(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711262810.4
(22)申请日 2017.12.04
(83)生物保藏信息
CGMCC No. 0908 2003.03.19
(71)申请人 广东双骏生物科技有限公司
地址 515071 广东省汕头市汕头保税区C03
地块双骏生物科技园
(72)发明人 陈杰鹏 段丽丽 洪琳 陈煜藩
陈鸿锐 邱雪莲 蔡桂珠 胡留松
许志锴 叶红林 黄晓莹 纪烨瑜
(74)专利代理机构 北京安信方达知识产权代理
有限公司 11262
代理人 陈丹 苏蕾
(51)Int.Cl.
C12P 21/02(2006.01)
C07K 14/815(2006.01)C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种生产重组水蛭素的方法，
所述方法包括：将pBH-2工程菌(保藏号：CGMCC
对数生长期结束，然后升温至35℃-45℃继续进
行培养，该升温过程是在1小时内完成，
可选地在10分钟内完成，
还可选地在5分钟内完成。权利要求书2页 说明书13页 附图2页CN 108220369 A 2018.06.29
C N 108220369
A
1.一种生产重组水蛭素的方法，其特征在于，包括：将pBH-2工程菌(保藏号：CGMCC No0908)接种至包含碳源物质和氮源物质的发酵培养基中，在需氧条件下，在25℃-35℃的温度下培养至对数生长期结束，然后升温至35℃-45℃继续进行培养至水蛭素产量达到峰值；
可选地继续培养3-16小时或更长，使得水蛭素产量达到峰值；
可选地在30℃的温度下培养至对数生长期结束，可选地升温至42℃继续进行培养3-16小时或更长。
2.根据权利要求1所述的方法，其中升温过程是在1小时内完成，可选地在10分钟内完成，还可选地在5分钟内完成。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述碳源物质选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、糊精、乳糖、果糖和甘油中的一种或更多种，可选地，所述碳源物质为蔗糖，或所述碳源物质为蔗糖与选自葡萄糖、麦芽糖、淀粉、糊精、乳糖、果糖和甘油中的一种或更多种的组合。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述氮源物质选自玉米浆、酵母粉、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母提取物、硝酸铵、氯化铵和硫酸铵中的一种或更多种，可选地，所述氮源物质为酵母粉、蛋白胨或酵母粉和蛋白胨两者，或所述氮源物质为酵母粉、蛋白胨或酵母粉和蛋白胨两者与选自玉米浆、牛肉浸膏、酵母提取物、硝酸铵、氯化铵和硫酸铵中的一种或更多种的组合。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵培养基中的所述碳源物质与所述氮源物质的重量比为0.2-40：1，可选地为1.1:1。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵培养基还包含磷酸盐、镁盐、钠盐或其组合，可选地，所述磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中的一种或更多种；可选地，所述镁盐为硫酸镁或氯化镁；可选地，所述钠盐选自氯化钠、柠檬酸钠、硫酸钠、醋酸钠中的一种或更多种。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基还包含铁盐、锰盐、铝盐、钴盐、锌盐、铜盐、镍盐、硼酸、维生素B1中的一种或更多种。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵培养基还含有抗生素物质，可选地，所述抗生素物质为氨苄青霉素；可选地，所述抗生素物质分两次加入发酵培养基中，其中第一次加入是在接种时且第二次加入是在菌体培养至对数生长期结束之前；还可选地，所述抗生素物质的第二次加入是以流的形式进行添加。
9.根据权利要求1所述的方法，其中以1％-20％的接种量将所述pBH-2工程菌(保藏号：CGMCC No0908)接种至所述发酵培养基，可选地以15％的接种量接种。
10.根据权利要求1所述的方法，其中菌株培养初始pH值为5.5-11，可选6.5-8.0。
11.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括以下步骤：
对菌株发酵液进行灭活处理，灭活温度60℃-80℃，可选75℃；灭活时间为5min-20min，可选10min；
任选地，灭活处理后的菌株发酵液经0.1～1μm孔径的陶瓷膜进行固液分离，纯化水水洗，收集陶瓷膜透析液，陶瓷膜透析液再用3万分子量以下孔径的超滤膜浓缩，向浓缩后的浓缩液加重量比为5％-30％的盐进行喷雾干燥。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵培养基的组成物质可以分两次加入，其
中第一次加入是在接种前加入，第二次加入是于接种后以流的方式加入且在13小时内完成。
13.根据权利要求8所述的方法，其中所述以流的方式进行添加是指将流速控制在每分钟补入基于培养基溶液的总体积计的0.017mg/L-0.33mg/L的抗生素物质。
一种生产重组水蛭素的方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物工程技术，特别是发酵工程，尤指一种生产重组水蛭素的方法。
背景技术
