生物相容性材料及其制备和使用方法与流程

生物相容性材料及其制备和使用方法
1.化学交联聚合物-聚合物水凝胶是通过将一种聚合物与另一种聚合物交联而形成的。聚合物通常用反应性基团修饰，并通过化学反应交联。
2.交联主要有两种类型。一种是用小分子交联剂将聚合物交联。但小分子可能对人体有毒，并可能引起不良反应，因此在许多场合不适合。另一种交联是在不同的聚合物上接枝反应性基团，并且接枝了不同反应性基团的聚合物可以反应并形成水凝胶。这种类型的交联能够生成所需性质的水凝胶，例如低机械强度的水凝胶。以往的研究表明，通过一种或多种大回转半径(rg)、大特性粘度([η])或高分子量(mw)的反应性聚合物的反应可以制备低机械强度的水凝胶。
[0003]
因此，需要用产品制造所需的适当稳定的聚合物生成具有所需性质的水凝胶。

技术实现要素：

[0004]
本公开提供了包含能够形成水凝胶的聚合物(例如生物相容性聚合物)的组合物及其制备和使用方法。例如，所述组合物可包含至少一种第一聚合物和至少一种第二聚合物，其中第一聚合物在所述组合物中可具有至少500ml/g的特性粘度[η]，而第二聚合物可具有低于第一聚合物且小于1800ml/g(例如，通过乌氏粘度计测量)的特性粘度[η]。组合物中第一聚合物的浓度最多可为约5mg/ml。第一聚合物和第二聚合物在组合物中是稳定的，可长期储存(例如，24小时或更长时间)以进行适当的质量控制测试和运输。组合物以及其中的聚合物可用于形成可制造的水凝胶产品。由第一聚合物和/或第二聚合物形成的水凝胶可以封装生物活性剂(例如，药物)。生物活性剂可从水凝胶中累积释放。
[0005]
此外，本公开提供了一种由本公开的聚合物形成的水凝胶。在某些情况下，水凝胶在g’值相对较低时可能是粘弹性固体，并且与g”相比具有更高的g’。在某些情况下，水凝胶在较低的应力水平下可能相对更有弹性，但在较高的应力水平下相对更有粘性。在某些特定情况下，在低应力下具有高弹性的水凝胶可能不一定对应于在高应力下具有高弹性。在某些情况下，水凝胶在低剪切速率下粘度较高，但在高剪切速率下粘度较低。因此，本公开的水凝胶在不同条件(如应变、剪切速率、频率)下的机械性能(如弹性行为)可以调节。
[0006]
在一些实施方案中，本公开的第一聚合物本身不交联，并且第二聚合物本身不交联。根据本公开形成的水凝胶可以具有相对低的g’(例如，g’小于约5pa)，与g”相比更高的g’(例如g”/g’《1)，同时具有相对较大的屈服应变(例如，≥10％)。本公开的水凝胶在高剪切速率下可以具有低粘度(例如，粘度不超过约0.5pa
·
s)，这表明它可能很容易在很小的力的帮助下散布在表面上。
[0007]
在一个方面，本公开提供了一种组合物，其包含至少一种具有第一反应性基团的第一聚合物和至少一种具有第二反应性基团的第二聚合物，其中所述第一聚合物具有至少500ml/g的特性粘度[η]，并且所述第二聚合物具有低于所述第一聚合物并且小于1800ml/g的特性粘度[η]，并且所述组合物中的所述第一聚合物的浓度至多为约5mg/ml。
[0008]
在一些实施方案中，所述第一聚合物能够与所述第二聚合物反应以形成水凝胶。
[0009]
在一些实施方案中，所述第一聚合物和/或所述第二聚合物是亲水的和/或水溶性
的。
[0010]
在一些实施方案中，所述第一聚合物和/或所述第二聚合物独立地选自由多糖、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、弹性蛋白、胶原蛋白、聚乙二醇、其衍生物及其任何组合组成的组。
[0011]
在一些实施方案中，所述第一聚合物和/或所述第二聚合物独立地选自由透明质酸、瓜尔胶、淀粉、壳聚糖、硫酸软骨素、藻酸盐、羧甲基纤维素、葡聚糖、其衍生物及其任何组合组成的组。
[0012]
在一些实施方案中，所述第一聚合物和/或所述第二聚合物独立地选自由透明质酸、葡聚糖、其衍生物及其任何组合组成的组。
[0013]
在一些实施方案中，所述第一聚合物包含第一聚合物衍生物，所述第一聚合物衍生物包含第一反应性基团，并且所述第一聚合物衍生物是亲电子的。
[0014]
在一些实施方案中，所述第一反应性基团选自由乙烯基、丙烯酰基、硫醇、烯烃、硫醇酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、卤代烷、磺酰卤、环氧化物、亚胺酯、氟苯基酯、碳酸酯、碳二亚胺、二硫化物、氮丙啶及其任何组合组成的组。
[0015]
在一些实施方案中，所述第一反应性基团选自乙烯基砜、马来酰亚胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、环氧化物及其任何组合。
[0016]
在一些实施方案中，所述第二聚合物包含第二聚合物衍生物，所述第二聚合物衍生物包含第二反应性基团，并且所述第二聚合物衍生物是亲核的。
[0017]
在一些实施方案中，所述第二反应性基团选自由硫醇、胺、叠氮化物、酰肼、二烯、肼、羟胺及其任何组合组成的组。
[0018]
在一些实施方案中，所述第一聚合物具有约500,000至约5,500,000道尔顿的分子量。
[0019]
在一些实施方案中，所述第二聚合物具有约3,000至约800,000道尔顿的分子量。
[0020]
在一些实施方案中，所述组合物中所述第一聚合物和所述第二聚合物之间的分子量(mw)比为约500:1至约1.5:1。
[0021]
在一些实施方案中，所述组合物中所述第一聚合物和所述第二聚合物之间的回转半径(rg)比为约150:1至约1:1。
[0022]
在一些实施方案中，所述组合物中所述第一聚合物和所述第二聚合物之间的质量比为约20:1至约1:20。
[0023]
在一些实施方案中，所述组合物中所述第一聚合物和所述第二聚合物之间的摩尔比为约4:1至约1:500。
[0024]
在一些实施方案中，所述第一聚合物可以具有约500ml/g至约5000ml/g的特性粘度[η]。
[0025]
在一些实施方案中，所述第二聚合物可以具有约5ml/g至约1800ml/g的特性粘度[η]。
[0026]
在一些实施方案中，所述组合物中所述第一聚合物和所述第二聚合物的特性粘度之间的比率为约500:1至约1:1。
[0027]
在一些实施方案中，所述衍生物具有约3％至约50％的平均修饰度(dm)。
[0028]
在一些实施方案中，所述第一聚合物衍生物具有第一dm，所述第二聚合物衍生物
具有第二dm，并且所述第一dm与所述第二dm之间的比率为约20:1至约1:20。
[0029]
在一些实施方案中，所述第一聚合物衍生物是用一个或多个乙烯基砜基团修饰的透明质酸衍生物、用一个或多个马来酰亚胺基团修饰的透明质酸衍生物、或其组合，并且所述第二聚合物衍生物是用一个或多个硫醇基团修饰的葡聚糖衍生物、用一个或多个硫醇基团修饰的透明质酸衍生物、用一个或多个硫醇基团修饰的聚乙二醇衍生物、或其组合。
[0030]
在一些实施方案中，所述第一聚合物和/或所述第二聚合物包含在形成的水凝胶形式的所述组合物中。
[0031]
在一些实施方案中，所述组合物不包含任何不同于所述第一聚合物和/或所述第二聚合物的交联剂。
[0032]
在另一方面，本公开提供了一种由本公开的组合物形成的水凝胶。
[0033]
在一些实施方案中，本公开的所述水凝胶是生物相容的。
[0034]
在一些实施方案中，所述水凝胶具有以下特性中的至少一种：1)储能模量g’不超过5pa，如在5％应变和5rad/s频率下的动态振荡剪切测试中测量的；2)粘度不超过约0.5mpa
·
s，如在超过约100/s的剪切速率下的连续剪切测试中测量的，和3)损耗模量g”不超过其储能模量g’的约100％，如在5％应变和5rad/s频率下的动态振荡剪切测试中测量的。
[0035]
在另一方面，本公开提供了一种用于生成水凝胶的方法，其包括：a)提供本公开的组合物；和b)使所述组合物经历能够形成水凝胶的条件。
[0036]
在一些实施方案中，所述经历包括在约15℃至约50℃温育所述组合物。
[0037]
在另一方面，本公开提供了一种包含本公开的水凝胶的药物组合物。
[0038]
在一些实施方案中，所述水凝胶被配制成适合作为药物封装。
[0039]
在一些实施方案中，所述药物组合物包含药物，并且所述药物被封装在所述水凝胶中。
[0040]
通过以下详细描述，本公开的其他方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见，其中仅显示和描述了本公开的说明性实施方案。将认识到，本公开能够其他和不同实施方案，并且其若干细节能够在各个明显方面修改而全部不会脱离本公开。因此，附图和描述被视为说明性的而非限制性的。
[0041]
通过引用并入
[0042]
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均以引用方式并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体且单独地指示以引用方式并入一样。
附图说明
[0043]
本发明的新颖特征在所附的权利要求中有具体说明。通过参考下面的详细描述和附图(在此也是“图”和“图片”)，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，所述详细描述阐述了其中采用本发明的原理的说明性实施方案，其中：
[0044]
图1说明了ha-vs聚合物的合成。
[0045]
图2说明了ha-sh聚合物的合成。
[0046]
图3说明了本公开的水凝胶的形成。
[0047]
图4a说明了在反应后和以约1mg/ml的溶液对ph 4hcl透析1天后，通过ha-sh的琼
脂糖水凝胶电泳(age)测量的mw变化。图4b说明了通过ha和ha-sh的age测量的分布mw。
[0048]
图5说明了2.6mda、23％dm的ha-vs的gpc曲线。
[0049]
图6a和6b说明了ha-sh作为溶液在4℃下的mw(6a)变化和ha-sh作为溶液在4℃下储存的水凝胶渗透谱(gpc)曲线(6b)的实例。
[0050]
图7a和7b说明了ha-sh作为溶液在4℃下的mw(7a)变化和ha-sh作为溶液在4℃下储存的gpc曲线(7b)的实例。
[0051]
图8a、8b、8c和8d说明了5％dm的葡聚糖-sh的mw(8a)变化和gpc曲线(8b)的实例，以及12.5％ dm的葡聚糖-sh的mw(8c)变化和gpc曲线(8d)的实例。
[0052]
图9说明了在不同ha-sh浓度下凝胶g’的变化趋势。
[0053]
图10说明了在不同ha-vs浓度下凝胶g’的变化趋势。
[0054]
图11说明了在不同dm下凝胶g’的变化趋势。
[0055]
图12说明了葡聚糖-sh形成的凝胶的g’的变化趋势。
[0056]
图13说明了在不同温育期后通过16.4％dm和670kda的ha-sh的age测量的mw变化。
[0057]
图14a和14b说明了进行频率扫描测试的四种水凝胶的g’和g”。
[0058]
图15a和15b说明了进行应变扫描测试的四种水凝胶的g’和g”。
[0059]
图16a和16b说明了进行步进应力测试的四种水凝胶的应变响应。
[0060]
图17a和17b说明了进行连续剪切测试的四种水凝胶的剪切粘度。
[0061]
图18说明了小分子莫西沙星(moxifloxacin)从水凝胶中的释放。
[0062]
图19说明了小分子左氧氟沙星(levofloxacin)从水凝胶中的释放。
[0063]
图20说明了蛋白质贝伐单抗(bevacizumab)从水凝胶中的释放。
[0064]
图21说明了适体从水凝胶ap1中的释放。
[0065]
