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一种基于聚氨基酸的大分子吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂及其制备方法与应用

1.本发明构建了一种基于聚氨基酸的大分子吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂，具体涉及由聚乙二醇接枝l-酪氨酸及1-甲基-d-氨酸的聚氨基酸材料制备的一种大分子吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂并用crgd肽修饰形成具有靶向作用的共聚物共同形成聚氨基酸纳米粒包载憎水物及在肿瘤中的应用。

背景技术：

2.以免疫检查点抑制剂和嵌合抗原受体t细胞疗法为代表的癌症免疫疗法为部分晚期癌症患者提供了肿瘤完全消除、生存率提高以及长期抑制肿瘤复发的效果，已成为一种有效且有前景的策略。吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂能调节由吲哚胺2,3-双加氧酶引起的氨酸代谢，改善由于局部l-氨酸耗竭和l-犬尿氨酸累计而导致的肿瘤微环境中t细胞活化及增殖受阻和调节性t细胞上调，激活t细胞产生免疫反应并抑制肿瘤细胞逃逸，最终抑制或消灭肿瘤组织。目前已开发了多种吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂，通过抑制吲哚胺2,3-双加氧酶活性（navoximod、linrodostat、epacadostat等）或恢复l-犬尿氨酸通路中mtorc1效应器（indoximod）来晚期实体瘤。然而，大多数吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂的水溶性较差，循环半衰期相对较短且肿瘤富集量较低，从而大大影响实际抗肿瘤效果。此外，尽管吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂在癌症中表现出高耐受性和吲哚胺2,3-双加氧酶抑制的效果，但单独使用时的客观响应通常不尽人意。
3.聚多肽具有优异的生物相容性、良好的可降解性、易于修饰等优势，被越来越多地用于构建药物递送系统。为了进一步提高药物利用率、肿瘤靶向效率和控制释放，多种纳米载体被开发用于共同封装和控制递送吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂和其他药物，但存在稳定性不足、合成工艺复杂等问题，迫切需要开发新型纳米药物来加速吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂纳米制剂的转化。

技术实现要素：

4.本发明设计合成了由聚乙二醇接枝l-酪氨酸及1-甲基-d-氨酸的一种基于聚氨基酸的大分子吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂及由crgd肽修饰的共聚物共同用于憎水物高效包载。结果表明，大分子吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂能通过π-π共轭作用及憎水作用包载憎水物提高纳米药物对抗肿瘤免疫的疗效。
5.为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种基于聚氨基酸的大分子吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂，为亲水链段-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物和/或靶向分子-亲水链段-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物。优选的，亲水链段为聚乙二醇链段；靶向分子为crgd。
6.进一步的，亲水链段-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物为具有式i结构的聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物：
式i其中，n为70～210，m为17~50，x为15～40；优选的，n为90～150，m为24~43，x为20～35；靶向分子-亲水链段-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物为具有式ⅱ结构的具有靶向作用的crgd-聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物：式ⅱ其中，n为70～210，m为17~50，x为15～40；优选的，n为90～150，m为24~43，x为20～35。
7.一种聚氨基酸纳米粒，由上述基于聚氨基酸的大分子吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂自组装得到。具体的，包括如下步骤：将亲水链段-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物溶液滴加到缓冲溶液中，滴加完毕后透析得到聚氨基酸纳米粒；或者将亲水链段-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物与靶向分子-亲水链段-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物的混合溶液滴加到缓冲溶液中，滴加完毕后透析得到聚氨基酸纳米粒。
8.本发明公开了一种基于聚氨基酸的纳米药物，由上述基于聚氨基酸的大分子吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂装载药物得到。具体的，包括如下步骤：将亲水链段-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物溶液与药物溶液滴加到缓冲溶液中，滴加完毕后透析得到基于聚氨基酸的纳米药物；或者将亲水链段-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物与靶向分子-亲水链段-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物的混合溶液与药物溶液滴加到缓冲溶液中，滴加完毕后透析得到基于聚氨基酸的纳米药物。
