一种保持稳定性状的小鼠骨髓树突状细胞的原代培养方法

1.本发明属于细胞培养领域，更具体地，涉及一种保持稳定性状的小鼠骨髓树突状细胞的原代培养方法。

背景技术：

2.树突状细胞，也叫做dc细胞，是抗原提呈细胞（apc）中功能最强的一类细胞，因其在成熟时伸出许多树突状或伪足状突起而得名，未成熟的树突状细胞一般具有明显的游走性，成熟的树突状细胞专门加工、处理、提取各种抗原物质，在人体的免疫调节中具有中心地位，可以调节人体的体液免疫、细胞免疫和肿瘤免疫等等。dc能合成大量的mhc ii类分子，从而激活初始t细胞并诱导针对肿瘤细胞的特异性胞毒性反应（ctl）。所以dc在肿瘤免疫中的作用逐渐被重视。基于dc的疫苗在肿瘤免疫中发挥着重要的作用，成为近年来免疫学研究的重点。dc在生物体内分布广泛，但数量较少，因此如何经济高效的获得dc就成为进一步研究dc特性及功能的前提。
3.目前，树突状细胞在血液、组织中的含量极低。体外培养骨髓来源树突状细胞（bmdc）是获得大量树突状细胞的一种方法。目前，在对于dc细胞的研究过程中，采用小鼠骨髓来源树突状细胞的诱导及纯化方式多种多样，但存在一些如诱导周期长、数量少、纯度较低、成本较高等不足，难以满足基础研究和临床研究的需求。