图22说明了适体从水凝胶ap2中的释放。
具体实施方式
[0066]
虽然在此已经示出和描述了本发明的各种实施方案，但对于本领域的技术人员将显而易见的是，这些实施方案仅作为示例提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到许多变化、改变和替换。应当理解，可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。
[0067]
如本文所用，术语“聚合物”通常是指通过聚合形成并且基本上由重复结构单元组成的化合物或化合物的混合物。在一些实施方案中，聚合物可以是水凝胶形成聚合物。如本文所用，术语“水凝胶形成聚合物”通常是指参与形成水凝胶的聚合物。它可以是能够形成水凝胶的天然存在的聚合物或合成聚合物。水凝胶形成聚合物可以包括对水凝胶形成有贡献的聚合物。在一些实施方案中，水凝胶形成聚合物不包括不能参与水凝胶形成的聚合物，和/或不能形成水凝胶的聚合物，即使存在于本公开的组合物中。在某些情况下，水凝胶形成聚合物也可称为“主链聚合物”和“交联聚合物”。
[0068]
如本文所用，术语“水凝胶”通常是指凝胶或凝胶状结构，其包含悬浮在水溶液(例如水)中的一种或多种聚合物。由于彼此之间的纠缠，所有水凝胶在大分子单体之间都具有一定程度的物理吸引力。通常，用于组织工程应用的水凝胶可以通过额外的物理相互作用或化学交联来增强。
[0069]
如本文所用，术语“亲电子的”通常是指对电子对具有亲和力。亲电子物质(例如，分子或分子的一部分)可以是电子对受体。在一些实施方案中，亲电子分子或基团可选自由乙烯基、丙烯酰基、硫醇、烯烃、硫醇酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、卤代烷、磺酰卤、环氧化物、亚胺酯、氟苯基酯、碳酸酯、碳二亚胺、二硫化物、氮丙啶及其任何组合组成的组。在一些实施方案中，亲电子分子或基团可包含乙烯基砜、马来酰亚胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、环氧化物及其任何组合。
[0070]
如本文所用，术语“亲核的”通常是指具有能够提供电子对以形成与亲电子物质反应有关的化学键的性质。在一些实施方案中，该术语可以指物质的亲核特性和对亲电体的亲和力。在一些实施方案中，亲核物质(例如分子或分子的一部分)可选自由硫醇、胺、叠氮化物、酰肼、胺、二烯、肼、羟胺及其任何组合组成的组。
[0071]
如本文所用，术语“亲水的”通常是指对水具有亲和力，能够吸收水或被水润湿。亲水分子或分子的一部分与水及其他极性物质的相互作用比它们与油或其他疏水溶剂的相互作用在热力学上更有利。
[0072]
如本文所用，术语“粘度”通常是指在流体或半流体中流动的阻力特性。
[0073]
如本文所用，术语“特性粘度[η]”通常是指从大分子的稀溶液中测量的值，其包含关于大分子形状、柔韧性和大分子摩尔质量的信息。它被定义为在“无限稀释”或零浓度的极限下的降低的比粘度。在本公开中，特性粘度[η]可以通过乌氏粘度计或差分粘度计测量。或者，特性粘度[η]可以根据特性粘度和分子量之间的既定关系从mark-houwink方程计算。聚合物的[η]在不同的条件下可能不同，例如在不同的溶剂、不同组成的溶剂(例如不同的盐浓度)或不同的温度下。如无特别说明，本专利中的[η]值是指水凝胶形成条件下的[η]值。
[0074]
如本文所用，术语“大量的”通常是指多于最小或微不足道的量；而“基本上”通常是指多于最低限度或微不足道的程度。
[0075]
如本文所用，术语“储能模量g
’”
通常表示材料对振荡正弦应变的弹性响应，如通过流变仪的动态振荡模式测量的。
[0076]
如本文所用，术语“损耗模量g
””
通常表示材料对振荡正弦应变的粘性响应，如通过流变仪的动态振荡模式测量的。
[0077]
如本文所用，术语“平均修饰度(dm)”通常是指聚合物中每100个重复单元的反应性基团的数量。在本公开中，反应性基团可以在聚合物生成之前或之后添加到聚合物中。在一些实施方案中，反应性基团可以在聚合物的制备过程中添加到聚合物中。在一些实施方案中，反应性基团可以在修饰过程中添加到聚合物中。例如，dm可以反映聚合物衍生物的修饰程度。
[0078]
如本文所用，术语聚合物的“回转半径(rg)”或“回旋半径”通常是指聚合物链元件距链重心的平均距离。
[0079]
如本文所用，术语“交联”通常是指将一个聚合物链连接到另一个聚合物链的键。它们可以是共价键，也可以是离子键。“聚合物链”可以指合成聚合物或天然聚合物(例如透明质酸)。
[0080]
如本文所用，术语“交联剂”通常是指通过键将一个聚合物链连接到另一个聚合物链的试剂。交联剂可通过共价键或非共价键实现交联。“聚合物链”可以指合成聚合物、天然
聚合物(如透明质酸)或天然聚合物的衍生物。在聚合物化学中，当聚合物要“交联”时，通常意味着聚合物的整个主体都已暴露于交联方法。由此产生的机械性能改变很大程度上取决于交联密度。交联可以通过聚合物之间的化学反应形成。
[0081]
如本文所用，术语“前体聚合物”通常是指用于形成另一种聚合物结构或用于被进一步修饰的聚合物。这种材料能够通过反应性基团进一步聚合以形成更高分子量的结构。
[0082]
如本文所用，术语“组合物”通常是指各种元素或成分的产品(液态或固态)。
[0083]
如本文所用，术语“生物相容性的”或“生物相容性”通常是指通过不具有毒性、伤害性或生理反应性和/或不引起免疫排斥而与活组织或活系统相容的状况。
[0084]
当在数值的上下文中使用时，术语“约”通常是指高于或低于指示值小于1％至15％的值(例如，小于1％、小于2％、小于3％、小于4％、小于5％、小于6％、小于7％、小于8％、小于9％、小于10％、小于11％、小于12％、小于13％、小于14％、或小于15％)。
[0085]
在提供值范围(例如，数值范围)的情况下，应理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限和下限之间的每个中间值(精确至下限单位的十分之一)以及在该规定范围内的任何其他规定或中间值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也涵盖在本发明内，但受规定范围内任何具体排除的界限的限制。在规定范围包括一个或两个界限的情况下，排除那些包括的界限之一或两个的范围也包括在本发明中。
[0086]
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有和本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。虽然与本文中所述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中，但是现在描述优选方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用并入本文，以公开和描述与引用这些出版物相关的方法和/或材料。
[0087]
如本文所用，除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数个引用对象。因此，例如，提及“一个粒子”包括多个这样的粒子，并且提及“序列”包括提及一个或多个所述序列及其本领域技术人员已知的等价物，等等。
[0088]
如本领域技术人员在阅读本公开后将理解的，本文描述和说明的每个单独的实施方案具有分立的部件和特征，它们可以容易地与其他几个实施方案中的任一个的特征分离或组合而不脱离本发明的范围或精神。任何列举的方法都可以按照列举的事件的顺序或任何其他逻辑上可能的顺序来执行。这旨在为所有此类组合提供支持。
[0089]
本公开提供了包含一种或多种水凝胶形成聚合物的组合物及其制备和使用方法。并且本公开提供了一种水凝胶及其制备和使用方法。
[0090]
在一个方面，本公开提供了一种组合物，其可以包含至少一种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种)具有高特性粘度[η]的第一聚合物和至少一种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种)具有低特性粘度[η]的第二聚合物。在一些实施方案中，所述第一聚合物可具有至少约500ml/g(例如，至少约500ml/g、至少约600ml/g、至少约700ml/g、至少约800ml/g、至少约900ml/g、至少约1000ml/g、至少约1100ml/g、至少约1200ml/g、至少约1300ml/g、至少约1400ml/g、至少约1500ml/g、至少约1600ml/g、至少约1700ml/g、至少约1800ml/g、至少约1900ml/g、至少约2000ml/g、至少约2200ml/g、至少约2400ml/g、至少约2800ml/g、至少约2900ml/g、至少约
3000ml/g、至少约3500ml/g、至少约4000ml/g、至少约4500ml/g、至少约5000ml/g或更高)的[η]，并且所述第二聚合物可具有低于所述第一聚合物并且小于约1800ml/g(例如，小于约1700ml/g、小于约1600ml/g、小于约1500ml/g、小于约1400ml/g、小于约1300ml/g、小于约1200ml/g、小于约1100ml/g、小于约1000ml/g、小于约900ml/g、小于约800ml/g、小于约700ml/g、小于约600ml/g、小于约500ml/g、小于约400ml/g、小于约300ml/g、小于约200ml/g、小于约100ml/g、小于约20ml/g、小于约10ml/g或更低)的[η]。
[0091]
在一些实施方案中，所述第一聚合物可具有约500ml/g至约5000ml/g(例如，约500ml/g至约4600ml/g、约600ml/g至约4400ml/g、约800ml/g至约4200ml/g、约1000ml/g至约4000ml/g、约1500ml/g至约3500ml/g、约2000ml/g至约3500ml/g、约2500ml/g至约3500ml/g等)的特性粘度[η]。在一些实施方案中，所述第一聚合物可具有约1000ml/g至约4000ml/g的特性粘度[η]，例如，所述第一聚合物可具有约2500ml/g至约3500ml/g的特性粘度[η]，如通过乌氏粘度计、与毛细管粘度计联合的水凝胶渗透谱法测量，或基于公布的分子量和[η]之间的关系计算。
[0092]
在一些实施方案中，所述第二聚合物可具有约5ml/g至约1800ml/g(例如，约5ml/g至约1600ml/g、约5ml/g至约1400ml/g、约5ml/g至约1200ml/g、约5ml/g至约1000ml/g、约5ml/g至约500ml/g、约5ml/g至约400ml/g、约5ml/g至约300ml/g、约5ml/g至约250ml/g、约10ml/g至约200ml/g、约10ml/g至约150ml/g、约15ml/g至约100ml/g等)的特性粘度[η]。在一些实施方案中，[η]可以通过乌氏粘度计测量。例如，所述第二聚合物可具有约5ml/g至约200ml/g的特性粘度[η]，如通过乌氏粘度计、与毛细管粘度计联合的水凝胶渗透谱法测量，或基于公布的分子量和[η]之间的关系计算。
[0093]
在一些实施方案中，所述第一聚合物可具有约1000ml/g至约4000ml/g的特性粘度[η]，并且所述第二聚合物可具有约5ml/g至约200ml/g的特性粘度[η]。
[0094]
