(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201410038729.8
(22)申请日 2014.01.26
CGMCC No 8401 2013.10.24
C12N 1/12(2006.01)
C12P 7/64(2006.01)
C12P 21/00(2006.01)
A61K 36/02(2006.01)
A61P 33/02(2006.01)
C12R 1/89(2006.01)
究所
地址266101 山东省青岛市崂山区松岭路
189号
(72)发明人胡光荣 李福利 袁程 范勇
(74)专利代理机构沈阳科苑专利商标代理有限
公司 21002
代理人周秀梅 李颖
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及微藻筛选的方法，具体的说是一
种淡水微藻及其应用。微藻藻株为淡水微藻藻株
Didymogenes sp.HN-4，保藏时间为2013年10月
24日，保藏编号是CGMCC No.8401。将所述微藻藻
成分下的生长状况和油脂含量。是一种环保、成
本低廉的生产生物柴油和降低微藻虫害的生产技
术。
(83)生物保藏信息(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书1页 说明书5页序列表2页 附图3页(10)申请公布号CN 104805015 A (43)申请公布日2015.07.29
C N 104805015
A
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1.一种淡水微藻，其特征在于：微藻藻株为淡水微藻藻株Didymogenes sp.HN-4，保藏时间为2013年10月24日，保藏编号是CGMCC No.8401。
2.一种权利要求1所述的淡水微藻的应用，其特征在于：将所述微藻藻株用于生产油脂、生物柴油、藻类蛋白、脂肪酸或生物质。
3.按权利要求2所述的淡水微藻的应用，其特征在于：将所述微藻藻株于BG-11培养基中连续培养或批次培养，进而使微藻能够大量生产油脂、生物柴油、藻类蛋白、脂肪酸或生物质。
4.按权利要求3所述的淡水微藻的应用，其特征在于：将所述微藻首先初始培养而后扩大培养，初始培养的条件为：连续光照，光照强度为60～500μmol photons/m 2/s 1，温度为20℃～30℃；扩大培养的条件：连续光照，光照强度为60～1000μmol photons m -2s -1，温度为24℃～30℃。
5.按权利要求3所述的淡水微藻的应用，其特征在于：所述BG-11培养基中NaNO 3浓度为0.15g/L 到1.5g/L 。
6.按权利要求5所述的淡水微藻的应用，其特征在于：所述微藻培养中NaNO 3浓度为0.375g/L 。
7.一种权利要求1所述的淡水微藻的应用，其特征在于：所述微藻用于制备抑制轮虫的抑制剂。
8.权利要求7所述的淡水微藻的应用，其特征在于：将所述微藻培养在BG-11或TAP 培养基中，所得培养液或滤液用于制备抑制轮虫的抑制剂。
9.权利要求8所述的淡水微藻的应用，其特征在于：将所述微藻培养在TAP 培养基中。权 利 要 求 书CN 104805015 A
淡水微藻及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及微藻筛选的方法，具体的说是一种淡水微藻及其应用。
背景技术
[0002] 由于能源危机和全球变暖，加之人类对环境保护问题的重视，以及对未来化石燃料涨价的预期，寻化石能源替代品的可再生新能源日益成为科学和产业界的研究热点。在新能源中，微藻柴油被认为是最有希望的可再生绿能源之一。微藻具有较高的光合效率，能够充分利用边际土地资源进行规模化养殖，避免了与粮食作物竞争宝贵的土地资源。此外，微藻还能用于污水处理以及碳捕获。因此，发展微藻生物燃料也有利于环境保护。[0003] 微藻规模化培养最早始于20世纪60年代，20世纪70年代，由于能源危机，美国国家可再生能源实验室启动了水生生物物种计划（aquatic species program，ASP），筛选到生长速度快、油脂含量高的微藻300余株，探索利用微藻生产可再生能源的可行性。近年来，我国也对利用微藻生产生物燃料开展了大量的研究，并在该领域取得了长足的进展。[0004] 国内
