一种烟酰胺单核苷酸的制备方法与流程

1.本发明涉及烟酰胺单核苷酸制备技术领域，特别涉及一种烟酰胺单核苷酸的制备方法。

背景技术：

2.烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamide mononucleotide，简称β-nmn或者nmn)天然存在于人体内，参与细胞内烟酰胺嘌呤二核苷酸(nad+)的合成，是其重要并且最直接的前提物质，是细胞能量重要来源之一。
3.nmn的生理功能需要转化为nad+才可以实现，nad+是一种重要的辅酶，其可以充当电子载体，参与各种酶促氧化-还原反应。在细胞代谢和能量生产中发挥着重要的作用，并作为nad+依赖性信号转导的底物。由于分子量较大，其不能被人体直接吸收，nmn作为其最直接的前体，两者的代谢是紧密联系在一起的。nmn随着人体年龄的整长而减少，通过摄入蔬菜水果所吸收的nmn又比较微量。nmn的缺少会阻碍线粒体与细胞核之间的信号交流，损害细胞产生能量的能力，继而造成各种疾病，如老年退行性疾病，视网膜退行性疾病，糖尿病等，因此有必要开发出有效制备nmn的方法。
4.现阶段主要的nmn制备方法主要分为化学法和酶法。化学法多以四乙酰核糖或烟酰胺为底物，反应条件苛刻，耗能高，步骤繁琐，需要用到有机溶剂甚至有毒试剂，污染较大，逐渐不受青睐。酶法多以烟酰胺、烟酰胺核糖或d-5-磷酸核糖为底物，以atp或amp等作为供能基团，在烟酰胺磷酸核糖转移酶、核酸磷酸焦磷酸激酶以及核苷酶等的催化作用下发生反应，制得烟酰胺单核苷酸。
5.但是上述所使用的烟酰胺、atp、d-5-磷酸核糖等底物成本较高，此外d-5-磷酸核糖稳定性较差，烟酰胺磷酸核糖转移酶是一种限速酶，易受到反馈抑制，使得反应速率变慢，因此需要开发具有价格优势和速率优势的生物合成方法。

技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，从微生物菌体中获取烟酰胺核糖激酶，并将烟酰胺核糖激酶转入到大肠杆菌bl21中，获得含nrk基因的重组大肠杆菌细胞，并以烟酰胺核糖、三磷酸腺苷为底物原料，以镁离子作催化剂，用含烟酰胺核糖激酶的重组大肠杆菌进行催化反应，获得烟酰胺单核苷酸，解决现有的酶法反应步骤繁琐，产物难以分离的问题；且通过实验获得利用含有nrk基因的重组大肠杆菌可以高效转化烟酰胺核糖为烟酰胺单核苷酸，转化率高达99％以上，提高烟酰胺核糖的转化率；控制反应体系的ph为7.0-7.5，反应温度为28-32℃，优化了反应条件，反应时间缩短，使得nrk重组大肠杆菌可以高效转化烟酰胺为烟酸，以解决上述背景技术中提出的问题。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，包括以下步骤：
8.s1：向反应容器中加入底物原料和含有二价金属离子的催化剂，充分震荡至完全
溶解，用氢氧化钠溶液调节反应体系的ph至5.0-8.0；
9.s2：向s1中加入含烟酰胺核糖激酶的重组微生物菌体，同时控制反应体系的反应温度至22-40℃，进行催化反应，反应时长为3-6h，得到烟酰胺单核苷酸。
10.优选的，所述反应体系的反应温度为28-32℃。
11.优选的，所述反应体系的ph为7.0-7.5。
12.优选的，所述底物原料为烟酰胺核糖和三磷酸腺的混合物，或者苷烟酰胺核糖和三磷酸腺苷的钠盐混合物。
13.优选的，所述催化剂为含有镁离子的催化剂。
14.优选的，所述微生物菌体为活菌体、死菌体、游离酶和固定化酶中的一种，且微生物菌体选用细菌或者真菌。
15.优选的，所述微生物为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母和酿酒酵母中的一种。
16.优选的，所述重组微生物菌体的烟酰胺核糖激酶核苷酸序列来源于马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)，甜菜生尾孢菌(cercospora beticola)，香蕉尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum f.sp.cubense)，棘孢木霉(trichoderma asperellum cbs 433.97)和球孢白僵菌(beauveria bassiana)中的一种。
17.优选的，所述含烟酰胺核糖激酶的重组微生物菌体的制备方法包括以下步骤：
18.s11：从马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)中获取烟酰胺核糖激酶基因序列，设计引物，构建pet28a-nrk表达载体，将其转入到大肠杆菌bl21中；
19.s12：经双酶切验证、基因测序等确定其转接成功，培养大肠杆菌，发酵表达，得到含nrk基因的重组大肠杆菌细胞。
20.优选的，所述含烟酰胺核糖激酶的重组微生物菌体的制备方法包括以下步骤：
21.s111：从马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)中获取烟酰胺核糖激酶基因序列，并从线粒体中复制atp合成酶多条肽链的基因编码；