在本公开中，第一聚合物具有第一特性粘度[η]([η]1)，并且第二聚合物具有第二特性粘度[η]([η]2)。在一些实施方案中，[η]1可以大于[η]2，并且[η]1和[η]2之间的比率可为约500:1至约1:1(例如，约500:1至约1:1、约400:1至约1:1、约300:1至约1:1、约200:1至约1:1、约100:1至约1:1、约50:1至约1:1、约3:1至约1:1、约20:1至约1:1、约10:1至约1:1、约5:1至约1:1、约500:1至约10:1、约500:1至约40:1、约500:1至约50:1、约500:1至约100:1、约500:1至约200:1、约500:1至约300:1、约500:1至约400:1、约400:1至约20:1、约250:1至约30:1、约150:1至约40:1等)。例如，[η]1和[η]2之间的比率可为约300:1至约25:1。
[0095]
在一些实施方案中，所述组合物中所述第一聚合物的浓度可以至多为约5mg/ml。在一些实施方案中，所述组合物中所述第一聚合物的浓度可为约0.1mg/ml至约4mg/ml(例如，约0.1mg/ml至约4mg/ml、约0.2mg/ml至约3mg/ml、约0.3mg/ml至约2mg/ml、约0.3mg/ml至约1.5mg/ml等)。在一些实施方案中，所述组合物中所述第一聚合物的浓度可为约0.3mg/ml至约1.5mg/ml。
[0096]
在一些实施方案中，所述第一聚合物可选自由多糖、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、弹性蛋白、胶原蛋白、聚乙二醇、其衍生物及其任何组合组成的组。例如，组合物中的第一聚合物可包含以下一种或多种：多糖、一种或多种类型的多糖衍生物、聚(丙烯酸)、一种或多种类型的聚(丙烯酸)衍生物、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、一种或多种类型的聚(甲基
丙烯酸羟乙酯)衍生物、弹性蛋白、一种或多种类型的弹性蛋白衍生物、胶原蛋白、一种或多种类型的胶原蛋白衍生物、聚乙二醇和一种或多种类型的聚乙二醇衍生物及其任何组合。
[0097]
在一些实施方案中，所述第二聚合物可选自由多糖、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、弹性蛋白、胶原蛋白、聚乙二醇、其衍生物及其任何组合组成的组。例如，组合物中的第二聚合物可包含以下一种或多种：多糖、一种或多种类型的多糖衍生物、聚(丙烯酸)、一种或多种类型的聚(丙烯酸)衍生物、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、一种或多种类型的聚(甲基丙烯酸羟乙酯)衍生物、弹性蛋白、一种或多种类型的弹性蛋白衍生物、胶原蛋白、一种或多种类型的胶原蛋白衍生物、聚乙二醇和一种或多种类型的聚乙二醇衍生物及其任何组合。
[0098]
在一些实施方案中，所述第一聚合物可选自由多糖、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、弹性蛋白、胶原蛋白、聚乙二醇、其衍生物及其任何组合组成的组，并且所述第二聚合物可选自由多糖、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、弹性蛋白、胶原蛋白、聚乙二醇、其衍生物及其任何组合组成的组。
[0099]
在一些实施方案中，所述第一聚合物可选自由透明质酸、瓜尔胶、淀粉、壳聚糖、硫酸软骨素、藻酸盐、羧甲基纤维素、葡聚糖、其衍生物及其任何组合组成的组。例如，组合物中的第一聚合物可包含以下一种或多种：透明质酸、一种或多种类型的透明质酸衍生物、瓜尔胶、一种或多种类型的瓜尔胶衍生物、淀粉、一种或多种类型的淀粉衍生物、壳聚糖、一种或多种类型的壳聚糖衍生物、硫酸软骨素、一种或多种类型的硫酸软骨素衍生物、藻酸盐、一种或多种类型的藻酸盐衍生物、羧甲基纤维素和一种或多种类型的羧甲基纤维素衍生物、葡聚糖、一种或多种类型的葡聚糖衍生物及其任何组合。
[0100]
在一些实施方案中，所述第二聚合物可选自由透明质酸、瓜尔胶、淀粉、壳聚糖、硫酸软骨素、藻酸盐、羧甲基纤维素、葡聚糖、其衍生物及其任何组合组成的组。例如，组合物中的第二聚合物可包含以下一种或多种：透明质酸、一种或多种类型的透明质酸衍生物、瓜尔胶、一种或多种类型的瓜尔胶衍生物、淀粉、一种或多种类型的淀粉衍生物、壳聚糖、一种或多种类型的壳聚糖衍生物、硫酸软骨素、一种或多种类型的硫酸软骨素衍生物、藻酸盐、一种或多种类型的藻酸盐衍生物、羧甲基纤维素和一种或多种类型的羧甲基纤维素衍生物、葡聚糖、一种或多种类型的葡聚糖衍生物、聚乙二醇、一种或多种类型的聚乙二醇衍生物，及其任何组合。
[0101]
在一些实施方案中，所述第一聚合物可选自由透明质酸、瓜尔胶、淀粉、壳聚糖、硫酸软骨素、藻酸盐、羧甲基纤维素、葡聚糖、其衍生物及其任何组合组成的组，并且所述第二聚合物可选自由透明质酸、瓜尔胶、淀粉、壳聚糖、硫酸软骨素、藻酸盐、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙二醇、其衍生物及其任何组合组成的组。
[0102]
在一些实施方案中，所述第一聚合物可选自由透明质酸、葡聚糖、其衍生物及其任何组合组成的组。例如，组合物中的第一聚合物可包含以下一种或多种：透明质酸、一种或多种类型的透明质酸衍生物、葡聚糖、一种或多种类型的葡聚糖衍生物及其任何组合。
[0103]
在一些实施方案中，所述第二聚合物可选自由透明质酸、葡聚糖、其衍生物及其任何组合组成的组。例如，组合物中的第二聚合物可包含以下一种或多种：透明质酸、一种或多种类型的透明质酸衍生物、葡聚糖、一种或多种类型的葡聚糖衍生物、聚乙二醇及其任何组合。
[0104]
在一些实施方案中，所述第一聚合物可选自由透明质酸、葡聚糖、其衍生物及其任
何组合组成的组，并且所述第二聚合物可选自由透明质酸、葡聚糖、其衍生物及其任何组合组成的组。
[0105]
例如，组合物中的所述第一聚合物可包含以下一种或多种：透明质酸衍生物，并且所述第二聚合物可以是透明质酸衍生物。又例如，所述第一聚合物可以是透明质酸衍生物并且所述第二聚合物可以是葡聚糖衍生物。
[0106]
在一些实施方案中，本公开的组合物可包含至少第一聚合物衍生物和第二聚合物衍生物，其中所述第一聚合物衍生物可包含第一反应性基团，并且所述第二聚合物衍生物可包含第二反应性基团。第一反应性基团可以不同于第二反应性基团。
[0107]
根据本公开的任何方面，聚合物(例如，水凝胶形成聚合物)可以用一个或多个反应性基团修饰，例如，以成为本公开的聚合物衍生物。在一个实例中，本公开的聚合物(例如，水凝胶形成聚合物)可以用一个或多个乙烯基砜基团(或用包含一个或多个乙烯基砜基团的分子)修饰。在另一个实例中，本公开的聚合物(例如，水凝胶形成聚合物)可以用一个或多个硫醇基团(或用包含一个或多个硫醇基团的分子)修饰。
[0108]
在本公开中，第一聚合物可以包含第一聚合物衍生物，所述第一聚合物衍生物可以包含第一反应性基团，并且第一聚合物衍生物可以是亲电子的。在一些实施方案中，第一反应性基团可选自由乙烯基、马来酰亚胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、环氧化物、硫醇、烯烃、硫醇酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、卤代烷、磺酰卤、环氧化物、亚胺酯、氟苯基酯、碳酸酯、碳二亚胺、二硫化物、氮丙啶及其任何组合组成的组。在一些实施方案中，第一反应性基团可选自由乙烯基、丙烯酰基、硫醇、烯烃、硫醇酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、卤代烷、磺酰卤、环氧化物、亚胺酯、氟苯基酯、碳酸酯、碳二亚胺、二硫化物、氮丙啶及其任何组合组成的组。
[0109]
在一些实施方案中，第一反应性基团可选自乙烯基砜、马来酰亚胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、环氧化物及其任何组合。
[0110]
在本公开中，第二聚合物可包含第二水凝胶形成聚合物衍生物，所述第二聚合物衍生物可包含第二反应性基团，并且第二水凝胶形成聚合物衍生物可以是亲核的。
[0111]
在一些实施方案中，第二反应性基团可选自由硫醇、胺、叠氮化物、酰肼、二烯、肼、羟胺及其任何组合组成的组。
[0112]
在一些实施方案中，第一反应性基团可选自由乙烯基、马来酰亚胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、环氧化物、硫醇、烯烃、硫醇酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、卤代烷、磺酰卤、环氧化物、亚胺酯、氟苯基酯、碳酸酯、碳二亚胺、二硫化物、氮丙啶及其任何组合组成的组，并且第二反应性基团可选自由硫醇、胺、叠氮化物、酰肼、二烯、肼、羟胺及其任何组合组成的组。
[0113]
在一些实施方案中，所述第一反应性基团可选自乙烯基砜、马来酰亚胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、环氧化物及其任何组合，而所述第二反应性基团可选自硫醇、胺、叠氮化物、酰肼、二烯、肼、羟胺及其任何组合。
[0114]
例如，第一反应性基团可以包括乙烯基砜，而第二反应性基团可以包括硫醇。
[0115]
在一些实施方案中，在组合物中，第一反应性基团可以包括一种或多种乙烯基砜，而第二反应性基团可以包括一种或多种硫醇。
[0116]
在一些实施方案中，第一聚合物衍生物能够与第二聚合物衍生物反应以形成水凝胶。
[0117]
在一些实施方案中，所述第一聚合物可以具有约500,000至约5,500,000道尔顿
(例如，约500,000至约5,500,000道尔顿、约1,000,000至约5,500,000道尔顿、约1,500,000至约5,500,000道尔顿、约2,000,000至约5,500,000道尔顿、约2,5000,000至约5,500,000道尔顿、约3,000,000至约5,500,000道尔顿、约3,500,000至约5,500,000道尔顿、约4,000,000至约5,500,000道尔顿、约4,500,000至约5,500,000道尔顿、或约500,000至约5,000,000道尔顿、约500,000至约4,500,000道尔顿、约500,000至约4,000,000道尔顿、约500,000至约3,500,000道尔顿、约1,000,000至约3,000,000道尔顿、约1,000,000至约2,500,000道尔顿、约1,000,000至约2,000,000道尔顿、约1,000,000至约1,500,000道尔顿、或约1,500,000至约5,000,000道尔顿、约2,000,000至约4,500,000道尔顿、约2,000,000至约4,000,000道尔顿、约2,000,000至约3,500,000道尔顿、约2,000,000至约3,000,000道尔顿等)的分子量。在一些实施方案中，所述第一聚合物可以是透明质酸。
[0118]
