(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610596739.2
(22)申请日 2016.07.26
(71)申请人 西南大学
地址 400716 重庆市北碚区天生路2号
(72)发明人 彭远义 李能章 程蓉 李杜
赵益萍 刘舒萍
(74)专利代理机构 重庆博凯知识产权代理有限
公司 50212
代理人 张先芸
(51)Int.Cl.
G01N 33/569(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开一种牛源多杀性巴氏杆菌抗体
的间接ELISA检测试剂盒及其检测方法，所述试
剂盒包括用牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白
0230包被的固相载体、HRP标记的IgG酶标二抗、
释液、浓缩洗涤液、显液和终止液；所述方法采
用所述试剂盒进行检测，将待检测血清样品与固
相载体上包被的牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋
白0230接触和保温孵育，用HRP标记的IgG酶标二
抗特异地捕捉结合于0230蛋白抗原上的特异抗
体，并用显剂显，从而测定得到待检测血清
样品中针对0230蛋白的抗体水平。本发明检测试
剂盒及检测方法具有特异性好、敏感性高、重复
性好等特点。
权利要求书2页 说明书7页序列表2页 附图4页CN 106053807 A 2016.10.26
C N 106053807
A
1.一种牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括用牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230包被的固相载体、HRP标记的IgG酶标二抗、标准阳性对照血清、标准阴性对照血清、样品稀释液、浓缩洗涤液、显液和终止液；其中，所述牛源多杀性巴氏杆菌特异蛋白0230的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述标准阳性对照血清为犊牛感染牛源多杀性巴氏杆菌后的血清，标准阴性对照血清为未免疫和未感染多杀性巴氏杆菌的犊牛血清。
2.根据权利要求1牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230采用如下方法获得：以牛源多杀性巴氏杆菌荚膜血清A型CQ2菌株的DNA作为模板，利用设计合成的特异性引物进行PCR扩增，回收PCR扩增后的目的基因片段，将所述目的基因片段与原核表达载体pET30a连接，构建重组表达质粒pET30a-Pm0230，将重组表达质粒pET30a-Pm0230转化入大肠杆菌 E.coli BL21（DE3）感受态细胞，并采用异丙基硫代半乳糖苷诱导表达，将获得的表达产物经过His标签纯化柱纯化和透析除盐处理，获得所述牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230；所述特异性引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求1所述牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为含0.5 wt.% BSA、0.05 wt.% 吐温20、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L NaCl的PBS缓冲液，所述样品稀释液的pH为7.2。
4.根据权利要求1所述牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液为25×PBST 洗涤液。
5.根据权利要求1所述牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述显液为TMB，反应终止液为2 mol/L的硫酸溶液。
6.根据权利要求1所述牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述用牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230包被的固相载体采用如下方法制得：向固相载体中加入浓度为10 μg/mL的牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230溶液，于4 ℃包被过夜后，弃去所述牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230溶液，向固相载体中加入质量浓度为1 %的卵清蛋白溶液，于37 ℃下封闭1.5 h。
7.根据权利要求1所述牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述固相载体为96孔聚苯乙烯酶标板。