技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种保持稳定性状的小鼠骨髓树突状细胞的原代培养方法。
5.本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：本发明提供了一种保持稳定性状的小鼠骨髓树突状细胞的原代培养方法，包括以下步骤：（1）将离断得到的小鼠的股骨和胫骨，冲洗骨髓干细胞，利用注射器吸取1 ml rpmi-1640培养基从骨骺端刺入骨髓腔中并从另一端刺出，脉冲式推动注射器，反复冲洗骨髓腔，直至股骨、胫骨变白，得到冲洗下来的骨髓细胞（2）将所得骨髓细胞离心，弃上清，将沉淀中加入红细胞裂解液，混匀后冰上静置，加入pbs后离心后弃上清；（3）将离心所得的细胞悬于rpmi-1640基础培养基中，悬液过200目细胞筛收集起置于离心管中，离心后弃上清；（4）将离心所得细胞重悬于完全培养基混匀，接种于6孔板中，置于37 ℃，培养箱中采用梯度式co2培养；（5）培养结束后，弃去上清液以及悬浮细胞，加入等量的完全培养基；（6）第4、6天半量更换完全培养基；（7）第7-8天，收获bmdc。
6.进一步的，步骤（2）中，所述红细胞裂解液包含8.1g/l的氯化铵，2.5g/l的khco3和0.37g/l的聚氧乙烯-8-辛基苯基醚，ph7.2-7.4；每1ml沉淀中加入5-8ml红细胞裂解液。
7.进一步的，步骤（2）中，所述完全培养基的组成为：含有10%胎牛血清，15ng/mlgm-csf，10ng/mlil-4，1%青霉素-链霉素，1%丝素蛋白的rpmi-1640培养基。
8.进一步的，步骤（2）和（3）中，所述离心的条件均为4℃，1500rpm，3-5min。
9.进一步的，步骤（4）中，所述梯度式co2培养的具体过程为：首先培养箱中3%co2条件下培养12h，然后在5%co2条件下培养36h。
10.其中rpmi-1640培养基与其它培养基的区别在于含有还原型谷胱甘肽和高浓度的维生素。rpmi1640培养基含有emem和dmem中没有的生物素、维生素b12和对氨基苯甲酸，以及高浓度的氯化胆碱和肌醇。
11.gm-csf为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，能够定向地刺激骨髓细胞向粒细胞-巨噬细胞方向分化，也可以诱导单核细胞扩增向dc方向进行分化。
12.本发明培养过程中，离断得到的小鼠的股骨和胫骨的具体过程为：（1）准备工作，手术器械灭菌，包括但不限于眼科剪、止血钳、镊子、手术刀等，配制完全培养液、红细胞裂解液（1x）、pbs（ph=7.2-7.4），准备23g注射器以及15ml和50ml离心管；（2）使用颈椎脱臼法处死老鼠，放于75%酒精中完全浸泡5-10分钟消毒，时间不影响消毒效果，大于5分钟即可，用镊子将小鼠取出放于解剖台上，使用眼科剪剪开腿部皮肤，剪断股骨周围的肌肉。捏住胫骨，向外用力使其脱出股骨头，剪掉仍连接的组织。沿股骨胫骨连接的关节处逆向旋转，分别取出股骨和胫骨，放置于pbs中清洗掉多余的毛发。用剪刀和手术刀剔除多余的肌肉，再次用新的pbs清洗。最后泡于75%酒精中，3分钟。
13.本发明所使用的的小鼠选取c57小鼠，周龄为4-8周。
14.本发明采用流式细胞仪检测bmdc中cd11c的阳性率，具体步骤如下：收集步骤9中所得bmdc细胞悬液于离心管中，离心后弃上清，用冰pbs1500rpm离心5分钟洗涤细胞共2次，弃掉上清液。加入适当体积pbs使细胞悬液总体积大于1
×
105，加入抗anti-mousepe-cd11c荧光抗体，避光孵育20分钟后每个离心管加入3mlpbs，以1500rpm速度离心5分钟洗涤细胞。弃去上清液。每管加入500微升pbs溶液使细胞重悬，放于流式管中，流式细胞仪上机检测。
15.本发明采用扫描电镜观察bmdc形态的步骤如下：用镊子取出多聚赖氨酸包被的细胞爬片置于新的6孔板中，将bmdc细胞悬液吸入至培养板中，置于37℃、含5%co2的培养箱中培养24小时，后取出培养板，用0.9%nacl溶液轻轻洗涤3次，加入2.5%戊二醛固定1h，固定好后的细胞用pbs洗涤2次，每次30min后，依次用30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脱水，每次5min。然后用醋酸异戊酯进行置换，干燥并喷镀后于扫描电镜下观察。
16.本发明的有益效果为：（1）本发明提供了一种小鼠骨髓来源的树突状细胞的纯化方法，并在收获细胞后对其进行表征鉴定。利用本发明提供的方法经过7-8天的培养可获得足量的bmdc细胞，本发明通过采用特定的培养条件，阶梯式改变co2的浓度，提高树突状细胞的培养数量。本发明还对所得的bmdc细胞进行了光镜下观察、流式细胞仪检测cd11c阳性率以及扫描电镜的观
察以及方法优化。
17.（2）利用本发明的方法每只小鼠可以在6-8天内诱导培养2-3
×
107及以上的树突状细胞。形态上变现为存在有细胞伪足。经流式细胞仪检测发现cd11c
+
阳性率达94.9%以上，满足常规实验需求。扫描电镜下也可观察到细胞立体结构特别是微绒毛。
附图说明
18.图1为bmdc在光学显微镜下的形态，图1a为培养第1天的形态，细胞多成小的圆形状态且聚集生长；图1b为培养第3天的形态，细胞出现星形梭形状态；图1c为培养第7天的形态，细胞出现了一些伪足。
19.图2为流式细胞仪检测bmdc中的cd11c阳性率。
20.图3为扫描电镜下bmdc的形态。