在一些实施方案中，所述第二聚合物可以具有约3,000至约800,000道尔顿(例如，约3,000至约800,000道尔顿、约5,000至约700,000道尔顿、约10,000至约600,000道尔顿、约15,000至约500,000道尔顿、约20,000至约400,000道尔顿、约20,000至约300,000道尔顿、约20,000至约200,000道尔顿、约20,000至约100,000道尔顿、约20,000至约90,000道尔顿、约20,000至约80,000道尔顿、约20,000至约70,000道尔顿、约20,000至约60,000道尔顿、约20,000至约50,000道尔顿等)的分子量。在一些实施方案中，所述第二聚合物可以具有约20,000至约800,000道尔顿(例如，约20,000至约800,000道尔顿、约20,000至约700,000道尔顿、约20,000至约600,000道尔顿、约20,000至约500,000道尔顿、约20,000至约400,000道尔顿、约20,000至约300,000道尔顿、约20,000至约200,000道尔顿、约20,000至约100,000道尔顿、约20,000至约90,000道尔顿、约20,000至约80,000道尔顿、约20,000至约70,000道尔顿、约20,000至约60,000道尔顿、约20,000至约50,000道尔顿等)的分子量。
[0119]
在一些实施方案中，所述组合物中所述第一聚合物和所述第二聚合物之间的分子量(mw)比可以为约500:1至约1.5:1(例如，约500:1至约1.5:1、约450:1至约1.5:1、约400:1至约1.5:1、约350:1至约1.5:1、约300:1至约1.5:1、约250:1至约1.5:1、约200:1至约1.5:1、约150:1至约1.5:1、约100:1至约1.5:1等)。
[0120]
在本公开中，组合物中的第一聚合物可以具有大于约30nm(例如，约30nm至约500nm、约50nm至约450nm、约100nm至约400nm、约150nm至约350nm、约150nm至约300nm、约150nm至约250nm等)的回转半径(rg)。在一些实施方案中，组合物中的第一聚合物可以具有约30nm至约500nm的rg。在一些实施方案中，组合物中的第一聚合物可以具有约150nm至约250nm的rg。
[0121]
组合物中的第二聚合物可以具有小于100nm(例如，约1nm至约100nm、约3nm至约90nm、约3nm至约80nm、约3nm至约70nm、约3nm至约60nm、约3nm至约50nm、约3nm至约40nm、约3nm至约30nm、约3nm至约20nm、约5nm至约20nm等)的回转半径(rg)。在一些实施方案中，组合物中的第二聚合物可以具有约3nm至约100nm的rg。在一些实施方案中，组合物中的第二聚合物可以具有约5nm至约20nm的rg。
[0122]
在一些实施方案中，所述组合物中所述第一聚合物和所述第二聚合物之间的回转半径(rg)比可以为约150:1至约1:1(例如，约150:1至约1:1、约100:1至约1:1、约80:1至约1:1、约60:1至约1:1、约50:1至约1:1、约30:1至约1:1、约30:1至约5:1、约30:1至约10:1等)。在一些实施方案中，所述组合物中所述第一聚合物和所述第二聚合物之间的回转半径
(rg)比可以大于1:1(例如，约150:1至约1.1:1、约100:1至约1.1:1、约80:1至约1.1:1、约60:1至约1.1:1、约50:1至约1.1:1、约30:1至约1.1:1、约30:1至约5:1、约30:1至约10:1等)。例如，所述组合物中所述第一聚合物和所述第二聚合物之间的回转半径(rg)比可以为约30:1至约10:1。
[0123]
在一些实施方案中，所述组合物中所述第一聚合物和所述第二聚合物之间的摩尔比可以为约4:1至约1:500(例如，约4:1至约1:500、约3:1至约1:500、约2:1至约1:500、约1:1至约1:500、约4:1至约1:400、约4:1至约4:300、约4:1至约4:200、约4:1至约1:100、约3:1至约1:400、约2:1至约1:300、约1:1至约1:200、约1:1至约1:100、约1:1至约1:500等)。例如，所述组合物中所述第一聚合物和所述第二聚合物之间的摩尔比可以为约1:1至约1:50。
[0124]
在一些实施方案中，衍生物可具有约3％至约50％(例如，约4％至约45％、约5％至约40％、约6％至约40％、约7％至约40％、约8％至约39％、约8％至约38％、约8％至约35％、约9％至约32％、约8％至约30％、约10％至约30％、约12％至约30％、约13％至约30％、约14％至约30％、约15％至约35％、或约15％至约30％)的平均修饰度(dm)。
[0125]
在一些情况下，第一聚合物衍生物可以用一个或多个乙烯基砜基团修饰，并且第二聚合物衍生物可以用一个或多个硫醇基团修饰。第一聚合物衍生物能够与第二聚合物衍生物反应以形成水凝胶。
[0126]
在本公开中，第一聚合物衍生物可以是用一个或多个乙烯基砜基团修饰的葡聚糖衍生物、用一个或多个乙烯基砜基团修饰的透明质酸衍生物、用一个或多个马来酰亚胺基团修饰的葡聚糖衍生物、用一个或多个马来酰亚胺基团修饰的透明质酸衍生物、用一个或多个丙烯酸酯基团修饰的葡聚糖衍生物、用一个或多个丙烯酸酯基团修饰的透明质酸衍生物、用一个或多个甲基丙烯酸酯基团修饰的葡聚糖衍生物、用一个或多个甲基丙烯酸酯基团修饰的透明质酸衍生物或其组合。例如，第一聚合物衍生物可以是用一个或多个乙烯基砜基团修饰的葡聚糖衍生物、用一个或多个乙烯基砜基团修饰的透明质酸衍生物或用一个或多个马来酰亚胺基团修饰的透明质酸衍生物。
[0127]
在本公开中，第二聚合物衍生物可以是用一个或多个硫醇基团修饰的葡聚糖衍生物、用一个或多个硫醇基团修饰的透明质酸衍生物、用一个或多个胺基团修饰的葡聚糖衍生物、用一个或多个胺基团修饰的透明质酸衍生物或其组合。例如，第二聚合物衍生物可以是用一个或多个硫醇基团修饰的葡聚糖衍生物、用一个或多个硫醇基团修饰的透明质酸衍生物。
[0128]
在本公开中，第一聚合物衍生物可以是用一个或多个乙烯基砜基团修饰的葡聚糖衍生物、用一个或多个乙烯基砜基团修饰的透明质酸衍生物、用一个或多个马来酰亚胺基团修饰的葡聚糖衍生物、用一个或多个马来酰亚胺基团修饰的透明质酸衍生物、用一个或多个丙烯酸酯基团修饰的葡聚糖衍生物、用一个或多个丙烯酸酯基团修饰的透明质酸衍生物、用一个或多个甲基丙烯酸酯基团修饰的葡聚糖衍生物、用一个或多个甲基丙烯酸酯基团修饰的透明质酸衍生物或其组合，并且第二聚合物衍生物可以是用一个或多个硫醇基团修饰的葡聚糖衍生物、用一个或多个硫醇基团修饰的透明质酸衍生物、用一个或多个胺基团修饰的葡聚糖衍生物、用一个或多个胺基团修饰的透明质酸衍生物或其组合。在一些情况下，第一聚合物衍生物可以是用一个或多个乙烯基砜基团修饰的葡聚糖衍生物、用一个或多个乙烯基砜基团修饰的透明质酸衍生物，并且第二聚合物衍生物可以是用一个或多个
硫醇基团修饰的葡聚糖衍生物、用一个或多个硫醇基团修饰的透明质酸衍生物。第一聚合物衍生物能够与第二聚合物衍生物反应以形成水凝胶。
[0129]
例如，第一聚合物衍生物可以包括用一个或多个乙烯基砜基团修饰的透明质酸衍生物(ha-vs)，并且第二聚合物衍生物可以包括用一个或多个硫醇基团修饰的透明质酸衍生物(ha-sh)。又例如，第一聚合物衍生物可以是用一个或多个乙烯基砜基团修饰的透明质酸衍生物(ha-vs)，并且第二聚合物衍生物可以是用一个或多个硫醇基团修饰的葡聚糖衍生物(葡聚糖-sh)。又例如，第一聚合物衍生物可以是用一个或多个马来酰亚胺基团修饰的透明质酸衍生物(ha-mi)，并且第二聚合物衍生物可以是用一个或多个硫醇基团修饰的透明质酸衍生物(ha-sh)。在适当的条件下，第一聚合物衍生物能够与第二聚合物衍生物反应以形成聚合物-聚合物型水凝胶。
[0130]
在一些实施方案中，所述第一聚合物可以包含在形成的水凝胶形式的所述组合物中。在一些实施方案中，所述第二聚合物可以包含在形成的水凝胶形式的所述组合物中。
[0131]
在一些实施方案中，所述组合物可以不包含任何不同于所述一种或多种聚合物的交联剂。
[0132]
在一些实施方案中，组合物可包含缓冲液。缓冲液可以是水溶液，并且可以包含水和用于调节水溶液的ph或缓冲能力的适当盐。
[0133]
本公开的组合物中的聚合物对于长期储存可具有优异的稳定性。本公开的聚合物在长期储存时不会降解。本公开的聚合物不能与其本身交联或形成聚集体以便长期储存。本公开的聚合物可以具有稳定的分子量范围。
[0134]
在另一方面，本公开提供了一种由本公开的组合物形成的水凝胶。在一些实施方案中，本公开的所述水凝胶可以是生物相容的。
[0135]
在某些情况下，组合物中几乎所有的聚合物都能够形成水凝胶，在某些情况下，组合物可以不包含任何不同于所述一种或多种聚合物的交联剂。
[0136]
根据本公开的水凝胶可以具有一种或多种特定特征/性质。
[0137]
本公开的水凝胶可以具有不超过5pa(例如，不超过4pa、不超过3.5pa、不超过3pa、不超过2.5pa、至少2.4pa、至少2.2pa、至少2pa、至少1.8pa、不超过1.6pa、不超过1.5pa、不超过1.4pa、不超过1.2pa、不超过1.0pa、不超过0.8pa、不超过0.7pa、不超过0.6pa、不超过0.5pa、不超过0.4pa、不超过0.3pa、不超过0.2pa、不超过0.1pa、或更少)的储能模量g’，如在5％应变和5rad/s频率下的动态振荡剪切测试中测量的。
[0138]
本公开的水凝胶可以具有不超过约100mpa
·
s的粘度，如在超过约1000/s的频率剪切速率下的连续剪切测试中测量的。本公开的水凝胶可以具有至少约500mpa
·
s的粘度，如在超过约0.1/s的频率剪切速率下的连续剪切测试中测量的。0.1/s时的剪切粘度比1000/s时的剪切粘度至少高10倍。
[0139]
本公开的水凝胶可以具有不超过其储能模量g’的约100％(例如，不超过约90％、不超过约80％、不超过约70％、不超过约60％、不超过约55％、不超过约50％、不超过约45％、不超过约40％、不超过约35％、不超过约30％、不超过约25％、或不超过约20％)的损耗模量g”，如在5％应变和5rad/s频率下的动态振荡剪切测试中测量的。
[0140]
在一些实施方案中，组合物可以具有约6.0至约8.0(例如，约6.1至约7.9、约6.2至约7.7、约6.3至约7.7、约6.4至约7.4、约6.5至约7.3、约6.6至约7.2、约6.7至约7.1、约6.8
至约7、约6.3至约6.8、约6.3至约6.7、或约6.4至约6.6)的ph值。
[0141]
流变仪可用于测量储能模量、损耗模量，并可用于动态振荡剪切测试中。在另一实例中，流变仪可包括位移传感器(例如线性可变差动变压器)，其可测量由于仪器探针移动通过磁芯而导致的电压变化。流变仪还可以包括温度控制系统或加热炉、驱动马达(例如，用于探针加载的线性马达，其可以为所施加的力提供载荷)、驱动轴支撑件和用作从马达到样本的力的引导的引导系统，以及一个或多个用于保持被测试的样本的样本夹具。
[0142]
可以使用不同类型的流变仪分析仪。例如，可以使用强制共振分析仪或自由共振分析仪。自由共振分析仪可以通过悬吊和摆动被测试的样本来测量所述样本的阻尼自由振荡。强制共振分析仪可以迫使样本以特定频率振荡，并且对于执行温度扫描可能是可靠的。分析仪可用于应力(力)和应变(位移)控制两者。例如，在应变控制中，探针可以移位，并且可以通过实施力平衡传感器来测量样本产生的应力，所述力平衡传感器可以使用不同的轴。在应力控制中，可以施加设定的力，并且可以测量样本产生的应变或位移，并且可以改变几个其他实验条件(温度、频率或时间)。应力和应变可以通过扭转或轴向分析仪施加。使用扭转分析仪，力以扭转运动的形式施加。轴向分析仪可用于弯曲、拉伸和/或压缩测试。
[0143]
可以采用多种测试模式来探测聚合物和水凝胶的粘弹性特性，例如温度扫描测试、频率扫描测试、应变扫描测试、步进应力测试、动态应力-应变测试、连续剪切测试或其组合。
