(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201410758253.5
(22)申请日 2014.12.10
C12N 15/10(2006.01)
C12N 15/11(2006.01)
C12Q 1/68(2006.01)
(71)申请人中国医学科学院医学实验动物研究
所
地址100021 北京市朝阳区潘家园南里5号
(72)发明人雍伟东 杜建勇 邓然
(74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限
公司 11245
代理人关畅 白艳
(54)发明名称
一种gRNA 体外合成及活性检测的方法
(57)摘要
本发明公开了一种体外快速合成gRNA 及检
基因的特异gRNA 的方法，包括如下步骤：1)合成 扩增gRNA 转录模板的上游引物、扩增gRNA 转录模
板的下游引物和gRNA 保守片段；2)以所述gRNA
保守片段为模板，用所述扩增gRNA 转录模板的上
游引物和所述扩增gRNA 转录模板的下游引物进
行PCR 反应，得到PCR 产物为gRNA 转录模板；3)
将所述gRNA 转录模板转录得到gRNA ；即为目标
基因的特异gRNA。本发明的实验证明，本发明通
过一步PCR 反应扩增，迅速得到足够浓度的带有
T7promoter 的gRNA 的转录模板，并转录纯化得到
有功能的gRNA。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
(10)申请公布号CN 104531675 A (43)申请公布日2015.04.22
C N 104531675
A
1.一种体外合成目标基因的特异gRNA的方法，包括如下步骤：
1)合成gRNA转录模板的上游引物、gRNA转录模板的下游引物和gRNA保守片段；
所述gRNA保守片段的核苷酸序列为序列表中序列2；
所述gRNA转录模板的上游引物从5′→3′方向为T7启动子部分片段、gRNA前导片段和核心区域；
所述T7启动子部分片段的核苷酸序列为序列表中序列3自5’末端第1-20位；
所述前导片段为目标基因的基因组DNA中位于PAM片段上游的20个核苷酸；所述PAM 片段为NGG，其中，N为A、T、C、G中任一个；
所述核心区域的核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第1-13位；
所述下游引物的核苷酸序列为序列表中序列4；
2)以所述gRNA保守片段为模板，用所述gRNA转录模板的上游引物和所述gRNA转录模板的下游引物进行PCR扩增，得到的PCR产物为gRNA转录模板；
3)将所述gRNA转录模板进行体外转录得到gRNA，即为目标基因的特异gRNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述目标基因为NKp46基因外显子Exon3；
所述PAM片段为GGG；
所述上游引物的核苷酸序列为序列表中序列3。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述步骤3)后还包括步骤4)：体外检测所述特异gRNA活性的步骤；
所述体外检测所述特异gRNA活性的方法包括如下步骤：将含有gRNA靶片段的DNA分子、Cas9核酸酶和所述特异gRNA混合酶切，检测酶切产物，若所述DNA分子被切开，且酶切得到的两个片段大小与所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和下游片段大小一致，则所述特异gRNA有活性；若所述DNA分子不能被切开或酶切得到两个片段大小与所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和下游片段大小不一致，则所述特异gRNA无活性或无特异性；
所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和所述gRNA靶片段下游片段大小不一致，且均不为0。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述目标基因为NKp46基因外显子Exon3；
所述DNA分子的核苷酸序列为序列表中序列8；
所述NKp46基因外显子Exon3的gRNA转录模板的上游引物的核苷酸序列为序列表中序列3。
5.由权利要求1-4中任一所述的方法制备的gRNA。
6.权利要求5所述的gRNA在酶切目的基因中的应用。
7.一种体外检测权利要求5所述gRNA活性的方法，包括如下步骤：
将含有gRNA靶片段的DNA分子、Cas9核酸酶和所述特异gRNA混合酶切，检测酶切产物，若所述DNA分子被切开，且酶切得到的两个片段大小与所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和下游片段大小一致，则所述特异gRNA有活性；若所述DNA分子不能被切开或酶切得到两个片段大小与所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和下游片段大小不一
致，则所述特异gRNA无活性或无特异性；
所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和所述gRNA靶片段下游片段大小不一致，且均不为0。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：
所述DNA分子核苷酸序列为序列表中序列8。
9.成套DNA，包括权利要求1-4中任一所述的gRNA转录模板的上游引物，权利要求1-4中任一所述的gRNA转录模板的下游引物和权利要求1-4中任一所述的gRNA保守片段。
一种gRNA体外合成及活性检测的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，涉及基因编辑相关的一种gRNA体外合成及活性检测的方法。
背景技术
