(19)国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202210478404.6
(22)申请日 2022.05.05
(71)申请人 河南师范大学
地址 453007 河南省新乡市牧野区建设东
路46号
(72)发明人 梁卫红 朱明兰 王俊杰 毕一凡
戚旺 黄俊骏 刘肖飞 张禹舜
王华华
(74)专利代理机构 新乡市平原智汇知识产权代
理事务所(普通合伙) 41139
专利代理师 路宽
(51)Int.Cl.
C12N 15/84(2006.01)
C12N 15/29(2006.01)
A01H 5/00(2018.01)
A01H 6/46(2018.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种耐盐水稻品种的育种方
法，该方法以沿黄水稻新丰2号为受体材料，利用
CRISPR/Cas9技术定向编辑水稻OsSPL10基因， 构建OsSPL10基因敲除重组载体，以农杆菌介导法 转化受体材料新丰2号水稻胚性愈伤，经筛选和
分子鉴定后，获得T0代敲除纯合水稻植株，并在
幼苗期检测其耐盐特性，结果表明获得的敲除纯
合水稻收获种子后，萌发水稻种子具有较好的耐
盐性。权利要求书1页 说明书4页序列表2页 附图2页CN 114672514 A 2022.06.28
C N 114672514
A
1.一种耐盐水稻品种的育种方法，其特征在于具体过程为：利用CRISPR/Cas9技术对水稻OsSPL10基因进行定点编辑，在水稻OsSPL10基因的第1个外显子的518bp ‑539bp处，序列如SEQ ID NO .1所示，PAM位点为NGG的目标序列作为敲除靶位点；设计引物F1、R1，对应引物序列分别如SEQ ID N
O .2、SEQ ID NO .3所示，通过引物退火制备的gRNA，pC1300‑ Ubi ‑Cas9 载体用KpnI和BamHI进行酶切，gRNA用KpnI和BglII进行酶切并回收gRNA片段，并将gRNA片段连接pC1300‑ Ubi ‑Cas9 载体上，构建敲除重组载体Cas9‑ OsSPL10，采用农杆菌介导法转化水稻愈伤组织获得T0代OsSPL10基因敲除再生水稻植株，并通过测序筛选到敲除纯和水稻株系。
2.根据权利要求1所述的耐盐水稻品种的育种方法，其特征在于：gRNA片段制备过程的反应体系为：引物F1、R1各5µL，H 2O 40µL；反应条件为：95℃变性5min、55℃退火5min。
3.根据权利要求1所述的耐盐水稻品种的育种方法，其特征在于：gRNA片段与pC1300‑ Ubi ‑Cas9载体连接过程的反应体系为：gRNA片段4µL，载体2µL，T4 DNA连接酶0.5µL，Eco 31I
0.5µL，T4 Buffer
1µL，H 2O 5µL，反应条件为：混匀后于37℃反应2h。4.根据权利要求1所述的耐盐水稻品种的育种方法，其特征在于：采取冻融法将敲除重组载体Cas9‑OsSPL10转入根癌农杆菌EHA 105感受态细胞中，并以农杆菌转化子菌液受体材料浸染水稻愈伤组织，获得敲除再生水稻植株，并通过测序筛选到敲除纯合水稻株系。
5.根据权利要求1所述的耐盐水稻品种的育种方法，其特征在于：所述水稻为沿黄水稻新丰2号。
权 利 要 求 书1/1页CN 114672514 A
一种耐盐水稻品种的育种方法
技术领域
[0001]本发明属于农业和分子生物学技术领域，具体涉及一种耐盐水稻品种的育种方法。
背景技术
[0002]水稻是全球一半以上人口的主食，也是中国主要粮食作物之一。因此水稻生产在保障国家粮食安全和农业可持续发展中具有不可取代的战略地位和重要意义。随着耕地面积的不断减少，土壤盐渍化问题的日趋严重，耐盐新品种水稻的培育成为水稻生产中亟待解决的问题[1]。沿黄稻区作为优质米生产基地，在品种利用方面仍存在一定问题，例如生产上可供选择的优质高产抗性好的优良品种较少，品种更新换代较慢，缺乏优质抗病适应性强的优质超高产粳稻新品种。在国家相关产业技术政策中，已经明确推动生物分子等先进技术向农业生产的转移，对于重要农作物发展前景而言，重点在高产、优质、多抗、高效、专用农作物新品种的培育与产业化。因此将传统育种技术和现代生物技术结合是突破育种瓶颈的解决之道。