22.s112：分别构建于表达载体pet28a中，再转化大肠杆菌trans1-t1，得到重组质粒，再分别将重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3)中，得到重组菌；
23.s121：采用以下质量百分比的原料组成发酵培养基：蛋白胨1.0-2.0％，酵母浸粉0.2-1.0％，磷酸二氢钾0.05-0.15％，磷酸氢二钾0.03-0.10％，甘油0.5-1.0％，硫酸镁0.05-0.2％，消泡剂0.05-0.10％，其余是饮用水，ph6.8-7；
24.s122：培养基使用蒸汽灭菌后，接种大肠杆菌bl21，温度设置在33-37℃，通气量3-10l/min，搅拌是300-600rpm，在发酵罐里培养5-6小时加入异丙基硫代半乳糖苷iptg 0.5g诱导，继续培养15-22小时，得到培养液；
25.s123：将培养液经过离心取菌体，使用0.2-0.6mpa压力匀浆破碎后过滤取滤液。
26.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
27.1、本发明提出的一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，从微生物菌体中获取烟酰胺核糖激酶，并将烟酰胺核糖激酶转入到大肠杆菌bl21中，获得含nrk基因的重组大肠杆菌细胞，并以烟酰胺核糖、三磷酸腺苷为底物原料，以镁离子作催化剂，用含烟酰胺核糖激酶的重组大肠杆菌进行催化反应，获得烟酰胺单核苷酸，解决现有的酶法反应步骤繁琐，产物难以分离的问题；
28.2、本发明提出的一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，通过实验获得利用含有nrk基
因的重组大肠杆菌可以高效转化烟酰胺核糖为烟酰胺单核苷酸，转化率高达99％以上，提高烟酰胺核糖的转化率；
29.3、本发明提出的一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，控制反应体系的ph为7.0-7.5，反应温度为28-32℃，优化了反应条件，反应时间缩短，使得nrk重组大肠杆菌可以高效转化烟酰胺为烟酸；
30.4、本发明提出的一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，通过atp再生酶转入到大肠杆菌bl21中，atp再生酶与多磷酸再次将底物atp消耗产生的adp再生，极大地节约成本。
附图说明
31.图1为本发明的反应式图。
具体实施方式
32.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.请参阅图1，一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，包括以下步骤：
34.s1：向反应容器中加入底物原料和含有二价金属离子的催化剂，底物原料为烟酰胺核糖和三磷酸腺的混合物，或者苷烟酰胺核糖和三磷酸腺苷的钠盐混合物，微生物为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母和酿酒酵母中的一种，催化剂为含有镁离子的催化剂，充分震荡至完全溶解，用氢氧化钠溶液调节反应体系的ph至5.0-8.0；
35.s2：向s1中加入含烟酰胺核糖激酶的重组微生物菌体，微生物菌体为活菌体、死菌体、游离酶和固定化酶中的一种，且微生物菌体选用细菌或者真菌，重组微生物菌体的烟酰胺核糖激酶核苷酸序列来源于马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)，甜菜生尾孢菌(cercospora beticola)，香蕉尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum f.sp.cubense)，棘孢木霉(trichoderma asperellum cbs 433.97)和球孢白僵菌(beauveria bassiana)中的一种，同时控制反应体系的反应温度至22-40℃，进行催化反应，反应时长为3-6h，得到烟酰胺单核苷酸；
36.其中，含烟酰胺核糖激酶的重组微生物菌体的制备方法包括以下步骤：
37.s11：从马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)中获取烟酰胺核糖激酶基因序列，设计引物，构建pet28a-nrk表达载体，将其转入到大肠杆菌bl21中；
38.s12：经双酶切验证、基因测序等确定其转接成功，培养大肠杆菌，发酵表达，得到含nrk基因的重组大肠杆菌细胞；
39.s121：采用以下质量百分比的原料组成发酵培养基：蛋白胨1.0-2.0％，酵母浸粉0.2-1.0％，磷酸二氢钾0.05-0.15％，磷酸氢二钾0.03-0.10％，甘油0.5-1.0％，硫酸镁0.05-0.2％，消泡剂0.05-0.10％，其余是饮用水，ph6.8-7；