外的研究证明，利用微藻生产生物燃料在理论上是可行的。但是在实际生产中，由于微藻的规模化培养、收集和油脂的精炼等方面仍然存在着技术难题，导致应用微藻生产生物燃料过程中的成本居高不下，限制了微藻生物燃料产业化的实现。其中，微藻规模化养殖的成本占据了总生产成本的很大比例。造成微藻规模化养殖成本过高的因素主要包括：微藻光合效率远远低于理论值；生物量和油脂含量偏低；有害生物（如轮虫、真菌）的污染导致微藻细胞的大量死亡等。解决上述问题的关键在于筛选高光效、高含油和鲁棒性强的微藻菌种用于微藻规模化养殖以降低微藻生物燃料的生产成本。
[0005] 微藻在室外的规模化培养过程中，容易受到许多有害生物的污染，从而影响微藻的活力与生物量的产出。其中，轮虫是能够取食微藻的微型浮游动物，爆发时其虫体密度在微藻培养容器中可达到1000头/ml，在短时间内吞噬微藻细胞，或促使微藻细胞发生凝集而沉降到培养容器底部，导致的微藻生物量损失可以高达九成。而且，目前尚无成熟而可靠的控制轮虫危害的方法。而在自然界中，已经有报道包括部分微藻在内的微型浮游植物能够抑制轮虫的生长。因此，从自然界中筛选抗轮虫微藻用于微藻生物燃料的生产与进一步开发室可行的途径之一。
发明内容
[0006] 本发明目的在于提供一种淡水微藻及其应用。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0008] 一种淡水微藻：微藻藻株为淡水微藻藻株Didymogenes sp.HN-4，保藏时间为2013年10月24日，保藏编号是CGMCC No.8401。
[0009] 一种淡水微藻的应用，将所述微藻藻株用于生产油脂、生物柴油、藻类蛋白、脂肪酸或生物质。
[0010] 进一步的说，将所述微藻藻株于BG-11培养基中连续培养或批次培养，进而使微
藻能够大量生产油脂、生物柴油、藻类蛋白、脂肪酸或生物质。
[0011] 更进一步的说，将所述微藻首先初始培养而后扩大培养，初始培养的条件为：连续光照，光照强度为60～500μmol photons/m2/s1，温度为20℃～30℃；扩大培养的条件：连续光照，光照强度为60～1000μmol photons m-2s-1，温度为24℃～30℃。
[0012] 所述BG-11培养基中NaNO3浓度为0.15g/L到1.5g/L；磷酸氢二钾浓度在0.04g/ L。进一步的说，所述微藻培养中NaNO
浓度为0.375g/L。
3
[0013] 一种淡水微藻的应用，所述微藻用于制备抑制轮虫的抑制剂。
[0014] 将所述微藻培养在BG-11或TAP培养基中，所得培养液或滤液用于制备抑制轮虫的抑制剂。将所述微藻培养在TAP培养基中。
[0015] 与现有技术相比，本发明专利具有以下优势：
[0016] 1.应用潜力巨大：利用微藻生产生物柴油具有巨大的潜力，本发明的筛选的微藻藻株为Didymogenes sp.HN-4，属于一种少见的藻属，与其他微藻相比，该藻能够抑制轮虫的生长与爆发，在胁迫环境下能够稳定生长，具有较强的鲁棒性，并在细胞内积累大量的油脂，与其他报道的藻株相比具有巨大的优势。
[0017] 2.油脂产率较高：本发明的微藻油脂含量最高为46.35%（油脂占细胞干重），培养周期12-16天，油脂含量和培养周期均较优。
[0018] 3.本发明利用微藻藻株Didymogenes sp.HN-4生产生物柴油，并且在生产生物柴油的同时，能够抑制轮虫的生长与爆发。进而可将所述藻株用于大规模培养和用于生产油脂、生物柴油、藻类蛋白、脂肪酸和/或生物质成分的应用。
附图说明
[0019] 图1为本发明实施例提供的藻细胞18S rRNA序列。
[0020] 图2为本发明实施例提供的藻细胞ITS1-5.8S-ITS2序列。
[0021] 图3为本发明实施例提供的微藻细胞扫描电镜形态图。
[0022] 图4为本发明实施例提供的Didymogenes sp.HN-4微藻培养液滤液对轮虫生长的抑制图。
[0023] 图5为本发明实施例提供的轮虫在Didymogenes sp.HN-4藻液和滤液中的生长形态图。
具体实施方式
[0024] 根据下列实施例，可以更好的理解本发明专利。实施例中，所描述的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当限制权利要求书中所详细描述的本发明的范围。
[0025] 本发明提供的油脂含量高、能够抑制轮虫生长的新分离的淡水微藻藻株Didymogenes sp.HN-4，其中所述分离的微藻藻株基因组包括一个以上选自由下列序列组成的组中的核酸序列：SEQ ID NO:1（18S-369），SEQ ID NO:2（ITS1-5.8S-ITS2653）。所述藻株的形态特征见图3，藻细胞圆形，单细胞，直径4-6μm，藻细胞表面无特殊结构如鞭毛、网状结构、突起等。所述Didymogenes sp.HN-4藻株于2013年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微