[0144]
流变仪可以测定各种机械特性。这些特性包括储能模量(g’)、损耗模量(g”)、复数模量(g*)、损耗角(tan(δ))、复数粘度(η*)、其同相(η’)和异相分量(η”)、复数柔量(j*)、储能柔量(j’)、损耗柔量(j”)、粘度(η)等。
[0145]
例如，在动态振荡剪切测试中，可以向材料施加正弦力(例如，应力)，并可以测量由此产生的位移(应变)。对于完全弹性的固体，产生的应变和应力可能完全同相。对于纯粘性流体，应变相对于应力可能存在90度相位滞后。具有介于两者之间的特性的粘弹性聚合物或水凝胶在测试期间可能具有相位滞后，并且可以相应地计算储能模量和损耗模量。
[0146]
在另一个方面，本公开提供了一种用于生成水凝胶(例如，本公开的水凝胶)的方法。所述方法可以包括a)提供组合物(例如，包含本公开的一种或多种聚合物的组合物)；和b)使组合物经历能够形成水凝胶(例如，能够交联聚合物以形成水凝胶)的条件。例如，条件可以包括在约15℃至约50℃温育组合物。
[0147]
在某些情况下，所述方法可以包括交联溶液中的聚合物以生成水凝胶。例如，能够形成水凝胶的条件也能够使溶液中的聚合物交联。
[0148]
例如，所述方法可以包括：1)在水中制备第一聚合物(或第一聚合物衍生物)和第二聚合物(或第二聚合物衍生物)(例如，第一聚合物可以包括用一个或多个乙烯基砜基团修饰的透明质酸；和第二聚合物可以包括用一个或多个硫醇基团修饰的透明质酸、葡聚糖或聚乙二醇)，调节ph(例如，通过添加缓冲溶液)；2)以预先设置的比率将第一聚合物的聚合物与第二聚合物的聚合物混合，组合物中聚合物的浓度如本公开所定义；和3)在允许形成根据本公开的水凝胶的条件下温育混合物。
[0149]
在一些实施方案中，组合物可以不包含与组合物中的聚合物(例如，第一聚合物衍生物，或第二聚合物衍生物)不同的任何交联剂。
[0150]
在一些实施方案中，组合物可以不包含任何小分子交联剂。
degrees of substitution,)》carbohydrate polymers 99(2014)423
–
431.)和聚乙二醇(devanand k,selser jc.《聚(环氧乙烷)水溶液中的渐近行为和长程相互作用(asymptotic behavior and long-range interactions in aqueous solutions of poly(ethylene oxide).)》macromolecules.1991；24(22):5943-5947.，或wu,x.等人,《聚(乙二醇)在硫酸钾水溶液中的粘弹性：石英晶体微量天平与常规方法的比较(viscoelasticity of poly(ethylene glycol)in aqueous solutions of potassium sulfate:a comparison of quartz crystal microbalance with conventional methods.)》polymer journal.,2019:doi:10.1038/s41428-018-0162-3)。
[0158]
一些rg和[η]值在表1、2和3中给出。
[0159]
表1 500kda mw的聚合物的rg和[η]值
[0160]
聚合物ha葡聚糖羧甲基纤维素聚乙二醇rg(nm)～75～20～70～45[η](ml/g)～100050～1800300
[0161]
表2：不同mw的ha的rg和[η]值
[0162]
mw(kda)1029651206702600rg(nm)6.712.620.329.381.6183[η](ml/g)21.666.510630311562960
[0163]
表3不同mw的葡聚糖的rg和[η]值
[0164]
mw(kda)4070150rg(nm)6.28～10[η](ml/g)18.925.237
[0165]
实施例2聚合物衍生物的制备
[0166]
2.1ha-vs的制备
[0167]
如yu和chau(biomacromolecules 2015,16(1),56-65)(图1)所述，透明质酸(ha)用悬挂的vs进行了修饰。简单地说，将ha溶解于去离子水(di水)中。浓度为0.1mg/ml至40mg/ml，取决于ha的分子量(mw)。对于高mw ha(例如mw》1mda),浓度较低；对于低mw ha(例如mw《100kda)，浓度较高。
[0168]
完全溶解后，将5m naoh逐滴添加到聚合物溶液中至最终浓度为0.1m。在剧烈混合下立即添加二乙烯基砜(dvs)。dvs与ha羟基(oh)之间的摩尔比至少为1.25:1。根据目标修饰度(dm)选择dvs浓度和反应时间。对于给定的反应时间，修饰度还取决于ha和dvs的浓度、温度和最终的naoh浓度。通过添加1m hcl以将ph降低至3.5-4.5来终止反应。通过使用透析袋的膜分离或针对去离子水的切向流过滤来纯化聚合物。除非特别说明，纯化后的聚合物以溶液形式在4℃下储存。为了测量修饰度(dm)，将ha-vs冷冻干燥并通过1h nmr测定。
[0169]
2.2ha-sh的制备
[0170]
如yu和chau(biomacromolecules 2015,16(1),56-65)(图2)所述，透明质酸(ha)用悬挂的硫醇(sh)基团进行了修饰。简单地说，首先将ha修饰为ha-vs(如实施例2.1所述)。ha-vs溶液用n2吹扫至少20分钟。将相对于乙烯基砜(vs)基团摩尔过量10倍或制备0.05m dtt溶液所需的量的二硫苏糖醇(dtt)(取决于哪个dtt浓度较高)以约400mg/ml溶解在水
(ph约5.5)中并用n2吹扫至少5分钟，然后添加到ha-vs溶液中。ha-vs/dtt溶液的ph值约为4，并且系统继续用n2吹扫。之后，将1/10体积的ha-vs的0.5m磷酸盐缓冲液(pb)用n2吹扫至少5分钟，并添加到ha-vs/dtt溶液中。反应进行至少25分钟。通过添加1m hcl以将ph降低至3.5-4.5来终止反应。通过使用透析袋的膜分离或针对由hcl调节到ph 4的去离子水的切向流过滤来纯化聚合物。除非特别说明，纯化后的聚合物以溶液形式在4℃下储存。修饰度(dm)由ha-sh的ellman测定法确定。
[0171]
2.3葡聚糖-sh的制备
[0172]
采用以前报道的方法合成了乙烯基砜(vs)和硫醇(sh)官能化的葡聚糖、葡聚糖-vs和葡聚糖-sh(参见y.yu和y.chau,《在含羟基的水溶性聚合物上生成乙烯基砜基团的一步“点击”法(“one-step
‘
click’method for generating vinyl sulfone groups on hydroxyl-containing water-soluble polymers,”)》biomacromolecules,第13卷,第937
–
942页,2012.)。简单地说，二乙烯砜(dvs)在水性、碱性条件下与葡聚糖上的羟基反应生成葡聚糖-vs(图1)。使用二硫苏糖醇(dtt)在磷酸盐缓冲溶液中与葡聚糖-vs上的vs基团反应以制备葡聚糖-sh(图2)，从而获得硫醇官能化的葡聚糖，官能化方案类似于实施例2.2。通过使用透析袋的膜分离或针对由hcl调节到ph 4的去离子水的切向流过滤来纯化聚合物。除非特别说明，纯化后的聚合物以溶液形式在4℃下储存。使用1h nmr确定葡聚糖-vs的dm，并用ellman测定法确定葡聚糖-sh的dm。
[0173]
实施例3高特性粘度[η]的经修饰聚合物的稳定性
[0174]
根据实施例2.2和2.1修饰ha-sh和ha-vs。为了说明高分子量ha的稳定性，这些ha衍生物由分子量为2.6mda的ha([η]＝2960ml/g，rg＝183nm)修饰而来。ha-sh的稳定性通过琼脂糖水凝胶电泳(age)评估，并且ha-vs的稳定性通过凝胶渗透谱(gpc)评估。
[0175]
age的方案已根据之前的报告进行了修改(lee和cowman,《一种分析透明质酸分子量分布的琼脂糖凝胶电泳方法(an agarose gel electrophoretic method for analysis of hyaluronan molecular weight distribution,)》analytical chemistry,1994:219；278-287)。简单地说，将age加载缓冲液中约15％ dm的ha-sh样本加载到tea缓冲液中由5mg/ml高熔点琼脂糖(solarbio,beijing,china)组成的琼脂糖凝胶中。在80mv电泳1小时后，将水凝胶在50％乙醇中用0.005％ stain-all(sigma)染过夜。水凝胶用10％乙醇滞留。
[0176]
gpc条件列举如下：
[0177]
hplc：waters 2695
[0178]
差示反射指数检测器：waters 2414
[0179]
流动相：0.2m nacl和0.01％叠氮化钠溶液
[0180]
流量：0.5ml/min
[0181]
柱：ultrahydrogel linear，7.8
×
300mm，wat011545，005c181201，编号knc-col-003。
[0182]
柱温箱温度35℃，检测器温度30℃。
[0183]
图4a-4b的结果表明，源自2.6mda ha(特性粘度超过1800ml/g)的ha-sh作为溶液不稳定。图4a的泳道2和4显示了未修饰ha的age结果，并且图4a的泳道1和3显示了ha-sh在反应后和以约1mg/ml的溶液对ph 4去离子水(用hcl调节ph值)透析1天后的age结果。结果
表明，反应后ha-sh的分子量是正常的，但在酸性条件下透析1天后，ha-sh的分子量增加，从靠近泳道3的孔出现弥散就可以看出。图4b的泳道2和3分别显示了ha-sh和未修饰的ha的另一个age结果。
[0184]
此外，如果ha-sh被冻干，则冻干粉不能再次溶解在溶液中，会形成凝胶。
[0185]
相反，ha-vs作为溶液长期稳定(图5)。
[0186]
实施例4低特性粘度[η]的经修饰聚合物的稳定性
[0187]
由约65kda([η]＝106ml/g)、670kda([η]＝1156ml/g)的ha和约45kda([η]＝20ml/g)的葡聚糖修饰而来的ha-sh和葡聚糖-sh(即dex-sh)用作显示低特性粘度聚合物的稳定性的实施例。如实施例2.2中所述制备ha-sh。如实施例2.3中所述制备dex-sh。样本的分子量稳定性通过gpc进行评估，并且测试方法如实施例3所述。
[0188]
聚合物的分子量(mw)和多分散性(pdi)通过与由聚(苯乙烯磺酸)钠盐聚合物标准生成的通用校准曲线进行比较来估计。
[0189]
聚合物在4℃下以ph 3的溶液形式储存。
[0190]
实施例4.1 15％ dm和65kda的ha-sh的稳定性
[0191]
15％ dm的ha-sh结果如表4所示。
[0192]
表4ha-sh在一段时间内的分子量
[0193]
[0194][0195]
令人惊讶的是，虽然溶液形式的ha-sh的储存条件与实施例3相似，但从表4可以看出，具有较低特性粘度的ha-sh作为溶液稳定至少60天。大约90天后，mw仅略有增加。图6展示表4聚合物的mw变化趋势和原始gps曲线的实施例。
[0196]
实施例4.2 25％ dm和65kda的ha-sh的稳定性。
[0197]
实施例4.1仅通过对低[η]聚合物进行修饰就显示了溶液中异常稳定的sh聚合物，我们进一步研究了在4℃下溶液中较高dm(10.16mg/ml)的sh聚合物是否可以稳定。
[0198]