9.本发明公开了上述基于聚氨基酸的大分子吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物及具有靶向作用的crgd-聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物的制备方法，包括如下步骤，以亲水聚合物为引发剂，通过开环聚合l-酪氨酸-n-羧基内酸酐及1-甲基-d-氨酸-n-羧基内酸酐得到亲水链段-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物；以亲水聚合物为引发剂，通过开环聚合l-酪氨酸-n-羧基内酸酐及1-甲基-d-氨酸-n-羧基内酸酐得到亲水链段-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物，然后与靶向分子反应，得到靶向分子-亲水链段-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物。具体的，在氮气条件下，以单端为氨基的聚乙二醇为引发剂，通过开环聚合l-酪氨酸-n-羧基内酸酐及1-甲基-d-氨酸-n-羧基内酸酐得到聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物；在氮气条件下，以丙烯酸酯-聚乙二醇-氨基为大分子引发剂，通过开环聚合l-酪氨酸-n-羧基内酸酐及1-甲基-d-氨酸-n-羧基内酸酐得到丙烯酸酯-聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物，然后与含
硫醇的crgd肽发生巯基点击反应，得到crgd-聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物。进一步的，丙烯酸酯-聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物在irgacure 2959光引发剂存在下，丙烯酸酯基与含硫醇的crgd肽发生巯基点击反应，得到crgd修饰的crgd-聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物。
10.本发明公开了上述基于聚氨基酸的大分子吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂或者聚氨基酸纳米粒在制备抗肿瘤纳米药物或吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂中的应用；或者在制备提高化疗药物效果的药物中的应用。上述基于聚氨基酸的纳米药物在制备联合免疫药物中的应用。
11.由于上述技术方案的应用，本发明与现有技术相比具有下列优点：本发明设计制备的聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物具有吲哚胺2,3-双加氧酶抑制能力，良好的生物相容性和酶降解性，且制备简单、重复可控；设计构建的聚多肽纳米粒子具有粒径可控（60~95 nm）、粒径分布较窄且交联稳定的特性；同时，还可通过憎水作用和π-π堆积作用，实现对抗肿瘤小分子药物的高效包载；基于多肽的聚合物吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂为构建多功能纳米药物、提高药物疗效提供了一种简便的策略，可用于对不同癌症进行有效和安全的联合免疫。
附图说明
12.图1是实施例一中聚合物的核磁氢谱图（400 mhz, dmso-d6）。（a）1mt-nca单体的1h nmr光谱；（b）peg-b-p(tyr-co-1-mt)聚合物的1h nmr光谱（表1，entry 4）；（c）ac-peg-b-p(tyr-co-1-mt)聚合物的1h nmr光谱（表1，entry 5）；（d）crgd-peg-b-p(tyr-co-1-mt)聚合物的1h nmr光谱；图2是实施例二中胶束的理化表征（表3，entry 4）。（a）crgd-npdj在稀释和10% fbs的条件下尺寸分布（tem图像）；（b）crgd-npdj在4 ℃储存下尺寸分布和大小变化，n = 3；（c）crgd-npdj（1.0 mg/ml）在pk浓度为12.0 u/ml条下的大小变化；（d）在pk（12.0 u/ml）存在下，crgd-npdj体外dox和jq1释放曲线，n = 3；（e）1-mt标准曲线；（f）聚合物ido抑制剂（crgd-np）在60 u/ml pk条件下的降解行为，n = 3；图3-4是实例三中crgd-npdj细胞摄取、细胞毒性和ido抑制能力。图3: （a）用cy5标记的纳米颗粒孵育4小时后b16f10细胞的流式细胞仪测定；（b）1-mt和纳米颗粒与正常细胞共孵育48小时的细胞毒性；（c）1-mt和纳米颗粒与b16f10细胞共孵育48小时的细胞毒性；（d）游离药物和载药纳米颗粒对b16f10细胞的细胞毒性试验。不同配方孵育细胞4小时，新鲜培养基再孵育44小时，n = 6；图4：（a）不同crgd密度的crgd-znpdj在dox/jq1质量比为1:1时的细胞毒性实验，不同配方孵育4小时，新鲜培养基再孵育44小时，n = 6；（b）20% crgd-npdj在dox/jq1比例为2:1、1:1、1:2和1:4时的细胞毒性实验，不同配方孵育4小时，新鲜培养基再孵育44小时，n = 6；（c）纳米颗粒处理b16f10细胞48小时后kyn抑制率，n = 6；图5是实施例四中crgd-npdj诱导免疫原性细胞死亡（icd）及抑制pd-l1表达。（a-c）不同配方crgd-npdj处理24小时后icd测定：（a）使用增强型atp试剂盒测定b16f10肿瘤细胞atp的分泌，n = 3；（b-c）fcm测定crt
+
肿瘤细胞，n = 3；（d）不同配方处理24小时后pd-l1在b16f10细胞表面表达的代表性直方图；（e）fcm检测各种处理后肿瘤细胞表面pd-l1的表达，n = 3；
图6是实施例五中体内抗肿瘤实验。聚合ido抑制剂在b16f10携带黑素瘤c57bl/6小鼠中的抗肿瘤潜能评估（n = 3）（a）小鼠在第0、2、4、6和8天的给药示意图。dox剂量固定为5 mg/kg，1-mt剂量分别为0、5和10 mg/kg；（b）小鼠相对体重变化；（c）小鼠肿瘤相对体积的变化；图7是实施例五中体内抗肿瘤实验。crgd-npdj对荷b16f10肿瘤c57bl/6小鼠的抗肿瘤作用（n = 3）：（a）细胞接种、给药和解剖示意图，不同剂型中x:y:z为1-mt、dox、jq1的剂量（mg/kg）；（b）小鼠体重变化；（c）肿瘤体积变化；（d）单个小鼠肿瘤体积变化；图8是实施例五中体内抗肿瘤实验。crgd-npdj对b16f10荷瘤c57bl/6小鼠的抗肿瘤作用，n = 6。（a）剂量示意图；（b）小鼠体重变化；（c）小鼠肿瘤体积变化；（d）肿瘤h&e染分析；（e）b16f10荷瘤小鼠生存曲线；（f）小鼠血清trp/kyn比值。采用单因素方差分析（one way anova）评估差异的显著性，*p 《 0.05，**p 《 0.01，***p 《 0.001；图9是实施例五中体内抗肿瘤实验。给药后(第9天)对b16f10黑素瘤小鼠心、肝、脾、肺、肾进行h&e染，比例尺为50 μm；图10是实施例六中体内免疫调节作用。不同制剂小鼠第9天b16f10肿瘤的免疫组化（crt，hmgb1，pd-l1）染。比例尺:50 μm；图11是实施例六中体内免疫调节作用。不同后肿瘤微环境的体内免疫调节。（a）结束时血清中ifn-γ，（b）tnf-α和（c）tgf-β浓度；（d）流式细胞仪检测肿瘤细胞pd-l1表达；（e）肿瘤引流淋巴结中成熟的bmdc百分比；（f）流式细胞仪检测肿瘤中cd8