21.具体实施方法为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。（一）材料与仪器本实施例中主要实验试剂有：gm-csf、il-4、rpmi-1640、fbs、青霉素-链霉素、anti-mouse pe-cd11c、pbs、多聚赖氨酸、戊二醛、无水乙醇、醋酸异戊酯。rpmi-1640培养基为购买于大连美仑生物技术有限公司。
22.本实施例中主要实验相关耗材有：移液管、50 ml离心管、15 ml离心管、六孔板、细胞培养皿、1 ml带针注射器，流式管，细胞爬片。
23.实施例1s1小鼠骨髓细胞的提取：s101准备工作，手术器械灭菌，包括但不限于眼科剪、止血钳、镊子、手术刀等，配制完全培养液、红细胞裂解液（1x）、pbs（ph=7.2-7.4），准备23 g注射器以及15 ml和50 ml离心管；s102选取6周龄c57bl/6小鼠，使用颈椎脱臼法处死老鼠，放于75%酒精中完全浸泡并放入超净台中，5分钟后取出，固定在小鼠手术台上，使用眼科剪剪开腿部皮肤，从上至下去除大腿至踝关节的皮肤，在脚踝处及髋关节处剪断，剪断股骨周围的肌肉，游离出小鼠的两条下肢。
24.s103捏住胫骨，向外用力使其脱出股骨头，剪掉仍连接的组织。沿股骨胫骨连接的关节处逆向旋转，分别取出股骨和胫骨，放置于盛有pbs的10 cm细胞培养皿中清洗掉多余的毛发。用剪刀和手术刀剔除多余的肌肉，再次用新的pbs清洗。最后泡于75%酒精中，3分钟。
25.s104取含有rpmi-1640基础培养基的注射器，弯曲针头，从保留骨骺端刺入骨髓腔中，并从另一端刺出，将针头置于骨髓腔骺线处，脉冲式推动注射器以获得骨髓。反复几次，直至骨腔变白。用培养皿收集冲下来的骨髓细胞。
26.s105 将上一步中获得的骨髓细胞制成悬液，离心：4℃、1500 rpm离心5分钟；s106弃掉上清，加入8ml红细胞裂解液，混匀后冰上静置3分钟，再加入5倍于裂解
液体积的pbs溶液终止裂解，离心5分钟（1500rpm），弃上清。用冷pbs洗涤骨髓细胞1次，1500rpm室温离心5分钟，弃上清；s107使用rpmi-1640基础培养基将细胞重悬并过200目细胞筛，收集并离心（1500rpm，5分钟）；s108用含有15ng/mlgm-csf和10ng/ml的il-4的含10%fbs的rpmi-1640培养基重悬细胞；s109计数活细胞：取30微升细胞悬液，和30微升0.4%台盼蓝染液混合，于细胞计数仪上计数；s2树突状细胞的培养：s201根据活细胞的数量即每1
×
106—5
×
107的细胞（为多只实验小鼠的总的细胞数量），加入完全培养基（含有10%胎牛血清，15ng/mlgm-csf，10ng/mlil-4，1%青霉素-链霉素，1%丝素蛋白的rpmi-1640培养基）至18ml进行重悬细胞，并接种于6孔板中，每孔3ml。放置于37℃、3%co2条件下培养12h，然后在5%co2条件下培养36h。
27.s20248h后，弃去上清液，用pbs洗两次，弃去，加入等量的完全培养基。
28.s203隔日半量更换完全培养基；即每孔吸取一半量的上清置于离心管，1500rpm离心5分钟后重悬细胞后接种回6孔板中并补足完全培养基。
29.s204每天拍照记录细胞生长状况。在培养过程中，细胞在光学显微镜下的状态如图1所示，其中图1a为培养第1天的形态，细胞多成小的圆形状态且聚集生长；图1b为培养第3天的形态，细胞出现星形梭形状态；图3为培养第7天的形态，细胞出现了一些伪足；s3流式细胞仪检测cd11c的表达。
30.收集所得bmdc细胞悬液于离心管中，离心后弃上清，用冰pbs于1500rpm离心5分钟洗涤细胞共2次，弃掉上清液。加入适当体积pbs使细胞悬液总体积大于1
×
105，加入anti-mousepe-cd11c荧光抗体，避光孵育20分钟后每个离心管加入3mlpbs，以1500rpm速度离心5分钟洗涤细胞。弃去上清液。每管加入500微升pbs溶液使细胞重悬，放于流式管中，流式细胞仪上机检测。检测结果如图2所示，cd11c阳性率达到94.9%，可满足大部分基础实验的需求。
31.s4扫描电镜观察所得bmdc细胞：用镊子取出多聚赖氨酸包被的细胞爬片置于新的6孔板中，将bmdc细胞悬液吸入至培养板中，置于37℃、含5%co2的培养箱中培养24小时，后取出培养板，用0.9%nacl溶液轻轻洗涤3次，加入2.5%戊二醛固定1h，固定好后的细胞用pbs洗涤2次，每次30min后，依次用30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脱水，每次5min。然后用醋酸异戊酯进行置换，干燥并喷镀后于扫描电镜下观察。观察结果如图3，树突状细胞表面有突起，但突起的大小，数量和形态差异很大。也可见到一个细胞具有数种不同形态的突起。利用实施例1的方法每只小鼠可以在8天内诱导培养2
×
107及以上的树突状细胞。
32.实施例2s1小鼠骨髓细胞的提取同实施例1；s2树突状细胞的培养：s201根据活细胞的数量，加入完全培养基（含有10%胎牛血清，15ng/mlgm-csf，10ng/mlil-4，1%青霉素-链霉素，1%丝素蛋白的rpmi-1640培养基）重悬细胞并接种于6孔
板中，每孔3ml。放置于37℃、5% co2条件下培养48h；其他步骤同实施例1。
33.利用实施例2的方法每只小鼠可以在8天内诱导培养1
×
107及以上的树突状细胞，且cd11c阳性率未93.1%。