8.根据权利要求1所述牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述HRP标记的IgG酶标二抗为HRP标记的兔抗牛IgG酶标二抗。
9.一种牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，采用权利要求1~ 8任一所述牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒进行检测，将待检测血清样品与固相载体上包被的牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230接触和保温孵育，用HRP标记的IgG酶标二抗特异地捕捉结合于0230蛋白抗原上的特异抗体，并用显剂显，从而测定得到待检测血清样品中针对0230蛋白的抗体水平。
10.根据权利要求9所述牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
1）将待检测血清样品、标准阳性对照血清和标准阴性对照血清分别与样品稀释液按照1:100的体积比进行稀释，获得待检测血清样品稀释液、阳性对照血清稀释液和阴性对照血
清稀释液；
2）分别设置空白组、阳性标准组、阴性标准组和待检测血清样品组，所述空白组向用牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230包被的固相载体中加入100 μL样品稀释液，阳性标准组向用牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230包被的固相载体中加入100 μL所述阳性对照血清稀释液，阴性标准组向用牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230包被的固相载体中加入100 μL所述阴性对照血清稀释液，待检测血清样品组向用牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230包被的固相载体中加入100 μL所述待检测血清样品稀释液，将加样后的空白组、阳性标准组、阴性标准组和待检测血清样品组于37 ℃孵育反应90分钟；
3）步骤2）孵育结束后，弃去空白组、阳性标准组、阴性标准组和待检测血清样品组固相载体中的液体，用浓缩洗涤液分别洗涤各组固相载体若干次；
4）将HRP标记的IgG酶标二抗与样品稀释液按照1:500的体积比进行稀释，获得酶标二抗稀释液，分别向步骤3）洗涤后的空白组、阳性标准组、阴性标准组和待检测血清样品组固相载体中加入所述酶标二抗稀释液100 μL，于37℃孵育30分钟；
5）步骤4）孵育后，弃去各组固相载体中的液体，用浓缩洗涤液分别洗涤各组固相载体若干次；
6）分别向步骤5）洗涤后的各组固相载体中加入100 μL显液，于37 ℃下避光显反应10~15分钟；
7）步骤6）显反应结束后，分别向各组固相载体中加入终止液100 μL终止反应，并测定空白组、阳性标准组、阴性标准组和待检测血清样品组中液体在 D450nm 处的吸光度值，当阳性标准组 D450nm 值大于1.0，阴性标准组 D450nm 值小于0.30时，待检测血清样品组数据有效，待检测血清样品组 D450nm 值大于0.388时判断为阳性，即待检测血清样品中含有牛源多杀性巴氏杆菌抗体，待检测血清样品组 D450nm 值小于或等于0.388时判断为阴性，即待检测血清样品中不含有牛源多杀性巴氏杆菌抗体。
一种牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒及其
检测方法
技术领域
[0001]本发明涉及兽医生物制品领域，更具体的说是涉及基于特异蛋白的一种牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
[0002]牛多杀性巴氏杆菌（Bovine Pasteurella multocida，Pm）是一种引起牛发生出血性败血症或呼吸系统疾病的重要病原菌。多杀性巴氏杆菌根据其菌体荚膜抗原的不同，可分为A、B、D、E和F 5种荚膜血清型，其中对牛致病的荚膜血清型有A、B、E及F型；A和F型主要导致牛呼吸系统疾病，B和E型主要导致牛出血性败血症。以往我国流行的牛多杀性巴氏杆菌病主要由荚膜血清B型引起，自2008年以来，A型多杀性巴氏杆菌病在我国许多省市相继流行，给养牛业造成了重大经济损失。目前，国内外针对疾病诊断和疫苗效力的检测方法主要有病原分离鉴定、PCR检测技术、琼脂扩散试验、间接血凝试验以及ELISA试验等。PCR检测技术主要用于实验室研究，琼脂扩散试验和间接血凝试验敏感性较低， ELISA检测方法具有灵敏性高和易批量检测等优点。
[0003]对于疫病诊断与疫苗效力检测，其ELISA抗体检测试剂盒具有一定差异，用于疫病诊断的ELISA抗
体检测试剂盒要求靶标抗原特异（最好能区分感染抗体与免疫抗体，如不能区分则只能用于未免疫动物疫病诊断）；而用于疫苗效力检验的ELISA抗体检测试剂盒则要求所用靶标抗原为特异性保护性抗原，所检测抗体水平要与其免疫保护性呈现正相关性，传统疫苗中不是所有的抗原成分免疫产生的抗体水平都会与该疫苗的保护性呈现正相关，因此用于疫苗效力检测的ELISA抗体检测试剂盒的抗原选择就尤为重要。