表5ha-sh在一段时间内的分子量
[0199]
[0200][0201]
表5显示了25％ dm的65kda ha-sh的稳定性的实施例。结果表明，ha-sh的分子量稳定至少70天。图7展示表5聚合物的mw变化趋势和原始gps曲线的实施例。
[0202]
实施例4.3约5％和12.5％ dm的45kda葡聚糖-sh的稳定性。
[0203]
为了进一步证明具有低[η]的sh聚合物的稳定性，根据实施例2将约45kda的葡聚糖修饰为葡聚糖-sh。以5％和12.5％这两种葡聚糖-sh的dm为例。需要说明的是，葡聚糖是由单糖重复单元组成的聚合物，并且重复单元的分子量约为160da，而ha的二糖重复单元的分子量约为400da。因此，5％和12.5％ dm的葡聚糖-sh具有与12％和30％ dm的ha-sh相似的sh密度。
[0204]
研究结果展示于表6中。发现两种聚合物的分子量至少在180天内没有增加。图8展示表6聚合物的mw变化趋势和原始gps曲线的实施例。
[0205]
表6葡聚糖-sh在一段时间内的分子量
[0206]
[0207][0208]
4.4 16.4％ dm和670kda的ha-sh的稳定性。
[0209]
我们进一步研究了ha-sh具有670kda和[η]＝1156ml/g的稍高分子量和特性粘度的聚合物在4℃下在溶液(5.5mg/ml)中是否稳定。在本实施例中，聚合物的dm为16.4％。
[0210]
ha-sh在ph 3的稀hcl溶液中储存。我们发现聚合物在纯化后的第1天是稳定的。7天后，聚合物仍然大部分未交联，尽管可以看到一些较高的分子量部分。在14天时，可以在age中看到较高分子量的聚合物(如箭头所示)。在30天时，聚合物自行形成凝胶，表明有显著的自交联作用。结果(图13)表明，与2.6mda的ha-sh相比，该材料相对稳定。
[0211]
实施例5由经修饰的高[η]聚合物和经修饰的低[η]聚合物形成水凝胶
[0212]
ha-vs、ha-sh和葡聚糖-sh根据实施例2制备。首先确定ha-vs和ha-sh或葡聚糖-sh的浓度。将已知体积的聚合物溶液冷冻干燥，并测量聚合物的干重。干燥聚合物至少为4mg，以确保准确测量。或者，ha-vs和ha-sh的聚合物浓度通过先前所述的ctab测定法(oueslati等人,《测定复杂环境和交联形式下的透明质酸的ctab比浊法(ctab turbidimetric method for assaying hyaluronic acid in complex environments and under cross-linked form,)》carbohydrate polymers,2014)测量，葡聚糖-sh的聚合物浓度按照中国药典采用旋光仪测量。然后通过添加0.5m pb将已知浓度的ha-vs和ha-sh或葡聚糖-sh调节至ph 7.4。pb的最终浓度约为0.02m至0.05m。然后用25％ nacl调节渗透压。然后将聚合物以不同的目标体积比和质量比混合，并通过添加磷酸盐缓冲盐水(pbs)调节至目标最终浓度。
[0213]
聚合物在37℃温育24小时以形成水凝胶。水凝胶形成反应如图3所示。在温育期之后，首先在小心移液的帮助下目视检查水凝胶的凝胶形成。对于成功形成凝胶状结构的那些条件，将形成的水凝胶加载到anton paar流变仪的60mm锥板夹具(cp60-1/t1)的下板上，并测量机械特性(例如g’和g”)。与线性粘弹性区域(lvr)的g”值(例如，g’》g”)相比更高的g’值被用作水凝胶形成的客观指标。
[0214]
5.1由不同浓度的聚合物形成的水凝胶
[0215]
作为原理演示，将大[η]聚合物(在23％dm下2.6mda的ha-vs，[η]＝2960ml/g)与小[η]聚合物(在14％ dm下65kda的ha-sh，[η]＝106ml/g)如下混合：
[0216]
第1组：分别为0.64mg/ml的ha-sh和1.01mg/ml、0.81mg/ml、0.65mg/ml、0.52mg/ml、0.42mg/ml、0.33mg/ml的ha-vs。
[0217]
第2组：分别为0.43mg/ml的ha-sh和1.01mg/ml、0.81mg/ml、0.65mg/ml、0.52mg/ml、0.42mg/ml、0.33mg/ml的ha-vs。
[0218]
第3组：分别为0.34mg/ml的ha-sh和1.27mg/ml、1.01mg/ml、0.81mg/ml、0.65mg/ml、0.52mg/ml、0.41mg/ml的ha-vs。
[0219]
第4组：分别为0.28mg/ml的ha-sh和1.27mg/ml、1.01mg/ml、0.81mg/ml、0.65mg/ml、0.52mg/ml、0.41mg/ml的ha-vs。
[0220]
在5rad/s频率和5％应变下测量的g’和g”(每个配方的n＝3)显示在表7-10中。图
9-10显示了不同配方的g’变化趋势。这些结果表明，如果ha-vs浓度保持恒定，则机械特性会随着ha-sh浓度的降低而降低。如果ha-sh保持恒定，则机械特性会随着ha-vs浓度的降低而降低。可以通过调节两种凝胶形成聚合物的浓度来调节理想值的g’。当ha-vs的浓度低于其重叠浓度(c*)或约0.33mg/ml时，不会形成凝胶。重叠浓度可如下计算：
[0221]
c*＝1/[η]。
[0222]
表7 0.64mg/ml的ha-sh 65kda 14％ dm的凝胶形成
[0223][0224]
表8 0.34mg/ml的ha-sh 65kda 14％ dm的凝胶形成
[0225][0226][0227]
表9 0.43mg/ml的ha-sh 65kda 14％ dm的凝胶形成
[0228]
ha-vs浓度(mg/ml)ha-vs：ha-sh摩尔比g’(pa)sd(pa)g”(pa)sd(pa)1.011:10.70.9990.0040.2290.0030.811:13.50.6110.0010.1340.0020.651:16.80.3460.0020.1070.0020.521:20.90.1650.0020.0700.0020.421:26.20.0570.0020.0410.0010.331:32.4无凝胶
ꢀꢀꢀ
[0229]
表10 0.28mg/ml的ha-sh 65kda 14％ dm的凝胶形成
[0230]
ha-vs浓度(mg/ml)ha-vs：ha-sh摩尔比g’(pa)sd(pa)g”(pa)sd(pa)1.271:8.80.6490.0020.2930.0031.011:11.10.4280.0020.1890.002
0.811:13.80.2810.0020.1340.0020.651:17.20.1520.0020.0940.0010.521:21.50.0600.0020.0560.0020.411:26.7无凝胶
ꢀꢀꢀ
[0231]
通过使用大[η]聚合物(在23％dm下2.6mda的ha-vs，[η]＝2960ml/g)形成另一种水凝胶，并与低分子量小[η]聚合物(在16.4％ dm下670kda的ha-sh，像实施例2.2那样制备，[η]＝1156ml/g)混合。对于0.8mg/ml的ha-vs和0.4mg/ml的ha-sh的混合物(ha-vs和ha-sh之间的摩尔比为1:1.9)，形成水凝胶。
[0232]
通过使用大[η]聚合物(670kda的ha-vs，像实施例2.1那样制备，[η]＝1156ml/g)形成另一种水凝胶，并与低分子量小[η]聚合物(65kda的ha-sh，像实施例2.2那样制备，[η]＝106ml/g)混合。在本实施例中，ha-vs的浓度为2.5mg/ml，并且dm为40％。ha-sh的浓度为0.42mg/ml，并且dm为14.3％。ha-vs与ha-sh之间的摩尔比为1:1.7。在5％应变和1rad/s下，g’为0.96pa，并且g”为0.38pa。在另一实施例中，ha-vs的浓度为4mg/ml，并且dm为40％。ha-sh的浓度为0.08mg/ml，并且dm为14.3％。ha-vs与ha-sh之间的摩尔比为4.9:1。未形成凝胶。在另一实施例中，ha-vs的浓度为4mg/ml，并且dm为40％。ha-sh的浓度为0.16mg/ml，并且dm为14.3％。ha-vs与ha-sh之间的摩尔比为2.4:1。这种凝胶的机械特性如表11所示。
[0233]
表11凝胶的机械特性
[0234][0235]
5.2由具有不同dm的聚合物形成的水凝胶
[0236]
可改变小[η]聚合物的dm并且可以形成水凝胶。图11显示了通过混合1mg/ml下的23％dm的2.6mda ha-vs和14％或22％ dm的65kda ha-sh制成的水凝胶的g’值。用5rad/s频率和5％应变测量该值。配方范围如下：
[0237]
第1组：14％ dm的ha-sh，和约0.14mg/ml至约0.3mg/ml的ha-sh。
[0238]
第2组：22％ dm的ha-sh，和约0.14mg/ml至约0.3mg/ml的ha-sh。结果(图11)表明，当ha-vs保持恒定时，当ha-sh的浓度和dm降低时，水凝胶的机械强度降低。因此，可以通过调节水凝胶形成聚合物的dm和浓度来调节g’的理想值。
[0239]
5.3由葡聚糖-sh形成的水凝胶
[0240]
另一种小[η]聚合物，45kda(或[η]＝20ml/g)的葡聚糖-sh被用作另一个实施例。表12和图12显示了由大[η]聚合物(在23％ dm时2.6mda的ha-vs，[η]＝2960ml/g)和13％和5％dm的45kda(或[η]＝20ml/g)的葡聚糖-sh组成的不同配方的g’。配方范围如下：
[0241]
第1组：分别有0.81mg/ml的ha-vs，以及13％ dm和约0.1mg/ml至约0.35mg/ml的葡聚糖-sh。
[0242]
第2组：分别有0.81mg/ml的ha-vs，以及5％ dm和约0.1mg/ml至约0.35mg/ml的葡聚糖-sh。
[0243]
第3组：分别有0.65mg/ml的ha-vs，以及13％ dm和约0.1mg/ml至约0.35mg/ml的葡聚糖-sh。
[0244]
第4组：分别有0.65mg/ml的ha-vs，以及5％ dm和约0.1mg/ml至约0.35mg/ml的葡聚糖-sh。
[0245]
显示了在5rad/s频率和5％应变下的g’和g”值。这些结果表明，机械强度随着ha-vs浓度的降低而降低，随着葡聚糖-sh(dex-sh)修饰度的降低而降低，并且随着葡聚糖-sh浓度的降低而降低。可以通过调节水凝胶形成聚合物的dm和浓度来调节g’的理想值。
[0246]
表12凝胶的机械特性
[0247][0248][0249]
5.4由peg-sh形成的水凝胶
[0250]
通过使用大[η]聚合物(2.6md的ha-vs，像实施例2.1那样制备，[η]＝2960ml/g)形成另一种水凝胶，并与小[η]peg-硫醇(peg-sh)混合。
[0251]
通过使用大[η]聚合物(2.6md的ha-vs，像实施例2.1那样制备，[η]＝2960ml/g)形成另一种水凝胶，并与小[η]四臂peg硫醇(5kda，[η]～10ml/g，从商业购买中获得)混合。在本实施例中，ha-vs保持在0.8mg/ml，并且peg二硫醇为0.4mg/ml(样本1)、0.2mg/ml(样本2)
和0.1mg/ml(样本3)。在5％应变下测量的机械特性的实例如表13所示：
[0252]
表13凝胶的机械特性
[0253][0254]
实施例6测量由经修饰的高[η]聚合物和经修饰的低[η]聚合物形成的水凝胶的机械特性ha-vs、ha-sh和葡聚糖-sh根据实施例2制备。根据实施例5形成水凝胶并加载到流变仪中。出于说明目的，显示了如表14中所示的四种代表性水凝胶配方作为实施例。对于f1至f4，ha-vs与sh聚合物的摩尔比相应地为1:62、1:12、1:10、1:16。