40.s122：培养基使用蒸汽灭菌后，接种大肠杆菌bl21，温度设置在33-37℃，通气量3-10l/min，搅拌是300-600rpm，在发酵罐里培养5-6小时加入异丙基硫代半乳糖苷iptg 0.5g诱导，继续培养15-22小时，得到培养液；
41.s123：将培养液经过离心取菌体，使用0.2-0.6mpa压力匀浆破碎后过滤取滤液。
42.实施例一：
43.本实施例采用大肠杆菌发酵液进行酶活测定，酶活的定义：在25℃下，1ml发酵液与2.85g烟酰胺核糖反应催化10分钟后生成的烟酰胺单核苷酸的毫摩尔数，该毫摩尔数即为总酶活力单位数u。
44.将得到的菌体重悬于ph5.0-8.0的缓冲液中，破碎，离心，获取上清液为粗酶液。
45.进行酶活测定，检测的反应体系为0.8ml，包括0.2ml的nr溶液、0.2ml的atp-2na溶液、0.1ml的氯化镁溶液和0.29ml的pbs缓冲溶液，加入0.01ml的s13中的粗酶液，在25℃下反应10分钟后，立即添加0.2ml稀硫酸终止反应，12000rpm离心3分钟后，取上层清液采用高效液相谱(hplc)测定上层清液中的烟酰胺单核苷酸的含量，高效液相谱的检测条件如下：
46.谱柱：eclipse plus c18 5um 4.6*250mm
47.柱温：30℃
48.流动相：a：80ml水+0.1g庚烷磺酸钠+0.02ml三乙胺+0.1ml冰醋酸
49.b：乙腈
50.a:b＝9:1
51.流速：0.8ml/min
52.检测波长：265nm
53.进样量：20μl。
54.实施例二：重组大肠杆菌100ml反应实验；
55.向三角瓶中分别加入10g烟酰胺核糖、10g的三磷酸腺苷钠盐和1g的氯化镁，充分震荡溶解后，用氢氧化钠溶液调ph至7.0，补水定容至100ml；再向其中加入0.5g烟酰胺核糖激酶大肠杆菌bl21菌体，在30℃下震荡反应4h，取样，经hplc检测样品中nmn浓度为80g/l。
56.实施例三：重组大肠杆菌1000ml反应实验；
57.向反应釜中分别加入100g烟酰胺核糖、100g的三磷酸腺苷钠盐和10g的氯化镁，充分震荡使底物完全溶解后，用氢氧化钠溶液调ph至7.0，补水定容至1000ml；再向其中加入5g烟酰胺核糖激酶大肠杆菌bl21菌体，在30℃下搅拌反应6h，取样，经hplc检测样品中nmn浓度为90g/l。
58.实施例四：重组大肠杆菌10l反应实验；
59.向反应釜中加入1kg烟酰胺核糖和100g的氯化镁，充分震荡使底物完全溶解后，用氢氧化钠溶液调ph至7.0，补水定容至5l，将1kg的三磷酸腺苷钠盐溶解于5l水，恒速流加至反应釜中；再向其中加入50g烟酰胺核糖激酶大肠杆菌bl21菌体，在30℃下搅拌反应3h，取样，经hplc检测样品中nmn浓度为95g/l。
60.实施例五：
61.含烟酰胺核糖激酶的重组微生物菌体的制备方法包括以下步骤：
62.s111：从马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)中获取烟酰胺核糖激酶基因序列，并从线粒体中复制atp合成酶多条肽链的基因编码；
63.s112：分别构建于表达载体pet28a中，再转化大肠杆菌trans1-t1，得到重组质粒，再分别将重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3)中，得到重组菌；
64.向三角瓶中分别加入10g烟酰胺核糖、10g的三磷酸腺苷钠盐和1g的氯化镁，充分震荡溶解后，用氢氧化钠溶液调ph至7.0，补水定容至100ml；再向其中加入0.5g上述方法获得的烟酰胺核糖激酶大肠杆菌bl21菌体，同时加入5g的多磷酸在30℃下震荡反应4h，取样，经hplc检测样品中nmn浓度为82g/l。
[0065][0066]
从上表中可以得出，控制ph和反应温度相同的情况下，反应时间长的实施例二，最终获得的nmn浓度更高，但是在实施例四中，将水与三磷酸腺苷钠盐提前混合的情况下，能够缩短反应的时长的同时，还能提高nmn浓度，而实施例五中，因为大肠杆菌bl21中含有atp合成酶，且在反应过程中增加了多磷酸成分，相比于实施例二，nmn浓度也有所提高，说明含atp合成酶的大肠杆菌bl21对转化烟酰胺核糖为烟酰胺单核苷酸的效率有益。
[0067]
综上所述：本发明提出的一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，从微生物菌体中获取烟酰胺核糖激酶，并将烟酰胺核糖激酶转入到大肠杆菌bl21中，获得含nrk基因的重组大肠杆菌细胞，并以烟酰胺核糖、三磷酸腺苷为底物原料，以镁离子作催化剂，用含烟酰胺核糖激酶的重组大肠杆菌进行催化反应，获得烟酰胺单核苷酸，解决现有的酶法反应步骤繁琐，产物难以分离的问题；且通过实验获得利用含有nrk基因的重组大肠杆菌可以高效转化烟酰胺核糖为烟酰胺单核苷酸，转化率高达99％以上，提高烟酰胺核糖的转化率；控制反应体系的ph为7.0-7.5，反应温度为28-32℃，优化了反应条件，反应时间缩短，使得nrk重组大肠杆菌可以高效转化烟酰胺为烟酸。