+ t细胞浸润情况（以cd3
+ cd45
+
细胞控门），（g）肿瘤中cd4
+ foxp3
+ treg细胞浸润百分率；（h）脾脏中骨髓源性抑制细胞（mdscs）。采用单因素方差分析（one way anova）评估差异的显著性，*p 《 0.05，**p 《 0.01，***p 《 0.001，n = 3。
具体实施方式
13.本发明还公开的聚氨基酸纳米粒的制备方法为如下步骤：（1）在氮气条件下，以单端为氨基的聚乙二醇为引发剂，通过开环聚合l-酪氨酸-n-羧基内酸酐及1-甲基-d-氨酸-n-羧基内酸酐得到一种基于聚氨基酸的大分子吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物；在氮气条件下，以丙烯酸酯-聚乙二醇-氨基为大分子引发剂，将l-酪氨酸-n-羧基内酸酐及1-甲基-d-氨酸-n-羧基内酸酐可控聚合，然后在irgacure 2959光引发剂存在下，丙烯酸酯基与含硫醇的crgd肽发生巯基点击反应，得到具有靶向作用的crgd-聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物。
14.（2）搅拌下，将一定比例的聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物或聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物与crgd-聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物的混合溶液滴加到缓冲溶液中，滴加完毕后透析得到聚氨基酸纳米粒。
15.本发明还公开了一种纳米药物及其制备方法，所述纳米药物的制备方法为：搅拌下，将式i结构的聚乙二醇-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物和式ⅱ结构的crgd-聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物与药物的混合溶液滴加到缓冲溶液中，滴加完毕后透析得到纳米药物。
16.上述技术方案中，步骤（1）中，单端为氨基的聚乙二醇、l-酪氨酸-n-羧基内酸酐、1-甲基-d-氨酸-n-羧基内酸酐的质量比为1∶0.6~1.2∶0.2~0.4，优选1∶0.95：0.25，开环聚合的温度为室温~50℃，时间为60~80小时；优选的，开环聚合在溶剂中进行，溶剂优选dmf；丙烯酸酯-聚乙二醇-氨基、l-酪氨酸-n-羧基内酸酐、1-甲基-d-氨酸-n-羧基内酸酐、crgd-sh的质量比为1∶0.6~1.2∶0.2~0.4:0.11~0.16，优选1∶0.95：0.25:0.14，开环聚合的温度为室温~50℃，时间为60~80小时，巯基点击反应冰浴下进行，时间为5~30分钟，irgacure 2959（i2959）光引发剂含量0.1~0.5% w/v；优选的，开环聚合在溶剂中进行，溶剂优选dmf。
17.本发明中，一种基于聚氨基酸的大分子吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物的制备方法如下：在氮气条件下，以单端为氨基的聚乙二醇为引发剂，通过开环聚合l-酪氨酸n-羧基内酸酐及1-甲基-d-氨酸n-羧基内酸酐得到式i聚合物聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物。
18.具有靶向作用的crgd-聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物的制备方法如下：以丙烯酸酯-聚乙二醇-氨基为大引发剂，将l-酪氨酸n-羧基内酸酐及1-甲基-d-氨酸n-羧基内酸酐可控聚合，然后在irgacure 2959光引发剂存在下，丙烯酸酯基与含硫醇的crgd肽发生巯基点击反应，得到crgd修饰的共聚物。
19.上述聚乙二醇-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物的制备方案的具体反应步骤可举例如下：使用单端为氨基的聚乙二醇（peg-nh2）作为大分子引发剂引发1-甲基-d-氨酸-n-羧酸酐（1-mt-nca）和l-酪氨酸-n-羧酸酐（tyr-nca）开环聚合（rop）制备聚乙二醇-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物。在氮气环境下，将溶解在蒸馏dmf溶解中的tyr-nca和1-mt-nca与peg-nh2的dmf溶液混合，反应三天。在过量乙醚中沉淀后，粗产物通过重新溶解在二氯甲烷中并在乙醚中沉淀三次而进一步纯化，获得的沉淀真空干燥，得到聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物。
20.上述制备方案可表示如下：上述crgd-聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物的制备方案的具体反应步骤可举例如下：
以丙烯酸酯-聚乙二醇-氨基（ac-peg-nh2）为大引发剂，将1-mt-nca和tyr-nca可控聚合，然后在irgacure 2959（i2959）光引发剂存在下，丙烯酸酯基与含硫醇的crgd肽发生巯基点击反应，得到crgd修饰的共聚物。在氮气条件下，将溶解于dmf中的crgd和i2959加入到ac-peg-b-p(tyr-co-1-mt)的dmf溶液中。混合溶液在冰浴下用uv照射。反应溶液经大量dmf透析，冰无水乙醚沉淀，真空烘箱干燥，得到crgd-聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物。
21.上述制备方案可表示如下：作为本发明的一个具体技术方案，药物为化疗药物阿霉素（dox）及bet溴结构域抑制剂jq1时，同时包载憎水小分子药物dox和jq1的纳米药物crgd-npdj是用聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）和crgd-聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）的混合溶液通过溶剂置换法制备得到。具体过程如下：在搅拌条件下，将计算量的dox溶液和jq1溶液（dmso）与按照一定比例混合的聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）和crgd-聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）的混合溶液（dmf）混合后分散在hepes缓冲液（ph 7.4）中；然后装入透析袋（mwco = 3500 da），在hepes缓冲液中透析4小时除去未载入的药物和有机溶剂，然后在pb缓冲液（ph 7.4）中透析2小时以置换缓冲液，每小时更换一次缓冲介质；最后得到纳米药物。
