
(12)发明专利
(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 202110668444.2(22)申请日 2021.06.16
(65)同一申请的已公布的文献号
申请公布号 CN 113322237 A (43)申请公布日 2021.08.31(83)生物保藏信息CCTCC C202140 2021.03.0 3
(73)专利权人 中国医学科学院肿瘤医院地址 100021 北京市朝阳区潘家园南里17 号(72)发明人 林东昕 吴晨 苗传望 刘伟玲
席奕轶 刘亚宸 林皑 仲策 张少森
(74)专利代理机构 北京预立生科知识产权代理
有限公司 11736
专利代理师 朱萍 孟祥斌(51)Int.Cl.
C12N 5/10(2006.01)C12N 15/85(2006.01)A01K 67/027(2006.01)C12Q 1/02(2006.01)C12R 1/91(2006.01)
审查员 李恩
(54)发明名称
本发明提供了一种VAV2基因缺失的肿瘤细胞系及其在筛选和/或评价/制备肿瘤药物，开发肿瘤药物靶点，制备肿瘤诊断试剂，开发肿瘤新技术，开发检测肿瘤相关生物工程产品中的应用。所述VAV2基因缺失是通过Crispr/cas9敲除技术实现的，本发明的细胞系具有良好的细胞特性，
并且其特性优于市售的细胞系。
权利要求书1页 说明书5页
序列表1页 附图3页
CN 113322237 B 2022.05.13
C N 113322237
B
1.一种食管癌细胞系，所述食管癌细胞系命名为VAV2基因缺失小鼠食管癌细胞系NCCE2，于2021年3月3日由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：C202140。 2.一种构建VAV2基因缺失的食管癌细胞系的方法，
所述方法包括如下步骤：1）利用Cas9/RNA system gene targeting技术，针对mouse VAV2基因设计gRNA，构建包含所述gRNA的载体；
2）使用1）中构建的载体敲除小鼠的VAV2基因，获得VAV2基因中缺失如SEQ ID NO:1所示序列的小鼠；
3）诱导2）获得的小鼠成瘤；4）取3）的肿瘤组织，继续培养，获得食管癌细胞系。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述小鼠是C57BL/6小鼠。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，
所述诱导包括使用致癌剂对小鼠进行处理。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述处理是饲喂致癌剂。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，
所述致癌剂是4NQO。7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述肿瘤组织是食管处的新生肿瘤。8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述食管癌细胞系是经过实验验证的细胞系。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述实验验证包括增殖能力检测、克隆能力检测、细胞迁移能力检测。
10.权利要求2所述的VAV2基因中缺失如SEQ ID NO:1所示序列的小鼠在制备VAV2缺失的细胞系中的应用。
11.权利要求1所述的细胞系的用途，其特征在于，所述用途包括以下任意一种：筛选和/或评价/制备肿瘤药物，开发肿瘤药物靶点，制备肿瘤诊断试剂，开发肿瘤新技术，开发检测肿瘤相关生物工程产品。
权 利 要 求 书
1/1页
CN 113322237 B
一种VAV2基因缺失的肿瘤细胞系
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种VAV2基因缺失的肿瘤细胞系及其构建方法。
背景技术
[0002]食管癌目前尚缺乏细胞模型，尤其是小鼠来源的肿瘤细胞系，本发明构建了一株小鼠来源的食管癌细胞系并命名为NCCE2，弥补该领域空白。
[0003]VAV2是一个重要的癌基因，目前有多项研究表明其影响肿瘤的增殖迁移等恶性表型，靶向VAV2可能是将来肿瘤领域的一个重要方向。我们通过Crispr技术获得了VAV2基因缺失的小鼠，并且通过诱导成瘤而后继续培养癌组织得到了稳定表达的细胞系，该细胞系具有良好的细胞特性，并且其特性优于市售的细胞系。
[0004]CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是在细菌中发现的适应性免疫反应系统(Adaptive immune system)，能有效抵抗噬菌体(Bacteriophage)等对细菌造成的损伤。在这
套系统的基础上，科学家发展出一种新的CRISPR/Cas基因组编辑技术。现在所广泛使用的CRISPR/cas9系统是由II型CRISPR改造而来，并应用到分子生物学的相关研究中，成为一种可用于基因组编辑的分子生物学利器。CRISPR基因组编辑系统通过sgRNA上携带的靶点序列识别特定DNA序列，这种方式决定了CRISPR系统具有很强的特异性，由于其没有物种的限制，已经成功在多种动物和植物中实现了基因的精确编辑。
发明内容
[0005]细胞系
[0006]本发明提供了一种食管癌细胞系，所述细胞系命名为VAV2基因缺失小鼠食管癌细胞系NCCE2，于2021年3月3日由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：C202140。
[0007]生物材料样品的保藏信息：
[0008]保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；
[0009]地址：中国武汉，武汉大学；