技术特征：

1.一种保持稳定性状的小鼠骨髓树突状细胞的原代培养方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将离断得到的小鼠的股骨和胫骨，冲洗骨髓干细胞，利用注射器吸取1mlrpmi-1640培养基从骨骺端刺入骨髓腔中并从另一端刺出，脉冲式推动注射器，反复冲洗骨髓腔，直至股骨、胫骨变白，得到冲洗下来的骨髓细胞（2）将所得骨髓细胞离心，弃上清，将沉淀中加入红细胞裂解液，混匀后冰上静置，加入pbs后离心后弃上清；（3）将离心所得的细胞悬于rpmi-1640基础培养基中，悬液过200目细胞筛收集起置于离心管中，离心后弃上清；（4）将离心所得细胞重悬于完全培养基混匀，接种于6孔板中，置于培养箱中采用梯度式co2培养；（5）培养结束后，弃去上清液以及悬浮细胞，加入等量的完全培养基；（6）第4、6天半量更换完全培养基；（7）第7-8天，收获bmdc。2.根据权利要求1所述的原代培养方法，其特征在于，步骤（2）中，所述红细胞裂解液包含8.1g/l的氯化铵，2.5g/l的khco3和0.37g/l的聚氧乙烯-8-辛基苯基醚，ph7.2-7.4；每1ml沉淀中加入5-8ml红细胞裂解液。3.根据权利要求1或2所述的原代培养方法，其特征在于，步骤（2）中，所述完全培养基的组成为：含有10%胎牛血清，15ng/mlgm-csf，10ng/mlil-4，1%青霉素-链霉素，1%丝素蛋白的rpmi-1640培养基。4.根据权利要求1所述的原代培养方法，其特征在于，步骤（2）和（3）中，所述离心的条件均为4℃，1500rpm，3-5min。5.根据权利要求1或3所述的原代培养方法，其特征在于，步骤（4）中，所述梯度式co2培养的具体过程为：首先培养箱中3%co2条件下培养12h，然后在5%co2条件下培养36h；所述培养的温度为37℃。

技术总结

本发明属于细胞培养领域，更具体地，涉及一种保持稳定性状的小鼠骨髓树突状细胞的原代培养方法。利用本发明提供的方法经过7-8天的培养可获得足量的BMDC细胞，本发明通过采用特定的培养条件，阶梯式改变CO2的浓度，提高树突状细胞的培养数量。本发明还对所得的BMDC细胞进行了光镜下观察、流式细胞仪检测CD11c阳性率以及扫描电镜的观察以及方法优化。利用本发明的方法每只小鼠可以在6-8天内诱导培养2-3