[0003]CRISPR/Cas9系统是近几年逐步成熟的一种定点基因组编辑工具，CRISPR/Cas9技术在水稻高
效精准分子设计育种中已经展现出重大理论意义和广阔的应用前景，因其简便高效而被广泛应用于包括水稻在内的多种生物的基因组编辑中。例如Wang等以籼粳杂交稻春优84作为水稻无融合生殖研究的模式品种，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除了REC8，PAIR1，OSD1 和MTL4个水稻生殖相关基因，建立了水稻无融合生殖体系，成功克隆出杂交稻种子[2]，首次实现杂交稻性状稳定遗传到下一代，不仅证明了杂交稻进行无融合生殖的可行性，而且证明了CRISPR/Cas9技术在水稻高效精准分子设计育种中的应用价值。周等以育种骨干亲本三系恢复系R192为受体利用CRISPR/Cas9技术定向编辑水稻耐盐性的主效基因OsRR22，诱导产生突变体M16和M18，进行苗期耐盐性鉴定，结果表明突变体提高了水稻的耐盐性，为水稻的耐盐性改良提供参考[3]。宋海冰利用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究OsSPL10基因的功能，发现该基因编辑后，受体水稻品种中花‑11表现出耐盐特性[4]。[0004]参考文献：
[1]王洋，张瑞，刘永昊，李荣凯，葛建飞，邓仕文，张徐彬，陈英龙，韦还和，戴其根.水稻对盐胁迫的响应及耐盐机理研究进展[J/OL].中国水稻科学.2022,17(03) :1‑16。[0005][2] Wang C, Liu Q, Shen Y, et al,. Clonal seeds from hybrid rice by simultaneous genome engineering of meiosis and fertilization genes. Nature Biotechnology, 2019, 37:283‑287.
[3]周雷，韩晓丽，徐华山，黄见良，游艾青. 利用CRISPR/Cas9技术创制水稻苗期耐盐新种质[C].第十九届中国作物学会学术年会论文摘要集.2020,20(20):220‑229。[0006][4]宋海冰. 水稻OsSPL10基因的功能分析[D].福建农林大学,2017。
[0007]本发明解决的技术问题是提供了一种耐盐水稻品种的育种方法，该方法以沿黄水稻新丰2号为受体材料，利用CRISPR/Cas9技术定向编辑水稻OsSPL10基因，构建OsSPL10基因敲除重组载体，以农杆菌介导法转化受体材料新丰2号水稻胚性愈伤，经筛选和分子鉴定后，获得T0代敲除纯合水稻植株，并在幼苗期检测其耐盐特性。
[0008]本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种耐盐水稻品种的育种方法，其特征在于具体过程为：利用CRISPR/Cas9技术对水稻OsSPL10基因进行定点编辑，在水稻OsSPL10基因的第1个外显子的518bp‑539bp处，序列如SEQ ID NO .1所示，PAM位点为NGG的目标序列作为敲除靶位点；设计引物F1、R1，对应引物序列分别如SEQ ID NO .2、SEQ ID NO .3所示，通过引物退火制备的gRNA，pC1300‑ Ubi‑Cas9 载体用KpnI和BamHI进行酶切，gRNA 用KpnI和BglII进行酶切并回收gRNA片段，并将gRNA片段连接pC1300‑ Ubi‑Cas9 载体上，构建敲除重组载体Cas9‑ OsSPL10，采用农杆菌介导法转化水稻愈伤组织获得T0代OsSPL10基因的敲除再生水稻植株，并通过测序筛选到敲除纯和水稻株系。
[0009]进一步限定，gRNA片段制备过程的反应体系为：引物F1、R1各5µL，H
O 40µL；反应
2
条件为：95℃变性5min、55℃退火5min。
[0010]进一步限定，gRNA片段与pC1300‑ Ubi‑Cas9载体连接过程的反应体系为：gRNA片
O 5µL，反应条件段4µL，载体2µL，T4 DNA连接酶0.5µL，Eco31I 0.5µL，T4 Buffer 1µL，H