22.本发明进一步公开了上述基于聚氨基酸的大分子吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物及crgd-聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物在制备抗肿瘤药物载体或者抗肿瘤纳米药物中的应用；所述纳米药物在实体瘤联合免疫疗法中的应用。
23.α-甲氧基-ω-氨基-聚乙二醇（peg-nh2，m
n = 5.0 kg/mol，厦门赛诺邦格生物科技有限公司）、丙烯酸酯-聚乙二醇-氨基（ac-peg-nh2，mn=5.0 kg/mol，上海拓旸生物科技有限公司）、l-酪氨酸（tyr-oh，吉尔生化(上海)有限公司）、2-羟基-2-甲基-1-[4-（2-羟乙氧基）
mg，1.15 mmol）和1-mt-nca（61.0 mg，0.25 mmol）与peg-nh2（200.0 mg，0.04 mmol）的dmf溶液混合，37
º
c下反应三天。在过量乙醚中沉淀后，粗产物通过重新溶解在二氯甲烷中并在乙醚中沉淀三次而进一步纯化，获得的沉淀置于30
º
c下真空干燥两天，得到最终产物peg-b-p(tyr-co-1-mt)。产率：81.2%。1h nmr（400 mhz，dmso-d6，δ）：9.10（-oh），7.95（-nh-），7.59 and 7.31（-c6h
4 of 1-mt），7.11（pyrrole proton of 1-mt），6.94 and 6.57（-c6h
4 of tyr），4.44 and 4.15（-cochnh-），3.52（-ch2ch2o-,
ꢀ‑
nch3），2.82-2.63（-coch(nh)ch
2-）。
[0026]
根据上述方法，以丙烯酸酯-聚乙二醇-氨基（ac-peg-nh2）为大引发剂，将1-mt-nca和tyr-nca可控聚合，得到ac-peg-b-p(tyr-co-1-mt)；然后在irgacure 2959（i2959）光引发剂存在下，丙烯酸酯基与含硫醇的crgd肽发生巯基点击反应，得到crgd修饰的共聚物crgd-peg-b-p(tyr-co-1-mt)。在氮气条件下，将溶解于dmf中的crgd（12.8 mg，22.0 nmol）和i2959（4.0 mg, 0.2% w/v）加入到ac-peg-b-p(tyr-co-1-mt)（200 mg，18.3 nmol）的dmf溶液中。混合溶液在冰浴下用uv（320-390 nm，50 mw/cm2）照射15分钟。反应溶液经大量dmf透析（mwco：3.5 kda），冰无水乙醚沉淀，真空烘箱干燥24小时，产率：89.0%。9,10-菲醌法测定crgd在crgd-peg-b-p(tyr-co-1-mt)中的接枝效率为81.8%。
[0027]a由1h nmr测得；b由gpc测得（流动相：dmf；流速：0.8 ml/min；温度：40 ℃；标样：聚甲基丙烯酸甲酯）。
[0028]
通过改变nca进料比可以容易地调节聚合物中tyr和1-mt的组成比，结果列于表1中。图1是实施例一中聚合物的核磁氢谱图（400 mhz, dmso-d6）。（a）1mt-nca单体的1h nmr光谱；（b）peg-b-p(tyr-co-1-mt)聚合物的1h nmr光谱（表1，entry 4）；（c）ac-peg-b-p(tyr-co-1-mt)聚合物的1h nmr光谱（表1，entry 5）；（d）crgd-peg-b-p(tyr-co-1-mt)聚合物的1h nmr光谱。
[0029]
仅采用l-酪氨酸-n-羧酸酐（tyr-nca），开环得到仅含有tyr的聚合物。
[0030]
实施例二纳米粒的制备与表征通过溶剂置换法制备crgd修饰的纳米粒子（crgd-np）。简而言之，将溶解在dmf中的peg-b-p(tyr-co-1-mt)（100 mg/ml，表1第4组）和crgd-peg-b-p(tyr-co-1-mt)（100 mg/ml）以如下摩尔比混合：10:0、9:1、8:2和7:3。然后，将10 μl混合的聚合物溶液滴加到990 μl的hepes缓冲液（5 mm，ph 7.4）中。在hepes缓冲液中连续透析（mwco：3.5 kda）4小时，然后在pb缓冲液（10 mm，ph 7.4）中再透析2小时，每小时更新一次透析介质，得到crgd-np，无靶向的为np，表征见表2。
[0031]
参考上述方法，通过在与hepes缓冲液混合之前将dox和jq1添加到聚合物溶液中获得crgd-npdj纳米药物。简而言之，将聚合物dmf溶液（100 mg/ml）与计算量的dox（10 mg/ml）和jq1（20 mg/ml）充分混合后，将10 μl混合的溶液滴加到990 μl的hepes缓冲液（5 mm，ph 7.4）中，在hepes缓冲液中连续透析（mwco：3.5 kda）4小时，然后在pb缓冲液（10 mm，ph 7.4）中再透析2小时，每小时更新一次透析介质，得到纳米药物crgd-npdj。如果仅采用一种药物，则分别得到npd/crgd-npd（载dox）、npj/crgd-npj（载jq1）；没有靶向的则为npdj（载dox与jq1）。
[0032]
封装的dox和jq1分别使用紫外分光光度计（uv）在吸光度509 nm处和高效液相谱（hplc）在吸光度267 nm处的进行定量。载药量（dlc）和载药效率（dle）根据以下公式计算：dlc（wt.%）= 装载药物质量/（装载药物质量+crgd-np）
×
100dle（%）= 装载药物质量/投入药物总质量
×
100考虑到在实际应用中，纳米药物会面临高倍稀释以及血清掺杂的情况，因此利用dls来检测在这两种情况下纳米颗粒的粒径变化。首先，将纳米药物稀释到一系列不同浓度（0.01-1.0 mg/ml），观察纳米药物粒径变化。其次，将纳米药物（1.0 mg/ml）分散在含有10%胎牛血清（fbs）的pb溶液中，最终纳米药物浓度为0.1 mg/ml，并置于摇床（200转，37℃）中24小时，定点监测纳米药物粒径变化。
[0033]
蛋白酶k（pk）浓度为12.0 u/ml时，通过dls监测粒径变化研究crgd-npdj的酶促反应。在两种不同的介质中进行体外药物释放：（1）pb缓冲液（5.0 mm，ph 7.4）；（2）含有12.0 u/ml pk的pb（5.0 mm，ph 7.4）缓冲液。将装有0.5 ml crgd-npdj的释放袋（mwco：30 kda）置于25 ml释放介质中。在预先设定的时间点，取出5.0 ml释放介质并补充相应体积的新鲜pb。将样品冻干并用1.0 ml dmso复溶，得到浓缩药物溶液，其中dox通过荧光分光光度计测量（激发波长为485 nm，发射波长为560 nm）定量，jq1通过hplc测量。实验平行进行3次，显示的最终值是3次实验（n = 3）的平均值