[0010]保藏日期：2021年3月3日；
[0011]保藏编号：CCTCC NO：C202140；
[0012]分类命名：VAV2基因缺失小鼠食管癌细胞系NCCE2。
[0013]方法
[0014]本发明提供了一种构建癌细胞系的方法，所述方法包括如下步骤：
[0015]1)构建包含VAV2完整或部分基因的载体；
[0016]2)使用载体敲除模型生物的VAV2基因，获得基因敲除的模型生物；
[0017]3)诱导基因敲除的模型生物成瘤；
[0018]4)继续培养肿瘤组织，获得癌细胞系。
[0019]优选地，所述癌细胞系是食管癌细胞系。
[0020]优选地，所述癌细胞系是前述保藏的NCCE2细胞系
[0021]优选地，所述VAV2完整或部分基因是gRNA，所述gRNA有引导基因编辑蛋白到特定位点进行基因编辑的功能；所述编辑包括敲除(KO)、插入、点突变。
[0022]优选地，所述载体上有Cas9的核酸序列。
[0023]优选地，所述载体上还有其他的调节元件和/或功能组分。
[0024]优选地，所述模型生物是可以是体内含有Cas9的mRNA或蛋白的模型生物。[0025]优选地，所述调节元件包含启动子、增强子、翻译起始的核糖体结合位点、终止子、多聚腺苷酸序列。
[0026]优选地，所述基因敲除的模型生物指经过了基因敲除操作的模型生物，其体内的VAV2基因包括野生型VAV2基因和/或突变型VAV2基因。
[0027]优选地，所示野生型VAV2基因较突变型VAV2基因缺失的序列如SEQ ID NO:1所示。[0028]优选地，所述基因敲除的模型生物可以是VAV2杂合的或VAV2纯合的。
[0029]优选地，所述模型生物包括哺乳动物或非哺乳动物。
[0030]优选地，所述模型生物是哺乳动物。
[0031]优选地，所述模型生物是小型哺乳动物。
[0032]优选地，所述模型生物是啮齿动物。
[0033]优选地，所述啮齿动物包括丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)动物。
[0034]优选地，所述模型生物是小鼠。
[0035]优选地，所述模型生物包括BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/ N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/ An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/ H品系的小鼠。
[0036]优选地，所述模型生物是C57BL/6品系的小鼠。
[0037]优选地，所述诱导包括使用致癌剂对模型生物进行处理。
[0038]优选地，所述处理包括饲喂、注射。
[0039]优选地，所述处理是饲喂致癌剂。
[0040]优选地，所述致癌剂包括4NQO、N‑甲基‑N'‑硝基‑亚硝基胍、多环碳氢化合物、氨基偶氮化合物、芳香胺类、亚硝胺类霉菌毒素、部分金属元素。
[0041]优选地，所述致癌剂是4NQO。
[0042]优选地，所述肿瘤组织可以是模型生物身体任意部位的新生肿瘤。
[0043]优选地，所述肿瘤组织是食管处的新生肿瘤。
[0044]优选地，所述癌细胞系是经过实验验证具有高品质的细胞系。
[0045]优选地，所述实验验证包括增殖能力检测、克隆能力检测、细胞迁移能力检测。
[0046]优选地，所述高品质包括增殖能力强、克隆能力强、细胞迁移能力强。
[0047]应用
[0048]本发明提供了前述基因敲除的模型生物在制备VAV2缺失的细胞系中的应用。[0049]本发明提供了前述gRNA或其所在的载体在敲除VAV2或构建VAV2敲除的细胞系中的应用。
[0050]本发明提供了前述细胞系的用途，其特征在于，所述用途包括以下任意一种：筛选和/或评价/制备
肿瘤药物，开发肿瘤药物靶点，制备肿瘤诊断试剂，开发肿瘤新技术，开发检测肿瘤相关生物工程产品。
附图说明
[0051]图1为小鼠的基因鉴定电泳图。
[0052]图2为4NQO诱导的小鼠食管癌的实物图。
[0053]图3为NCCE2的镜下形态图。
[0054]图4为NCCE2与市售细胞系的增殖能力比较图。
[0055]图5为NCCE2的克隆形成实验的结果图。
[0056]图6为Transwell实验的显微镜下细胞形态图。
具体实施方式
[0057]下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变
化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。[0058]实施例1、构建VAV2基因敲除的转基因小鼠
[0059]方案：使用利用Cas9/RNA system gene targeting技术，构建针对mouse VAV2基因的gRNA，指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶标的特定位点剪切DNA双链；双链断裂缺口通过NHEJ(non‑homologous end joining)机制被修复，在断口造成不同长度序列的删除或插入，从而通过移码实现基因的敲除。
[0060]具体流程：
[0061]1)sgRNA设计及构建：设计sgRNA识别序列，构建sgRNA；
[0062]2)体外活性测试：体外测试sgRNA切割效率；
[0063]3)原核注射及移植：小鼠(C57BL/6小鼠)的超排；注射受精卵、移植；得到F0代小鼠；
[0064]4)F0代小鼠鉴定及繁育：通过PCR和测序验证阳性小鼠；将阳性F0代小鼠和C57BL/ 6N回交；
[0065]5)F1代小鼠鉴定：通过PCR和测序验证阳性小鼠。
[0066]表1.阳性F1代小鼠的基因型
[0067]ID Gender color Gty DOB Gen F/M 25♂B‑222bp/wt2015‑8‑31F115#
27♂B‑222bp/wt2015‑8‑31F115#
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