2
为：混匀后于37℃反应2h。
[0011]进一步限定，采取冻融法将敲除重组载体Cas9‑OsSPL10转入根癌农杆菌EHA105感受态细胞中，并以农杆菌转化子菌液受体材料浸染水稻愈伤组织，获得敲除再生水稻植株，并通过测序筛选到敲除纯合水稻株系。
[0012]进一步限定，所述水稻为沿黄水稻新丰2号。
[0013]本发明与现有技术相比具有以下优点和有益效果：本发明通过构建OsSPL10基因的敲除载体，采用农杆菌介导法转化水稻愈伤组织获得T0代OsSPL10基因的敲除水稻植株，并通过测序筛选到敲除纯合水稻株系，该T0敲除纯合水稻收获种子，种子萌发水培后进行盐胁迫处理，敲除纯合水稻植株表现出良好的耐盐性。
附图说明
[0014]图1为OsSPL10植物敲除载体的构建及编辑靶点序列比对分析结果，其中新丰2号为对照水稻WT，株系A1、株系A2分别为OsSPL10基因敲除纯合水稻株系。
[0015]图2 为盐胁迫各时期幼苗生长情况，其中（a）为正常水培15天的幼苗；（b）为盐胁迫处理4天的幼苗生长情况；（c）为盐胁迫4天后更换水稻营养液恢复4天生长情况。
具体实施方式
[0016]以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
[0017]1、水稻OsSPL10基因敲除载体的构建
根据CRISPR/Cas9靶点设计原则，将OsSPL10(登录号：LOC_Os06g44860) 提交NCBI （bi.v/gene/）进行检索到目标序列，在OsSPL10 基因的第 1个外显子的518bp‑539bp处，序列为5’‑CGCCTGCATCGCCCCGAACGGG‑3’， 长度为22bp，PAM位点为NGG的目标序列作为敲除靶位点。设计引物F1、R1，F1：5’‑ACACTTTATGCTTCCGGCTC‑3’，R1：5’‑ATCGGTGCGGGCCTCTTC‑3’，制备gRNA片段，反应体系为：引物F1、R1各5µL，H
O 40µL；
2
反应条件为：95℃变性5min、55℃退火5min，获得双链gRNA片段。将gRNA片段与pC1300‑ Ubi‑Cas9载体连接，反应体系如下：gRNA片段4µL，载体2µL，T4 DNA连接酶 0.5µL，Eco31I 0.5µL，T4 Buffer 1µL，H
O 5µL。混匀后于37℃反应2h。连接产物转化大肠杆菌感受态，筛
2
选阳性克隆，经鉴定和测序确认敲除重组载体Cas9‑ OsSPL10构建成功，如图1所示。[0018]2、OsSPL10基因敲除水稻的遗传转化及筛选
采取冻融法将Cas9‑OsSPL10敲除重组载体转入根癌农杆菌EHA105感受态细胞中，并以农杆菌转化子菌液受体材料浸染引黄新丰2号水稻愈伤组织，获得敲除再生水稻植株，以Hi‑TOM高通量测序法对敲除水稻进行测序鉴定，测序结果采用SnapGene软件分析，并进行预期基因序列比对。测序结果分析筛选到2株纯合突变体，其中一株在靶点编辑序列第5bp处缺失一个C，命名为株系A1，其序列如SEQ ID NO .4所示；一株在靶点编辑序列第5‑6bp处缺失CG，命名为株系A2，其序列如SEQ ID NO .5所示；沿黄
新丰2号水稻序列如SEQ ID NO .6所示。
[0019]3、水稻幼苗期盐胁迫处理
T0代新丰2号敲除纯合水稻收获种子后，萌发水稻种子后用水稻营养液水培15天到三叶一心期，换200mmol/L的NaCl溶液培养至第4天，对照组野生型新丰2号水稻和实验组敲除纯合水稻具有明显的耐盐表型后拍照记录，如图2所示。
[0020]以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
[0021]SEQUENCE LISTING
<110> 河南师范大学
<120> 一种耐盐水稻品种的育种方法
<130> 2022
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 1
cgcctgcatcgccccgaacg gg 22
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