生物研究所，100101)，保藏编号为CGMCC No.8401，分类学命名为Didymogenes sp.。[0026] 微藻藻株的大规模培养，其具体操作步骤如下：微藻培养使用BG-11为培养基，
为向该培养基中接种藻株Didymogenes sp.HN-4于三角瓶中，其中初始接种密度OD
750
0.1-0.3，然后在连续光照的条件下培养，光照强度为60～80μmol photons/m2/s，温度为24℃～30℃，培养4～6天，扩大培养至400ml柱式培养器中，光照强度为60～80μmol photons/m2/s，温度为24℃～30℃，培养14天，离心藻细胞液，收获微藻细胞。
[0027] Didymogenes sp.HN-4藻株可以在18℃～30℃温度条件下，50～1000μmol photons/m2/s光照强度下正常生长。
[0028] 培养第一方面的微藻藻株的培养基为BG-11培养基，培养方法为连续培养方法，所述方法包括初始培养和扩大培养，所述初始培养的条件为：连续光照，光照强度可以为60-500μmol photons/m2/s；优选，光照强度可以为60-300μmol photons/m2/s。更优选，光照强度可以为60-80μmol photons/m2/s，温度为24℃～30℃；扩大培养的条件：连续光照，光照强度为200-1000μmol photons/m2/s，优选，光照强度可以为200～600μmol photons/m2/s，更优选，光照强度可以为280-32
0μmol photons/m2/s，温度为24℃～30℃。[0029] 其中，上述培养微藻藻株的BG-11培养基的标准配方见实施例2，NaNO3浓度因培
，40mg/L的磷酸氢二养目的不同而有所改变。优化培养中加入0.15g/L到1.5g/L的NaNO
3
钾；优选，培养微藻藻株的培养基中加入0.15g/L到0.75g/L的NaNO
，40mg/L的磷酸氢二
3
浓度可以为0.15g/L、0.75/L和1.50g/L，40mg/钾。更优选，培养微藻藻株的培养基中NaNO
3
L的磷酸氢二钾。
[0030] 所述的微藻在生物柴油、油脂、藻类蛋白、脂肪酸和/或生物质成分中的生产应用，藻株Didymogenes sp.HN-4在BG-11培养基中生长，通过微藻的生长积累油脂，以微藻生物质为原料生产生
物柴油。
[0031] 所述的微藻在抗轮虫中的生产应用，微藻藻株Didymogenes sp.HN-4在TAP或BG-11培养基中培养，其藻液和滤液能够抑制轮虫的生长。
[0032] 具体，在BG-11培养基中培养所述微藻藻株，配方同实施例2。培养条件：灭菌三角瓶中静置或震荡培养，光照强度为100-200μmol photons/m2/s，温度为24℃～30℃。在TAP培养基中培养所述微藻藻株，配方同实施例4。培养条件：灭菌三角瓶中静置或震荡培养，光照强度为100-200μmol photons/m2/s，温度为24℃～30℃。
[0033] 实施例1：Didymogenes sp.HN-4藻株的分离
[0034] Didymogenes sp.HN-4分离于湖南省某地池塘，具体过程为：用无菌瓶取适量池塘水样，在实验室无菌条件下，涂布BG-11培养基平板，置光照培养箱，25℃条件下培养至出现藻落，挑取多个藻落再进行多次划线分离的步骤，直至得到完全纯化的藻落。即得到HN-4，经18S rDNA和ITS1-5.8S-ITS DNA序列的测序分析，鉴定为Didymogenes属物种.。[0035] 在无菌条件下在固体平板上挑取Didymogenes sp.HN-4单菌落，经反复划线挑取获得纯化的藻落，其保藏信息为Didymogenes sp.HN-4藻株于2013年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101)，保藏编号为CGMCC No.8401。
[0036] 实施例2：Didymogenes sp.HN-4藻液的初始培养
[0037] 在实验室条件下，将上述Didymogenes sp.HN-4以试管斜面培养基划线保存，或者
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