±
标准偏差（sd）。药物的累积释放量按下式计算：式中：er：dox或jq1的累计释放量，%；ve：介质（pb）的置换体积，5.0 ml；v0：释放介质总的体积，25 ml；ci：第i次取样的时候释放介质中dox或jq1的浓度，μg/ml；m
drug
：用于释放的crgd-npdj中dox或jq1的总量，μg；n：置换介质的次数。
[0034]a由dls（1.0 mg/ml，25 ℃）测定；b在pb溶液中通过电泳测定（1.0 mg/ml，25 ℃）。
[0035]a通过uv-vis测量确定；b通过hplc测量确定；c由dls（1.0 mg/ml，25 ℃）测定；d在pb溶液中通过电泳测定（1.0 mg/ml，25 ℃）。
[0036]adox通过uv-vis测量确定，jq1通过hplc测量确定；b由dls（1.0 mg/ml，25 ℃）测定。
[0037]
使用溶剂置换法通过改变peg-b-p(tyr-co-1-mt)和crgd-peg-b-p(tyr-co-1-mt)摩尔比（9:1、8:2、7:3）开发了具有不同靶向配体密度的crgd修饰纳米粒子（crgd-np）。与仅由peg-b-p(tyr-co-1-mt)形成的没有crgd修饰的np相比，crgd-np的尺寸略大，约为75 nm（表2）。通过在与hepes缓冲溶液混合之前将计算量的药物添加到聚合物溶液中来完成药物装载。crgd-npdj中封装的dox和jq1的量分别通过uv在509 nm处的吸光值和hplc在267 nm处的积分面积测定。当dox和jq1的理论dlc均为10 wt.%时，crgd-np为dox和jq1提供了超过74%和82%的良好载药效率，并且crgd密度对载药能力的影响很小（表3）。dox和jq1在crgd-npdj中的载药效率随着jq1的理论载药量的增加而提高。例如，当jq1的理论载药量增加到20 wt.%时，dox和jq1的dle分别达到约79%和90%（表3），表明jq1可以提供额外的相互作用，例如与载体及dox之间的π-π堆积作用以增加载药量。该假设可以通过负载单药的纳米粒子（npd，npj）较低的载药效率（表4）来验证，另外仅由两种药物组成的纳米粒子在透析过程表现出显著的药物泄漏和减少的颗粒数。值得注意的是，高载药量有助于优化crgd-npdj中两
种药物的量和比例。
[0038]
不同crgd密度的crgd-npdj无论载药量和dox/jq1比如何，均呈现＜100 nm的尺寸、pdi低于0.16的单分散性和轻微的负电荷（表3）。tem图像显示crgd-npdj具有球形形态（图2a，表3第4组）。本发明crgd-npdj在高倍稀释和10%胎牛血清中都表现出令人满意的稳定性，并且crgd-npdj在4 ℃条件下放置30天仍保持良好的尺寸和粒径分布（图2b）。在pk存在下，crgd-npdj在6小时内表现出明显的肿胀（图2c）并引发药物释放，其中约70%的dox和jq1在48小时内释放（图2d），相反，在没有pk的释放介质中，仅不到20%的dox和jq1从crgd-npdj中释放出来。此外，在含有60 u/ml pk条件下测试crgd-np的降解行为，在72小时后，相比于没有pk的纳米粒溶液，40%的1-mt释放出来，证实了聚合物吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂能在酶的作用下降解并释放出1-mt（图2e-f）。
[0039]
实施例三细胞内吞实验、体外细胞毒性实验、ido抑制实验通过cy5-nhs与聚合物末端氨基的酰胺化反应制备peg-b-p(tyr-co-1-mt)-cy5用于制备内吞实验的cy5修饰的纳米粒子（cy5-crgd-np）。b16f10细胞按2
×
105个细胞/孔的密度铺在6孔板中培养24小时，每孔与100 μl的cy5-crgd-np（1.0 mg/ml）共孵育。cy5-crgd-np的crgd密度分别为10 mol.%、20 mol.%和30 mol.%，cy5标记聚合物的浓度为2.5 μg/ml。孵育4小时后，除去培养基。将细胞用pbs洗涤3次，胰蛋白酶消化，并以1000 rpm转速离心3分钟。用pbs清洗2次后，将收集的细胞分散在400 μl pbs中，用bd facs verse
™
流式细胞仪（fcm）检测其cy5荧光强度（cy5-fi）。
[0040]
crgd-npdj对b16f10细胞的杀伤能力通过二甲基噻唑-二苯基溴化四唑（mtt）法进行评估。将细胞以5
ꢀ×ꢀ
103细胞/孔的密度在96孔板中用dmem培养基培养24小时，然后加入不同的不同浓度的样品。孵育4小时后，更新新鲜培养基继续孵育44小时。然后，将上述培养基用10 μl mtt（0.5 mg/ml）处理4小时，除去培养及后加入150 μl dmso溶解活细胞产生的紫甲臜晶体。用酶标仪获取甲臜在570 nm处的吸光度，与pbs组比较获得活细胞百分比，以确定细胞活力。空白crgd-np在b16f10和l929细胞中的细胞毒性进行了类似的评估，细胞与纳米颗粒共孵育48小时。dox与jq1的协同指数（ci）按下式计算：式中：ci：协同指数；(ic 50 comb
) dox
：联合制剂中dox的半致死浓度；(ic 50 alone
) dox
：游离dox的半致死浓度；(ic 50 comb
) jq1
：联合制剂中jq1的半致死浓度；(ic 50 alone
) jq1
：游离jq1的半致死浓度。ci 》 1和ci 《 1分别代表拮抗作用和协同作用。
[0041]
将接种在96孔板（5
ꢀ×ꢀ
103细胞/孔）中的b16f10细胞在dmem培养基中培养24小时。在添加重组人干扰素-γ（100 ng/ml）用于诱导吲哚胺2,3-双加氧酶后，用不同浓度的1-mt、np或crgd-np处理细胞。培养48小时后，取150 μl上清液，与15 μl 30 wt.%三在摇床（50
ꢀ°
c，100 rpm）上混合30分钟，沉淀蛋白质。在3000 g转速下离心10分钟后，将上清液（100 μl）与ehrlich试剂（100 μl）混合，并利用酶标仪在480 nm处测量kyn/ehrlich试剂复合物的吸光度（od
480
）。通过在0.1-100 μg/ml的kyn浓度范围内测量dmem中kyn/ehrlich试剂复合物的od
480
来建立kyn的标准曲线。kyn的抑制率通过（od
480 pbs-od
480 sample
）/ od
480 pbs
确定。
[0042]
用cy5标记的纳米颗粒由掺杂cy5-peg-b-p(tyr-co-1-mt)聚合物构成，用于评估细胞摄取行为。与非靶向组相比，crgd修饰的纳米粒子呈现出更高的细胞摄取，并且crgd密度从10 mol.%增加到30 mol.%导致内吞增强（图3a）。具有20 mol.% crgd（20% crgd-np）的纳米粒子的荧光强度比没有crgd修饰的np高3.7倍，进一步增加crgd的量至30 mol.%仅略有改善其内吞量。crgd可以结合在许多肿瘤细胞上过表达的αvβ3和αvβ5整合素，并已被大量用于增强各种纳米系统的内化。