[0255]
表14水凝胶的配方
[0256][0257]
测量了不同类型的机械测试模式下水凝胶的机械特性。测试的实例如图14至图17所示。
[0258]
图14a和图14b显示了频率扫描测试的结果。在该测试中，振荡应变保持在5％，并在不同的振荡频率下测量机械特性，例如g’和g”。该测试表明，尽管g’值非常低，但水凝胶是粘弹性固体而不是粘性液体，因为即使在低频下g’也高于g”。
[0259]
图15a和图15b显示了应变扫描测试的结果。在该测试中，振荡频率保持在5rad/s，并在不同的振荡应变下测量机械特性，例如g’和g”。该测试证明了水凝胶的线性粘弹性范围(lvr)。对于在低剪切应变(例如1％的f2和f4)下具有相似g’的水凝胶，它们在高应变(例如100％)下的行为可能不同。与f4相比，f2的弹性明显较小(例如g’～g”)。结果表明，不同应变下的弹性行为是可调的。
[0260]
图16a和图16b显示了步进应力测试的结果。在步进应力测试中，在材料上施加恒定的应力，并测量产生的应变。在该测试中，我们首先施加了60秒的恒定应力，然后是30秒的0pa(松弛)。之后，施加第二个恒定应力，然后再次松弛。四种应力，0.05pa、0.1pa、0.2pa和0.5pa逐步施加到水凝胶上。结果表明，该材料在低应力条件下确实是一种粘弹性固体，因为该材料的应变在每个应力下几乎保持恒定。如果该材料是粘性溶液，则应变响应预计会在施加的每个应力下以恒定速率增加。另一个显示水凝胶在低应力下的固体特性的证据是，当应力被移除(松弛)时，水凝胶或多或少地返回到具有弹性环的初始位置，类似于在瞬间移除负载后弹簧的弹跳运动。在我们的实施例中，大多数水凝胶在低应力水平下相对更
具弹性(应变更恒定，松弛更突出)，但在更高应力水平下相对更具粘性(应变增加，松弛不太突出)。在低应力下具有高弹性的水凝胶不一定对应于在高应力下的高弹性。例如，与其他水凝胶相比，f1在0.05pa时更具弹性(例如应变仅为10％)，但在0.5pa时更具粘性(例如应变率更高)。
[0261]
图17a和图17b是连续剪切测试的结果。在该测试中，材料的剪切粘度是在不同的剪切率下测量的。结果表明，随着剪切速率的增加，水凝胶的粘度降低。对于大多数水凝胶，在低剪切速率(例如0.1/s)下的剪切粘度至少为1000mpa
·
s，而在高剪切速率(例如1000/s)下的剪切粘度低于100mpa。相应地，f1、f2、f3和f4在0.1/s下的粘度约为4200mpa
·
s、1400mpa
·
s、8100mpa
·
s和2100mpa
·
s。相应地，f1、f2、f3和f4在1000/s下的粘度约为9mpa
·
s、23mpa
·
s、32mpa
·
s和30mpa
·
s。一些水凝胶在低剪切速率下具有较高的粘度，但在高剪切速率下具有较低的粘度，例如将f1与f2进行比较。
[0262]
实施例7马来酰亚胺修饰的透明质酸(ha-mi)的合成
[0263]
分子量为2.6mda的透明质酸(ha)从bloomage freda(中国济南)获得。
[0264]
n-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸(mi)和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(dmtmm)从aladdin biotechnology获得。
[0265]
将mi分子(15.10mg)添加到ha(24mg)于8ml的1mm pb中的溶液中。然后将约350μl的0.1m naoh添加到混合物中以将ph值调节至6.0，然后添加dmtmm(66.4mg)。ha中的-cooh与mi中的-nh2与dmtmm的摩尔比为1:1:4。在添加320μl的25％ nacl后，通过在50ml锥形管中的32ml乙醇中沉淀，在72小时内停止反应。通过以8000rpm离心5分钟并倾析上清液来分离沉淀物。将残余沉淀重新溶解在10ml的di中，并通过在4l的di中透析三天进一步纯化。每天更换两次透析缓冲液。透析后di中ha-mi的浓度为1.6mg/ml，dm为4.8％。
[0266]
实施例8从ha-mi形成水凝胶
[0267]
将实施例7中制备的ha-mi与65kda和11.6％ dm的ha-sh在磷酸盐缓冲液中混合。在约300mosm的0.02m磷酸盐缓冲盐水中，最终浓度为1.1mg/ml ha-mi、1mg/ml ha-sh。形成了水凝胶。
[0268]
实施例9将活物成分(api)封装在水凝胶中
[0269]
ha-vs、ha-sh和葡聚糖-sh根据实施例2制备。与实施例5类似地形成水凝胶，除了在水凝胶形成之前将粉末形式的api添加到聚合物混合物中。表15中显示了19种代表性的水凝胶配方，用于说明目的。根据实施例5测量的四种代表性配方的机械特性如表16所示。
[0270]
表15水凝胶的配方
[0271]
[0272][0273]
表16水凝胶的机械特性
[0274][0275]
实施例10从水凝胶中释放api
[0276]
莫西沙星从hetero drugs limited获得。左氧氟沙星从aladdin biotechnology获得。贝伐单抗从roche获得。改良的rna适体从synbio tech inc.获得。
[0277]
10.1莫西沙星的释放
[0278]
以下配方(表17)用于形成具有莫西沙星的水凝胶。
[0279]
表17具有莫西沙星的水凝胶的配方
[0280][0281]
根据实施例5形成水凝胶。在释放实验前，凝胶在37℃下温育2天。对于释放实验，在环境温度下，通过3ml一次性塑料移液管将一小部分凝胶(200-300μg)转移到5ml eppendorf管中。测量凝胶的质量用于最终的释放计算。然后用5ml的pbs溶液缓慢填充eppendorf管，以尽量减少对凝胶的干扰。释放实验在37℃下进行。在每个预定时间点(在这种情况下为0.1小时、1小时和2小时)，将试管轻轻摇动10秒并在环境温度下静置10分钟，然后取100μl释放缓冲液进行高效液相谱(hplc)定量。注射前，释放缓冲液用0.1m pb稀释10倍，并通过0.22μm注射器过滤器过滤。hplc使用由0.05m磷酸二钾/乙腈(82/18，v/v，ph＝3)组成的流动相在37℃下以1.0ml/min的流速进行。洗脱液流经ymc-park pro c18柱(4.6mm
×
150mm，3μm)，并且检测波长为293nm。使用莫西沙星作为标准品测量浓度，线性范围为2、5、10、25、50、100μg/ml。实验一式三份地进行。图18显示莫西沙星快速释放并持续约2小时。
[0282]
10.2左氧氟沙星的释放
[0283]
以下配方(表18)用于形成具有左氧氟沙星的水凝胶。具有左氧氟沙星的水凝胶按照10.1制备。使用左氧氟沙星作为标准品测量浓度，线性范围为2、5、10、25、50、100μg/ml。图19显示左氧氟沙星快速释放并持续约2小时。
[0284]
表18具有左氧氟沙星的水凝胶的配方
[0285][0286]
10.3igg蛋白的释放
[0287]
以下配方(表19)用于形成具有蛋白质药物贝伐单抗的水凝胶。
[0288]
表19具有贝伐单抗的水凝胶的配方
[0289][0290]
类似于实施例5形成水凝胶。贝伐单抗被用作蛋白质药物的例子。将含有25mg/ml
贝伐单抗的200μl avastin(购自roche，usa)与926μl的1.62mg/ml ha-vs和40.5μl的12.4mg/ml ha-sh以及200μl 0.5m磷酸盐缓冲液和适量的双重去离子水混合，得到根据表18的最终配方。在释放实验前，凝胶在37℃下温育2天。对于释放实验，在环境温度下，通过3ml一次性塑料移液管将一小部分凝胶(200-330μg)转移到10ml玻璃小瓶中，并测量质量以进行最终释放计算。用8ml释放缓冲液(含有40mm精氨酸的pbs溶液，ph值调节至7.4)缓慢填充玻璃小瓶，以尽量减少对凝胶的干扰。释放在37℃下进行。在每个预定时间点(在这种情况下为0.5小时、1小时、3小时、4.5小时、24小时和72小时)，将样本轻轻摇动10秒并在环境温度下静置10分钟，然后取400μl释放缓冲液进行hplc定量。注射前，释放缓冲液通过0.22μm注射器过滤器过滤。hplc使用由0.2m磷酸钾和0.25m氯化钾(ph＝6.2)组成的磷酸盐缓冲液在30℃下以0.5ml/min的流速进行。进样量为50μl的洗脱液依次流过vanguard cartridges holder柱和waters xbridge protein beh sec柱(7.8mm
×
300mm，200a，3.5μm)，并且检测波长为280nm。使用贝伐单抗作为标准品测量浓度，线性范围为12.5、25、50、100μg/ml。实验一式三份地进行。图20显示贝伐单抗在约5小时内迅速释放，并且持续释放约1-3天。
[0291]
10.4适体的释放
[0292]
以下配方(表20)用于形成具有基于rna的适体的水凝胶。
[0293]
表20具有适体的水凝胶的配方
[0294][0295]
类似于实施例5形成水凝胶。与哌加他尼(macugen)类似的具有以下核苷酸序列和官能团的适体被用作适体实例：cfgmgmaaufcfamgmufgmamamufgmcfufufamufamcfamufcfcfgm3’(seq id no:1)，5'端用6个碳(c6)封端，并且3'端用3'-dt-5'和cy3荧光染料封端。gm或am和cf或uf代表它们各自的嘌呤和嘧啶的2-甲氧基和2-氟变体，并且c、a、u和g编码胞苷酸、腺苷酸、尿苷酸和鸟苷酸。与实施例5类似地形成水凝胶，除了将凝胶形成之前的溶液以粉末形式添加到api中。在释放实验前，凝胶在37℃下温育2天。对于释放实验，在环境温度下，通过3ml一次性塑料移液管将一小部分凝胶(200-300μg)转移到10ml玻璃小瓶中，并测量质量以进行最终释放计算。用5ml的pbs溶液缓慢填充玻璃小瓶，以尽量减少对凝胶的干扰。释放在37℃下一式三份地进行。在每个预定时间点(在这种情况下为0.5小时、1小时、2小时和4小时)，将样本轻轻摇动10秒并在环境温度下静置10分钟，然后取1000μl释放缓冲液进行260nm下的uv定量。实验一式三份地进行。图21和图22显示适体迅速从水凝胶中释放出来并持续约4小时。
[0296]
虽然本文中已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域的技术人员将显而易见的是，这些实施方案仅作为实例提供。本发明并不意在受说明书中提供的具体实例的限制。尽管已经参照前述说明书描述了本发明，但本文中实施方案的描述和说明并不意味着被解释为具有限制意义。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将可以
想到许多变化、改变和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文阐述的具体描述、配置或相对比例，其取决于各种条件和变量。应当理解，在实施本发明时可以采用本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案。因此预期本发明还应涵盖任何这样的替代、修改、变化或等同物。以下权利要求旨在定义本发明的范围，并且这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同物由此被涵盖。