[0002]水蛭素是凝血酶特异性抑制剂，能有效预防和弥散性血管内凝血，在心脑血栓疾病方面均有显著作用。由于天然的水蛭素产量有限，每条水蛭只含20μg的水蛭素，不能满足临床应用的要求，为此，采用生物工程技术生产重组水蛭素的研究——特别是能够生产高产率的重组水蛭素的方法——显得尤为重要。
发明内容
[0003]为了解决上述技术问题，本发明提供了一种生产重组水蛭素的方法，所述方法采用pBH-2工程菌(大肠埃希氏菌(Escherichia coli)；中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2003年03月19日；保藏编号：CGMCC No.0908)，通过高密度、高表达的发酵工艺生产重组水蛭素，能够极大地提高重组水蛭素的产量。
[0004]为了达到本发明目的，本发明提供了一种生产重组水蛭素的方法，所述方法包括：将pBH-2工程菌(保藏号：CGMCC No.0908)接种至包含碳源物质和氮源物质的发酵培养基中，在需氧条件下，在25℃-35℃的温度下培养至对数生长期结束，然后升温至35℃-45℃继续进行培养至水蛭素产量达到峰值。
[0005]在以上或其他实施方式中，可以继续培养3-16小时或更长，使得水蛭素产量达到峰值。
[0006]在以上或其他实施方式中，可以在30℃的温度下培养至对数生长期结束。[0007]在以上或其他实施方式中，可以升温至42℃继续进行培养3-16小时或更长，使得水蛭素产量达到峰值。
[0008]在以上或其他实施方式中，升温过程可以在1小时内完成。
[0009]在以上或其他实施方式中，升温过程可以在10分钟内完成。
[0010]在以上或其他实施方式中，升温过程可以在5分钟内容完成。
[0011]在以上或其他实施方式中，所述碳源物质可以选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、糊精、乳糖、果糖和甘油中的一种或更多种。其中，所述发酵培养基中的所述碳源物质的加入量可以由本领域技术人员根据需要确定。例如，在一些情况下，所述发酵培养基中的所述碳源物质的量为基于培养基溶液的总体积计的5-200g/L。
[0012]在以上或其他实施方式中，所述碳源物质可以为蔗糖。
[0013]在以上或其他实施方式中，所述碳源物质可以为蔗糖与选自葡萄糖、麦芽糖、淀粉、糊精、乳糖、果糖和甘油中的一种或更多种的组合。
[0014]在以上或其他实施方式中，其中所述氮源物质可以选自玉米浆、酵母粉、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母提取物、硝酸铵、氯化铵和硫酸铵中的一种或更多种。所述发酵培养基中的
所述氮源物质的加入量可以由本领域技术人员根据需要确定。例如，在一些情况下，所述发酵培养基中的所述氮源物质的量为基于培养基溶液的总体积计的10-120g/L。
[0015]在以上或其他实施方式中，所述氮源物质可以为酵母粉、蛋白胨或酵母粉和蛋白胨两者。
[0016]在以上或其他实施方式中，所述氮源物质可以为酵母粉、蛋白胨或酵母粉和蛋白胨两者与选自玉米浆、牛肉浸膏、酵母提取物、硝酸铵、氯化铵和硫酸铵中的一种或更多种的组合。
[0017]在以上或其他实施方式中，所述氮源可以选自安琪蛋白胨FP318、安琪酵母粉FM818或两者。
[0018]在以上或其他实施方式中，其中所述发酵培养基中的所述碳源物质与所述氮源物质的重量比可以为0.2-40：1。
[0019]在以上或其他实施方式中，其中所述发酵培养基中的所述碳源物质与所述氮源物质的重量比可以为1.1:1。
[0020]在以上或其他实施方式中，还可以向所述培养基中加入其它无机物质以促进微生物的生长和提高重组水蛭素的产率。比如，在以上或其他实施方式中，所述发酵培养基还可以包含磷酸盐、镁盐、钠盐或其组合，可选地，所述磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中的一种或更多种。
[0021]在以上或其他实施方式中，所述磷酸盐的加入量可以为基于培养基溶液的总体积计的0.2-20g/L。
[0022]在以上或其他实施方式中，所述镁盐可以为硫酸镁或氯化镁。
[0023]在以上或其他实施方式中，所述镁盐的加入量可以为基于培养基溶液的总体积计的0.1-1.5g/L。
[0024]在以上或其他实施方式中，所述钠盐可以选自氯化钠、柠檬酸钠、硫酸钠、醋酸钠中的一种或更多种。
[0025]在以上或其他实施方式中，所述钠盐的加入量可以为基于培养基溶液的总体积计的0.1-25g/L。本申请的发明人发现，钠盐的加入有利于促进pBH-2工程菌表达更多的重组水蛭素。
[0026]在以上或其他实施方式中，所述培养基还可以包含铁盐、锰盐、铝盐、钴盐、锌盐、铜盐、镍盐、硼酸、维生素B1中的一种或更多种。本领域技术人员可以根据实际需要选择上述各个组分并确定其添加量。
[0027]在以上或其他实施方式中，所述发酵培养基还可以含有抗生素物质。
[0028]在以上或其他实施方式中，所述抗生素物质可以为氨苄青霉素(AMP)。
[0029]在以上或其他实施方式中，所述抗生素物质的加入量为基于培养基溶液的总体积计的0.01-0.2g/L。
[0030]在以上或其他实施方式中，所述抗生素物质可以分两次加入发酵培养基中，其中第一次加入是在接种时且第二次加入是在菌体培养至对数生长期结束之前。
[0031]在以上或其他实施方式中，第一次在接种时以培养基溶液的总体积计的0.01-0.2g/L的量加入所述抗生素物质，第二次在菌体培养至对数生长期结束之前，以基于培养基溶液的总体积计的0.01-0.2g/L的量加入抗生素物质。
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