[0043]
游离1-mt在正常细胞和肿瘤细胞中表现出可忽略不计的毒性。在l929成纤维细胞和b16f10黑素瘤细胞中，含有1-mt的空白np和crgd-np在浓度高达2.0 mg/ml（200 μg /ml 1-mt）时提供了约85%的高细胞活力，验证了他们良好的生物相容性（图3b-c）。聚合物载体为dox和jq1提供了更高得细胞杀伤作用（图3d，表5）。利用crgd靶向配体增强的细胞摄取，对b16f10细胞crgd-npdj显示出比npdj更高的细胞毒性（图4a，表5）。具有20 mol.%和30 mol.% crgd的crgd-npdj在药物质量比为1:1时表现出相当的细胞毒性，其ic
50
约为0.3 μg/ml，比npdj低3倍。crgd-npdj在dox/jq1比例为2:1、1:1、1:2 和1:4时的抗增殖作用如图4b所示，dox与jq1的比例显着影响crgd-npdj的细胞毒性，降低dox/jq1比例导致b16f10细胞的细胞活力降低。例如，对于dox/jq1质量比为1:2的20% crgd-npdj比2:1的纳米药物的其dox和jq1得ic
50
分别低了8倍和2倍（表5）。尽管具有不同dox/jq1比的crgd-npdj都显示出相对较低的协同指数（≤0.51），但降低dox/jq1质量比提供了更好的协同效应。通过检测对kyn的抑制作用，可以反映吲哚胺2,3-双加氧酶药物的抑制能力。np和crgd-np均在b16f10细胞中表现出kyn抑制作用，且抑制率随着浓度的升高而增加（图4c），表明本发明形成的纳米颗粒可以成为有效的kyn抑制剂。
[0044]
实施例四免疫原性细胞死亡（icd）及pd-l1表达
b16f10细胞（2
ꢀ×ꢀ
105细胞/孔）接种于24孔板中过夜，随后每孔加入100 μl样品（dox浓度为0.3 μg/ml）培养24小时。根据说明使用增强atp试剂盒测定上清培养基中atp浓度。细胞消化后，用pbs洗涤。与抗crt抗体（兔抗）孵育60分钟。再次用pbs洗涤细胞三次，然后用alexa fluor-633抗体在4 ℃、黑暗条件下孵育30分钟。用pbs洗涤后，使用fcm检测crt
+
细胞。以2
ꢀ×ꢀ
105细胞/孔密度将b16f10细胞接种在12孔板中24小时，然后用100μl jq1浓度为0.3 μg/ml的样品处理24小时。用pbs洗涤细胞三次，用胰蛋白酶消化，并以1000 rpm的转速离心3分钟。用pbs洗涤两次后，将细胞稀释至适当浓度（50 μl），与抗小鼠pd-l1(b7-h1)抗体（1/500，50 μl）一起在4 ℃避光孵育20分钟。fcm用于染细胞的测试。
[0045]
dox这样的化疗药物通过诱导免疫原性细胞死亡来改善肿瘤微环境。增强型atp检测试剂盒分析显示用dox、crgd-npd和crgd-npdj处理后的b16f10细胞atp释放量均有所提高，其中crgd-npdj组（表5第11组）相比于pbs组展示出超过2.9倍的释放量（图5a）。从fcm测试结果可以看出，与pbs组约11.6%的细胞表达肿瘤相关抗原crt（crt
+ 细胞）形成鲜明对比的是crgd-npdj诱导的crt
+
细胞数量最多（38.7%）（图5b-c）。因此，crgd-npdj是诱导免疫原性细胞死亡和促进损伤相关分子模式（damps）释放的有效选择。
[0046]
dox还会上调肿瘤细胞表面pd-l1表达，从而通过pd-1/pd-l1通路使t细胞失活。图5d所示，dox和crgd-npd能上调b16f10细胞表面的pd-l1表达。相比之下，用crgd-npdj处理的细胞显示pd-l1表达显着降低，表达水平比crgd-npd组低4.8倍（图5e）。crgd-npdj诱导的pd-l1表达显着降低可能是由于jq1可以抑制癌基因c-myc的转录，从而下调癌细胞表面的pd-l1蛋白。
[0047]
实施例五体内抗肿瘤实验所有实验动物操作均按照《苏州大学实验动物护理和使用指南》进行，并经苏州大学动物伦理委员会批准。c57bl/6小鼠右侧皮下注射50 μl b16f10细胞（1
×
10
5 细胞/只）和基质胶（40%，v/v）建立b16f10黑素瘤皮下模型，评价纳米制剂的体内抗肿瘤作用。为了评估聚合物吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂的抑瘤功效，当肿瘤体积达到80 mm3时（定义为第0天），将荷瘤小鼠随机分为不同组并注射以下制剂（n = 3）：（1）pbs；（2）npd w/o 1-mt（0:5）；（3）npd（5:5）；（4）npd（10:5），其中x:y分别表示1-mt、dox的剂量（mg/kg），所有制剂每两天注射一次（即，第0、2、4、6和8天）。使用游标卡尺每两或三天测量一次肿瘤的长度（l）和宽度（w），从而计算出肿瘤体积（v = 0.5
×
l
×
w2）和相对肿瘤体积（v/v0，v0为第0天的肿瘤体积）。每两或三天记录一次小鼠的体重和相对体重（m/m0，其中m0代表第0天的小鼠体重）。一旦小鼠相对体重下降超过20%或肿瘤体积超过2000 mm3，就判定小鼠死亡。
[0048]
为了评估crgd-npdj（20%靶向）的体内抗肿瘤作用，荷瘤小鼠经尾静脉注射以下制剂（n = 7）：（1）pbs；（2）游离药物（20:5:10）溶于10% dmso + 40% peg300 + 5%吐温-80 + 45%生理盐水；（3）npd（10:5:0）；（4）npdj（10:5:5）；（5）crgd-npdj（10:5:5）；（6）crgd-npdj（10:5:10）；（7）crgd-npdj（20:5:5）；（8）crgd-npdj（20:5:10），其中x:y:z分别表示1-mt、dox、jq1的用量（mg/kg）。游离药物毒性大，于第0、2、4、8、12天注射，纳米药物每2/3天注射一次，共5次。用游标卡尺每隔2~3天测量肿瘤的长（l）和宽（w），计算肿瘤体积（v = 0.5
ꢀ×ꢀ
l
ꢀ×ꢀ
w2）。每隔两天记录小鼠的体重。当小鼠的相对体重减轻超过20%或肿瘤体积超过2000 mm3时判定其死亡。记录死亡时间点，确定各实验组的中位生存时间。第9天，每组随机选取1只小鼠采集主要器官和肿瘤，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋进行染分析。利用苏木精-伊红
（h&e）研究纳米药物对主要器官和肿瘤的毒性。
[0049]
以peg-ptyr形成的不含1-mt的dox纳米颗粒（npd w/o 1-mt）为对照，在dox剂量为5 mg/kg时，npd的抑瘤效果明显优于npd w/o 1-mt组，在实验期间，npd组2/3的小鼠肿瘤生长曲线非常缓慢（图6）。虽然1-mt剂量从5 mg/kg到10 mg/kg的变化显示效果几乎没有提高，但基于多肽的聚合吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂确实显示出增强的抗肿瘤疗效。