[0002] 基因定点敲除技术通过对染体上基因特异位点进行定点突变，使其功能丧失，进而达到研究其功能的目的。一些利用基因敲除技术创建的疾病动物模型对医学研究的发展做出了重要贡献。传统的基因敲除技术于上世纪80年代末由Smithies等创立，通过同源重组手段将构建的外源DNA片段插入并替换相应染体上特定的区段，达到基因敲除的目的。这一技术的应用使人类能够有目的地研究基因功能和与之相关的疾病之间的直接关系。然而由于同源重组技术需要载体构建、ES细胞打靶、筛选、显微注射、小鼠鉴定等一系列较为复杂的操作步骤，并且成本较高、周期较长，大大限制了这一技术的应用。针对同源重组的缺点，科学家一直在探索用其它更简便的技术来实现基因敲除。先后发明了ENU随机突变、基因捕获、ES细胞基因敲除细胞库等方法和手段，但由于技术手段和操作成本的限制，这些技术都不能完全替代传统的同源重组技术。2009年以后出现了一系列新的基因编辑技术，包括ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9，开创了基因敲除(敲入)新的时代。这些新基因编辑技术作用原理相似，即通过核酸酶在目的基因的DNA双链上制造切口，然后利用生物体自身的修复机制以同源重组或者非同源末端连接的方
式实现修复，进而达到基因失活的目的。作为一种最新的基因编辑技术，CRISPR/Cas9技术是通过gRNA(又称引导RNA，真核生物中参与RNA编辑的具有与mRNA互补序列的RNA)识别特异的靶序列，同时引导Cas9核酸酶在DNA的特异位点上制造切口，然后利用生物体自身的修复机制进行DNA修复。这一过程中可能造成碱基改变，增加，缺失等突变现象，进而实现对目的基因的敲除与修饰。[0003] CRISPR/Cas9系统的高效基因组编辑功能已被成功应用于多种生物，包括人类细胞、斑马鱼、小鼠、大鼠、植物及细菌。众所周知，生物体的一个性状往往由多个基因共同决定。传统的基因敲除费时费力却只能每次敲除一个相关基因，而CRISPR/Cas9系统其中一个最重要的特点便是可在多个不同gRNA的引导下由Cas9核酸酶一次靶向敲除多个基因组位点。与其他基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9系统具有其独特的优势：
[0004] 1、其RNA-DNA识别机制，避免了DNA甲基化造成的影响。
[0005] 2、与ZFN和TALEN相比，它有相同或更高的基因编辑效率，尤其在点突变方面优于ZFN或TALEN。
[0006] 3、设计简单快速，无需重复构建核酸内切酶表达载体，适用于任何分子生物学实验室。
[0007] 当前基因编辑技术迅速发展，CRISPR/Cas9技术以其优势将迅速推动基因组功能的研究。快速获取目标gRNA并检测验证其活性将会为科学实验赢得宝贵的时间，并进一步推动这项技术的应用。常规
获取gRNA要构建表达载体，需要把gRNA的转录模板连接到载体上，经过涂板、挑选单克隆、摇菌、提取质粒、测序验证，最终还要酶切使质粒线性化才能
得到gRNA的体外转录模板，得到gRNA最少也需要3天的时间。本发明旨在迅速获取gRNA 的体外转录模板，并在转录后通过体外实验验证其活性及特异性。为后续转染或显微注射筛选有效的gRNA节省了宝贵的时间。
发明内容
[0008] 本发明的一个目的是提供体外合成目标基因的特异gRNA的方法。
[0009] 本发明提供的方法，包括如下步骤：
[0010] 1)合成gRNA转录模板的上游引物(单链DNA)、gRNA转录模板的下游引物(单链DNA)和gRNA保守片段(双链DNA)；
[0011] 所述gRNA保守片段的核苷酸序列为序列表中序列2；
[0012] 所述gRNA转录模板的上游引物从5′→3′方向为T7启动子部分片段、gRNA前导片段和核心区域；
[0013] 所述T7启动子部分片段的核苷酸序列为序列表中序列3自5’末端第1-20位；[0014] 所述前导片段为目标基因的基因组DNA中位于PAM片段上游的20个核苷酸；所述PAM片段为NGG，其中，N为A、T、C、G中任一个；
[0015] 所述核心区域的核苷酸序列为序列2自5’末端第1-13位，其为gRNA保守片段序列中自5’末端第1-13位的核苷酸组成的DNA分子；
[0016] 所述下游引物的核苷酸序列为序列表中序列4；
[0017] 2)以所述gRNA保守片段为模板，用所述gRNA转录模板的上游引物和所述gRNA转录模板的下游引物进行PCR扩增，得到的PCR产物为gRNA转录模板；
[0018] 3)将所述gRNA转录模板进行体外转录得到gRNA，即为目标基因的特异gRNA。[0019] 上述方法中，
[0020] 所述目标基因为NKp46基因外显子Exon3；
[0021] 所述PAM片段为GGG；
[0022] 所述上游引物的核苷酸序列为序列表中序列3。
[0023] 上述方法中，
[0024] 在所述步骤3)后还包括步骤4)：体外检测所述特异gRNA活性的步骤；[0025] 所述体外检测所述特异gRNA活性的方法包括如下步骤：将含有gRNA靶片段的DNA分子、Cas9核酸酶和所述特异gRNA混合酶切，检测酶切产物，若所述DNA分子被切开，且酶切得到的两个片段大小与所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和下游片段大小一致，则所述特异gRNA有活性；若所述DNA分子不能被切开或酶切得到两个片段大小与所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和下游片段大小不一致，则所述特异gRNA无活性或无特异性；
[0026] 所述DNA分子中的gRNA靶片段既不在所述部分片段的正中央，也不在所述部分片段的起始或者末端。这样选择的原因是为了避开剪切后，两条片段不能分开或者虽然可以分开但一条带过小不易观察，具体所述DNA分子中所述gRNA靶片段上游片段和所述gRNA 靶片段下游片段大小不一致，且均不为0。
[0027] gRNA靶片段上游片段为在基因组中gRNA靶片段的上游片段；
[0028] gRNA靶片段下游片段为在基因组中gRNA靶片段的下游片段。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议