[0068]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1：向反应容器中加入底物原料和含有二价金属离子的催化剂，充分震荡至完全溶解，用氢氧化钠溶液调节反应体系的ph至5.0-8.0；s2：向s1中加入含烟酰胺核糖激酶的重组微生物菌体，同时控制反应体系的反应温度至22-40℃，进行催化反应，反应时长为3-6h，得到烟酰胺单核苷酸。2.如权利要求1所述的一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于：所述反应体系的反应温度为28-32℃。3.如权利要求1所述的一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于：所述反应体系的ph为7.0-7.5。4.如权利要求1所述的一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于：所述底物原料为烟酰胺核糖和三磷酸腺的混合物，或者烟酰胺核糖和三磷酸腺苷的钠盐混合物。5.如权利要求1所述的一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于：所述催化剂为含有镁离子的催化剂。6.如权利要求1所述的一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于：所述微生物菌体为活菌体、死菌体、游离酶和固定化酶中的一种，且微生物菌体选用细菌或者真菌。7.如权利要求6所述的一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于：所述微生物为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母和酿酒酵母中的一种。8.如权利要求7所述的一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于：所述重组微生物菌体的烟酰胺核糖激酶核苷酸序列来源于马克斯克鲁维酵母，甜菜生尾孢菌，香蕉尖孢镰刀菌，棘孢木霉和球孢白僵菌中的一种。9.如权利要求8所述的一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于：所述含烟酰胺核糖激酶的重组微生物菌体的制备方法包括以下步骤：s11：从马克斯克鲁维酵母中获取烟酰胺核糖激酶基因序列，设计引物，构建pet28a-nrk表达载体，将其转入到大肠杆菌bl21中；s12：经双酶切验证、基因测序等确定其转接成功，培养大肠杆菌，发酵表达，得到含nrk基因的重组大肠杆菌细胞。10.如权利要求9所述的一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于：所述含烟酰胺核糖激酶的重组微生物菌体的制备方法包括以下步骤：s111：从马克斯克鲁维酵母中获取烟酰胺核糖激酶基因序列，并从线粒体中复制atp合成酶多条肽链的基因编码；s112：分别构建于表达载体pet28a中，再转化大肠杆菌trans1-t1，得到重组质粒，再分别将重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3)中，得到重组菌；s121：采用以下质量百分比的原料组成发酵培养基：蛋白胨1.0-2.0％，酵母浸粉0.2-1.0％，磷酸二氢钾0.05-0.15％，磷酸氢二钾0.03-0.10％，甘油0.5-1.0％，硫酸镁0.05-0.2％，消泡剂0.05-0.10％，其余是饮用水，ph6.8-7；s122：培养基使用蒸汽灭菌后，接种大肠杆菌bl21，温度设置在33-37℃，通气量3-10l/min，搅拌转速300-600rpm，在发酵罐里培养5-6小时加入异丙基硫代半乳糖苷iptg 0.5g诱导，继续培养15-22小时，得到培养液；s123：将培养液经过离心取菌体，使用0.2-0.6mpa压力匀浆破碎后过滤取滤液。

技术总结

本发明公开了一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，涉及烟酰胺单核苷酸制备技术领域。一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，包括以下步骤：S1：向反应容器中加入底物原料和含有二价金属离子的催化剂，充分震荡至完全溶解；S2：向S1中加入含烟酰胺核糖激酶的重组微生物菌体，同时控制反应体系的反应温度至22-40℃，进行催化反应，得到烟酰胺单核苷酸。本发明提出的一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，从微生物菌体中获取烟酰胺核糖激酶，并将烟酰胺核糖激酶转入到大肠杆菌BL21中，获得含NRK基因的重组大肠杆菌细胞，用含烟酰胺核糖激酶的重组大肠杆菌进行催化反应，获得烟酰胺单核苷酸，解决现有的酶法反应步骤繁琐，产物难以分离的问题。产物难以分离的问题。产物难以分离的问题。