[0050]
在b16f10荷瘤小鼠体内检测crgd-npdj的抗肿瘤作用，给药方案见图7a。不同药物比例和剂量的crgd-npdj处理小鼠的体重均略有增加（图7b），h&e染显示心、肝、脾、肺、肾无明显损伤（图9），验证了纳米药物的良好安全性。与肿瘤快速生长的pbs组相比，npdj和crgd-npdj均能明显抑制肿瘤生长，且crgd-npdj的疗效更好（图7c-d）。在纳米药物中加入jq1，无论有无crgd，都能显著降低npdj的肿瘤生长。此外，通过提高jq1和1-mt的剂量可以进一步提高效果，其中crgd-npdj中1-mt从10增加到20 mg/kg，jq1从5增加到10 mg/kg，都显示出对肿瘤生长的抑制效果更好。
[0051]
根据图8a所示的剂量方案，进一步评估了更高剂量的crgd-npdj的抗肿瘤活性。值得注意的是，在相同的剂量方案（20 mg 1-mt/kg，5 mg dox/kg，10 mg jq1/kg，每两天一次）导致第4天体重减轻20%以上（图8b）。随后每4天给药一次，与pbs组相比，肿瘤生长较慢（图8c）。相比之下，crgd-npdj几乎完全抑制肿瘤生长，具有更好的抗肿瘤活性。h&e染分析显示，crgd-npdj诱导细胞核缩小，坏死面积最大，游离药物使细胞形态明显变形，与pbs组清晰完整的细胞结构形成鲜明对比（图8d）。此外，与pbs组和游离药物组分别为15天和20天的中位生存期相比，crgd-npdj组小鼠存活率延长，中位生存时间为31天（图8e）。特别是crgd-npdj组的一只小鼠在整个实验期间存活下来，并表现出完全的肿瘤消除。此外，游离药物和crgd-npdj处理的小鼠trp/kyn比值显著升高，其中crgd-npdj诱导的trp/kyn比值（20:5:10）比pbs组高出2倍以上（图8f）。据报道，1-mt可以缓解trp的消耗和kyn的富集。本实验中，经crgd-npdj处理的小鼠trp/kyn比值明显提高，其中crgd-npdj（20:5:10）诱导的trp/kyn比值比pbs组高2.1倍（图8f）。
[0052]
实施例七体内免疫调节取小鼠眶血，装入血清分离管。4℃，1000 g离心20分钟，仔细收集上清。取150 μl上清液与30 wt.%三溶液15 μl混合后，置于50 ℃摇床（100转）上30分钟，沉淀血清中的蛋白。1000 g离心20分钟收集上清，hplc测定trp和kyn浓度。根据厂家说明书，采用elisa试剂盒检测小鼠外周血中tnf-α、ifn-γ和tgf-β等细胞因子水平。然后处死小鼠，收集肿瘤、脾脏和淋巴结，在含1%胎牛血清的pbs中匀浆，获得单细胞悬液。单细胞悬液与相应抗体在4
º
c黑暗中孵育20分钟。percp/cy5.5-αcd45、apc-αcd3、pe-cd4和fitc-αcd8，percp/cy5.5-αcd45、fitc-αcd3、pe-cd4α和alexa 647-αfoxp3，percp/cy5.5-αcd45、fitc-αcd11c、apc-αcd80和pe-αcd86及apc-αcd45、fitc-αcd11b和pe/cy7-αgr-1分别用于t细胞、treg细胞、dcs及mdsc染，抗小鼠pd-l1(b7-h1)抗体用于pd-l1
+
细胞染。fcm用于染细胞的测试，并使用flowjo v10软件分析数据。采用免疫组化（ihc）染分析肿瘤细胞表面crt、hmgb-1、pd-l1的表达。用倒置荧光显微镜获得相应的图像。
[0053]
结束后，取血、肿瘤、脾脏和淋巴结，评价不同制剂在肿瘤微环境中的免疫调节作用。免疫组化（ihc）分析显示，同时给予游离药物和crgd-npdj（表5第11组）处理的小鼠，包括hmgb1和crt在内的damps释放明显升高，其中crgd-npdj显示的hmgb1和crt比游离
药物更多（图10）。hmgb1和crt的明显升高表明，纳米药物在肿瘤部位引起了显著的icd，这被认为是刺激机体免疫的关键策略。此外，与pbs组相比，dox负载纳米药物的血清中促炎细胞因子干扰素γ（ifn-γ）的分泌显著增加，crgd装饰和添加jq1有利于分泌（图11a）。据报道，ifn-γ通过调节抗原呈递、促进炎症和趋化信号、活化和极化反应白细胞，以及直接的抗增殖和抗血管生成作用，促进抗肿瘤免疫。npd、npdj和crgd-npdj组肿瘤部位肿瘤坏死因子-α（tnf-α）的表达均显著高于pbs组，其中增加jq1或1-mt剂量肿瘤部位tnf-α的表达显著升高（图11b）。例如，crgd-npdj（10:5:10）和crgd-npdj（20:5:5）的tnf-α表达量是pbs组的2.5倍左右。此外，不同剂量的crgd-npdj可明显缓解肿瘤部位转化生长因子-β（tgf-β）的释放（图11c）。越来越多的研究表明，阻断tgf-β信号通路可以缓解treg介导的免疫抑制，增强t细胞毒性，促进t细胞向肿瘤中心浸润，产生较强的抗肿瘤免疫。
[0054]
如图11d所示，npd引起肿瘤中pd-l1的明显上调，可能是由于dox激活的ifn-γ分泌增加所致。通过激活janus激酶（jak）/信号转导和转录激活因子（stat）信号，ifn-γ诱导4t1细胞、mc-38细胞、b16f10细胞等明显上调pd-l1。jq1的引入大大降低了pd-l1的表达，其中npdj的pd-l1表达显着低于npd（图11d）。此外，纳米药物中的crgd修饰和jq1剂量增加增强了pd-l1下调，jq1剂量为10 mg/kg的crgd-npdj呈现的pd-l1高表达细胞比pbs组少约5.4倍（图11d）。ihc分析进一步表明，用更高剂量的1-mt和jq1的crgd-npdj的肿瘤显示出非常有限的pd-l1阳性细胞（图10）。
[0055]
单细胞悬液分析显示，crgd-npdj促进了淋巴结树突状细胞的成熟，并在肿瘤部位募集了显着的细胞毒性t淋巴细胞浸润，并且1-mt或jq1剂量的增加产生了很多更多的cd8
+
细胞（图11e-f）。不足为奇的是，所有具有1-mt成分的纳米药物都显示treg大大减少，而增加1-mt剂量则提供了更少的treg（图11g）。特别是，1-mt剂量为20 mg/kg的crgd-npdj表现出约3%的treg，比pbs组低约13倍。此外，所有纳米制剂都能减少脾脏中的髓源性抑制细胞（mdsc），而具有更多jq1或1-mt剂量的crgd-npdj导致更少的mdsc（图11h）。mdsc可以通过控制t细胞反应和抑制炎症来抑制免疫细胞反应。因此，crgd-npdj结合dox、jq1和1-mt可以有效调节免疫相关细胞因子的浓度，下调pd-l1表达，减少treg细胞和mdsc以及提高dc成熟和cd8
+
的浸润，为肿瘤微环境正常化提供了有效的策略。
[0056]