技术特征：

1.一种组合物，其包含至少一种具有第一反应性基团的第一聚合物和至少一种具有第二反应性基团的第二聚合物，其中，所述第一聚合物具有至少500ml/g的特性粘度[η]，所述第二聚合物具有低于所述第一聚合物并且小于1800ml/g的特性粘度[η]，并且所述组合物中的所述第一聚合物的浓度至多为约5mg/ml。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一聚合物能够与所述第二聚合物反应以形成水凝胶。3.根据权利要求1至2中任一项所述的组合物，其中所述第一聚合物和/或所述第二聚合物是亲水的和/或水溶性的。4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述第一聚合物和/或所述第二聚合物独立地选自由多糖、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、弹性蛋白、胶原蛋白、聚乙二醇、其衍生物及其任何组合组成的组。5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述第一聚合物和/或所述第二聚合物独立地选自由透明质酸、瓜尔胶、淀粉、壳聚糖、硫酸软骨素、藻酸盐、羧甲基纤维素、葡聚糖、其衍生物及其任何组合组成的组。6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述第一聚合物和/或所述第二聚合物独立地选自由透明质酸、葡聚糖、其衍生物及其任何组合组成的组。7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述第一聚合物包含第一聚合物衍生物，所述第一聚合物衍生物包含所述第一反应性基团，并且所述第一聚合物衍生物是亲电子的。8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述第一反应性基团选自由乙烯基、丙烯酰基、硫醇、烯烃、硫醇酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、卤代烷、磺酰卤、环氧化物、酰亚胺酯、氟苯基酯、碳酸酯、碳二亚胺、二硫化物、氮丙啶及其任何组合组成的组。9.根据权利要求7至8中任一项所述的组合物，其中所述第一反应性基团选自乙烯基砜、马来酰亚胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、环氧化物及其任何组合。10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述第二聚合物包含第二聚合物衍生物，所述第二聚合物衍生物包含所述第二反应性基团，并且所述第二聚合物衍生物是亲核的。11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述第二反应性基团选自由硫醇、胺、叠氮化物、酰肼、二烯、肼、羟胺及其任何组合组成的组。12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述第一聚合物具有约500,000至约5,500,000道尔顿的分子量。13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述第二聚合物具有约3,000至约800,000道尔顿的分子量。14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述组合物中所述第一聚合物和所述第二聚合物之间的分子量(mw)比为约500:1至约1.5:1。15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述组合物中所述第一聚合物和所述第二聚合物之间的回转半径(rg)比为约150:1至约1:1。16.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中所述组合物中所述第一聚合物和
所述第二聚合物之间的质量比为约20:1至约1:20。17.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述组合物中所述第一聚合物和所述第二聚合物之间的摩尔比为约4:1至约1:500。18.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物，其中所述第一聚合物具有约500ml/g至约5000ml/g的特性粘度[η]。19.根据权利要求1至18中任一项所述的组合物，其中所述第二聚合物具有约5ml/g至约1800ml/g的特性粘度[η]。20.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物中所述第一聚合物和所述第二聚合物的特性粘度之间的比率为约500:1至约1:1。21.根据权利要求7至20中任一项所述的组合物，其中所述衍生物具有约3％至约50％的平均修饰度(dm)。22.根据权利要求7至21中任一项所述的组合物，其中所述第一聚合物衍生物具有第一dm，所述第二聚合物衍生物具有第二dm，并且所述第一dm与所述第二dm之间的比率为约20:1至约1:20。23.根据权利要求7至22中任一项所述的组合物，其中所述第一聚合物衍生物是用一个或多个乙烯基砜基团修饰的葡聚糖衍生物、用一个或多个乙烯基砜基团修饰的透明质酸衍生物、用一个或多个马来酰亚胺基团修饰的透明质酸衍生物、或其组合，并且所述第二聚合物衍生物是用一个或多个硫醇基团修饰的葡聚糖衍生物、用一个或多个硫醇基团修饰的透明质酸衍生物、或其组合。24.根据权利要求7至23中任一项所述的组合物，其中所述第一聚合物和/或所述第二聚合物包含在形成的水凝胶形式的所述组合物中。25.根据权利要求1至24中任一项所述的组合物，其中所述组合物不包含任何不同于所述第一聚合物和/或所述第二聚合物的交联剂。26.一种由权利要求1至25中任一项的组合物形成的水凝胶。27.根据权利要求26所述的水凝胶，其是生物相容的。28.根据权利要求26至27中任一项所述的水凝胶，其具有以下特性中的至少一种：1)储能模量g’不超过5pa，如在5rad/s和5％应变下的动态振荡剪切测试中测量的；和2)粘度不超过约500mpa
·
s，如在超过约1000/s的剪切速率下的连续剪切测试中测量的，3)损耗模量g”不超过其储能模量g’的约100％，如在5rad/s和5％应变下的动态振荡剪切测试中测量的。29.一种生成水凝胶的方法，其包括：a)提供权利要求1至25中任一项的组合物；和b)使所述组合物经历能够形成所述水凝胶的条件。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述经历包括在约15℃至约50℃温育所述组合物。31.一种药物组合物，其包含权利要求26至28中任一项的水凝胶。32.根据权利要求31所述的药物组合物，其中所述水凝胶被配制成适合作为药物封装。33.根据权利要求31至32中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含药物，
并且所述药物被封装在所述水凝胶中。

技术总结

本公开提供了一种组合物，其包含具有至少500ml/g的高特性粘度[η]的第一聚合物和具有低于第一聚合物且小于1800ml/g的低特性粘度[η]的第二聚合物。更具体地，本公开提供了一种由该组合物形成的水凝胶和一种药物，以及一种用于生成水凝胶的方法。种用于生成水凝胶的方法。

技术研发人员：

余渝 周冠 孙哲逊

受保护的技术使用者：

科凝生物制药（深圳）有限公司

技术研发日：

2021.04.22

技术公布日：

2022/12/5