[0004]目前我国尚无用于牛多杀性巴氏杆菌病血清流行病学调查和疫苗免疫效果评价的ELISA抗体检测试剂盒。因此，寻特异性抗原靶标，研制一种快速、敏感、特异的ELISA抗体检测试剂盒，以用于疫苗免疫效果评价和疫病血清流行病学调查，对于有效防控牛多杀性巴氏杆菌病具有重要意义。
发明内容
[0005]本发明目的在于解决现有技术的缺点和不足，针对目前国内没有商品化针对牛源多杀性巴氏杆菌抗体水平进行检测的检测试剂盒的技术问题，提供一种能有效评价牛源多杀性巴氏杆菌疫苗免疫效果及未免疫牛多杀性巴氏杆菌感染血清流行病学调查的牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒具有快速、特异、敏感、稳定等特点。
[0006]本发明的目的通过以下技术方案实现：一种牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，包括用牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230包被的固相载体、HRP标记的IgG酶标二抗、标准阳性对照
血清、标准阴性对照血清、样品稀释液、浓缩洗涤液、显液和终止液；其中，所述牛源多杀性巴氏杆菌特异蛋白0230的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所
示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述阳性对照血清为犊牛感染牛源多杀性巴氏杆菌后的血清，阴性对照血清为未免疫和未感染多杀性巴氏杆菌的犊牛血清。
[0007]一种牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测方法，采用上述牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒进行检测，将待检测血清样品与固相载体上包被的牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230接触和保温孵育，用HRP标记的IgG酶标二抗特异地捕捉结合于0230蛋白抗原上的特异抗体，并用显剂显，从而测定得到待检测血清样品中针对0230蛋白的抗体水平。
[0008]相比现有技术，本发明具有如下优点：
1、为了能够使本发明试剂盒能够全面对牛源A、B和F型多杀性巴氏杆菌的抗体进行检测，本发明从A型、B型及F型共有的200多个基因中筛选出32个候选基因，以这些基因翻译成蛋白的氨基酸序列调入NCBI数据库进行比较分析及抗原表位分析，根据其比对结果，综合分析其总得分值、覆盖率、同源性及抗原表位结果，筛选出0230基因，对筛选出的牛源多杀性巴氏杆菌0230的基因序列经克隆测序分析，显示其在牛源多杀性巴氏杆菌常见的不同血清型菌株中同源性高，保守性好，对其蛋白氨基酸序列进行分析，结果显示其在牛多杀性巴氏杆菌菌株基因组中具有高度同源性、保守性和通用性，能够对牛源A、B
和F型多杀性巴氏杆菌具有优异的特异性和保守性，能够用于牛源A、B和F型多杀性巴氏杆菌抗体的检测抗原。
[0009]2、本发明所用的包被抗原牛多杀性巴氏杆菌0230蛋白可通过基因工程克隆表达获得，生物安全性高；本发明所用抗原牛多杀性巴氏杆菌0230蛋白本身具有免疫保护作用，该蛋白产生的抗体持续时间较长，用该蛋白建立的ELISA试剂盒所检出的抗体水平与牛源多杀性巴氏杆菌疫苗免疫保护力及该蛋白免疫保护力呈现线性正相关，可用于牛源多杀性巴氏杆菌疫苗免疫抗体水平监测、疫苗免疫效果评价及未免疫牛多杀性巴氏杆菌感染血清流行病学调查，具有广阔的应用前景。
[0010]3、本发明采用筛选出的0230特异性蛋白包被固相载体，制备间接ELISA检测试剂盒，采用制得的检测试剂盒对牛源多杀性巴士杆菌抗体进行检测，该方法的检测原理为：向包被了0230蛋白的固相载体中加入待检测的牛血清样品，如果血清中含有牛源多杀性巴士杆菌特异性抗体时，抗体会与固相载体上的0230特异性蛋白抗原结合，然后加入能与特异性抗体键合的HRP标记兔抗牛IgG酶标二抗，再加入TMB显液，在HRP的催化作用下TMB显，颜反应的强度与血清样品中牛多杀性巴氏杆菌抗体含量呈正相关，可以通过酶标仪读数显示，判断待检测样品中抗体含量水平，来判断抗体的保护效果。
[0011]4、采用本发明方法对牛源多杀性巴士杆菌抗体进行检测，检测步骤方便操作，检测时间短，本发明方法检出限低、检测灵敏度高，对A型、B型、F型牛源多杀性巴氏杆菌均具有良好的特异性，且稳定性能好，方法重复性良好，检测结果真实可靠，误判率低。
附图说明
[0012]图1为0230基因表达产物的SDS-PAGE检测图，其中：M：蛋白Marker；a：诱导产物（方框标记处为目的基因表达的融合蛋白）。
[0013]图2为纯化的重组蛋白0230 SDS-PAGE检测图；其中：M：蛋白Marker；a：纯化的融合蛋白。
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