本发明公开了一种基于聚氨基酸的大分子吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂，具体为聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d氨酸）共聚物及具有靶向作用的crgd-聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d氨酸）共聚物，构建了包载抗肿瘤药物的聚氨基酸纳米药物用于癌症的联合免疫。本发明基于聚氨基酸的大分子吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d氨酸）共聚物及具有靶向作用的crgd-聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d氨酸）共聚物制备简单、重复可控；设计构建的聚氨基酸纳米粒具有粒径可控（60~95 nm）、高稳定性和酶响应的特性，同时，还可通过憎水作用和π-π堆积作用，实现对抗肿瘤小分子药物的高效包载。体内结果表明，共包载化疗药物阿霉素和bet溴结构域抑制剂jq1的聚氨基酸纳米药物crgd-npdj能显著增加荷b16f10肿瘤的c57bl/6小鼠肿瘤部位cd8
+ t细胞，促进树突细胞成熟，提高细胞因子（ifn-γ、tnf-α等）释放；同时减少调节性t细胞并下调肿瘤细胞表面的pd-l1表达，从而产生显著的免疫级联反应，大大改善肿瘤微环境。总之，基于聚氨基酸的大分子吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂聚乙二醇-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d氨酸）共聚物及具有靶向作用的crgd-聚乙二醇-b-聚（l-酪氨
酸-co-1-甲基-d氨酸）共聚物制备简单，能用于构建多功能纳米药物，实现对癌症的安全有效联合免疫。

技术特征：

1.一种基于聚氨基酸的大分子吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂，其特征在于，所述基于聚氨基酸的大分子吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂为亲水链段-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物和/或靶向分子-亲水链段-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物。2.根据权利要求1所述基于聚氨基酸的大分子吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂，其特征在于，亲水链段为聚乙二醇链段；靶向分子为crgd。3.权利要求1所述基于聚氨基酸的大分子吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂的制备方法，其特征在于，以亲水聚合物为引发剂，通过开环聚合l-酪氨酸-n-羧基内酸酐及1-甲基-d-氨酸-n-羧基内酸酐得到亲水链段-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物；以亲水聚合物为引发剂，通过开环聚合l-酪氨酸-n-羧基内酸酐及1-甲基-d-氨酸-n-羧基内酸酐得到亲水链段-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物，然后与靶向分子反应，得到靶向分子-亲水链段-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物。4.一种聚氨基酸纳米粒，其特征在于，由权利要求1所述基于聚氨基酸的大分子吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂自组装得到。5.权利要求4所述聚氨基酸纳米粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将亲水链段-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物溶液滴加到缓冲溶液中，滴加完毕后透析得到聚氨基酸纳米粒；或者将亲水链段-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物与靶向分子-亲水链段-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物的混合溶液滴加到缓冲溶液中，滴加完毕后透析得到聚氨基酸纳米粒。6.一种基于聚氨基酸的纳米药物，其特征在于，由权利要求1所述基于聚氨基酸的大分子吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂装载药物得到。7.权利要求6所述基于聚氨基酸的纳米药物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将亲水链段-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物溶液与药物溶液滴加到缓冲溶液中，滴加完毕后透析得到基于聚氨基酸的纳米药物；或者将亲水链段-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物与靶向分子-亲水链段-b-聚（l-酪氨酸-co-1-甲基-d-氨酸）共聚物的混合溶液与药物溶液滴加到缓冲溶液中，滴加完毕后透析得到基于聚氨基酸的纳米药物。8.权利要求1所述基于聚氨基酸的大分子吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂或者权利要求4所述聚氨基酸纳米粒在制备抗肿瘤纳米药物或吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂中的应用。9.权利要求6所述基于聚氨基酸的纳米药物在制备联合免疫药物中的应用。10.权利要求1所述基于聚氨基酸的大分子吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂或者权利要求4所述聚氨基酸纳米粒在制备提高化疗药物效果的药物中的应用。

技术总结

本发明公开了一种基于聚氨基酸的大分子吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂，具体为聚乙二醇-b-聚（L-酪氨酸-co-1-甲基-D氨酸）共聚物及具有靶向作用的cRGD-聚乙二醇-b-聚（L-酪氨酸-co-1-甲基-D氨酸）共聚物，构建了包载抗肿瘤药物的聚氨基酸纳米药物用于癌症的联合免疫。本发明共聚物制备简单、重复可控；设计构建的聚氨基酸纳米粒具有粒径可控、高稳定性和酶响应的特性，同时，还可通过憎水作用和π-π堆积作用，实现对抗肿瘤小分子药物的高效包载，能用于构建多功能纳米药物，实现对癌症的安全有效联合免疫。症的安全有效联合免疫。症的安全有效联合免疫。