(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810522074.X
(22)申请日 2018.05.25
(71)申请人 广州永诺生物科技有限公司
地址 510000 广东省广州市广州国际生物
岛螺旋三路6号4楼
申请人 广东顺德永诺生物科技有限公司
(72)发明人 赖炳权 许少飞 李伟琴 罗景燕
苏普霞 李祎予
(74)专利代理机构 广州三环专利商标代理有限
公司 44202
代理人 郝传鑫 周全英
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6886(2018.01)
C12N 15/11(2006.01)
(54)发明名称人EGFR基因T790M位点检测的引物、探针、PCR反应液和试剂盒(57)摘要本发明涉及一种人EGFR基因T790M位点检测的引物、探针、PCR反应液和试剂盒，属于分子生物学领域。本发明引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；本发明探针包括针对人EGFR基因T790M位点的突变型探针和野生型探针，所述突变型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述野生型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述突变型探针和野生型探针的5’端标记有不同的荧光报告基团，3’端均标记有非荧光淬灭基团并连接有MGB修饰基团；所述突变型探针和野生型探针的至少一个碱基还进行锁核酸修饰。本发明引物扩增特异性和灵敏度度均较高；本发明探针为LNA修饰的TaqMan MGB探针，MGB可以将探针的Tm值提高10℃左右，且LNA修饰探针，提高了PCR反应中DNA分子的稳定性和亲和力， 增加特异性和灵敏度。
权利要求书1页 说明书6页序列表1页 附图2页CN 108728536 A 2018.11.02
C N 108728536
A
1.人EGFR基因T790M位点检测的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
2.人EGFR基因T790M位点检测的探针，其特征在于，包括针对人EGFR基因T790M位点的突变型探针和野生型探针，所述突变型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述野生型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述突变型探针和野生型探针的5’端标记有不同的荧光报告基团，3’端均标记有非荧光淬灭基团并连接有MGB修饰基团；所述突变型探针和野生型探针的至少一个碱基还进行锁核酸修饰。
3.如权利要求2所述的人EGFR基因T790M位点检测的探针，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM、TET、VIC或HEX；所述非荧光淬灭基团为NFQ。
4.如权利要求2或3所述的人EGFR基因T790M位点检测的探针，其特征在于，所述突变型探针的第7和第11个碱基进行锁核酸修饰，所述野生型探针的第7个碱基进行锁核酸修饰。
5.如权利要求1所述引物和/或如权利要求2～4任一项所述探针在制备用于检测人EGFR基因T790M位点的试剂盒或PCR反应液中的应用。
6.人EGFR基因T790M位点检测的PCR反应液，其特征在于，包括如权利要求2～4任一项所述探针以及如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物。
7.如权利要求6所述的人EGFR基因T790M位点检测的PCR反应液，其特征在于，还包括用于微滴数字PCR的PCR预混液。
8.如权利要求7所述的人EGFR基因T790M位点检测的PCR反应液，其特征在于，所述PCR 反应液中，如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物的浓度均为20μm/L，所述突变型探针和野生型探针的浓度均为10μm/L。
9.人EGFR基因T790M位点检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求6～8任一项所述PCR反应液。
10.如权利要求9所述的人EGFR基因T790M位点检测的试剂盒，其特征在于，还包括DNA 提取试剂。
权 利 要 求 书1/1页CN 108728536 A
人EGFR基因T790M位点检测的引物、探针、PCR反应液和试剂盒
技术领域
[0001]本发明涉及一种人EGFR基因T790M位点检测的引物、探针、PCR反应液和试剂盒，属于分子生物学领域。
背景技术
[0002]肺癌是各种肺部恶性肿瘤的统称，分为两类小细胞肺癌(small cell lung carcinoma,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)，非小细胞肺癌约占所有肺癌病例的80％以上，包括两大类：1)非鳞癌(包括腺癌、大细胞癌及其他亚型)；2)鳞状细胞(表皮样)癌。肺癌是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，位居我国城市人口恶性肿瘤死亡原因之首。
[0003]恶性肿瘤的包括化学和靶向，传统的肿瘤化学存在靶向不明确，选择性不强和易产生耐药等特点，导致在其有效率低和在杀伤肿瘤细胞的同时损害正常组织细胞等缺点。靶向是指抗肿瘤药物靶向性地与肿瘤的不同特性靶标位点发生作用而杀死肿瘤细胞，靶向对正常组织影响较小。近年来，肿瘤策略产生革命性的变化即肿瘤的个体化。肿瘤个体化是根据每个个体肿瘤生物学特征以及基因组学和转录组学上的差异进行针对性的，使疗效最大化和毒性最低化。目前靶向无疑是肺癌有效且毒性较低的手段。
[0004]表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一种跨膜酪氨酸激酶受体，该受体激酶域激活与癌细胞增殖、转移和凋亡等多种信号传导通路有关。肺腺癌患者EGFR基因敏感突变亚裔人阳性率要高于高加索人。EGFR突变主要发生在胞内酪氨酸激酶(TK)区域的前四个外显子上(18～21)，目前发现的TK区域突变有30多种。一代的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)吉非替尼、厄洛替尼、埃可替尼，二代的阿法替尼，对于EGFR基因敏感突变的晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者，在无进展生存(progressionfree survival,PFS)、有效率方面，与传统化疗相比均有明显延长，同时患者生存质量及耐受性较好。然而，通常在靶向后，患者会不可避免的出现获得性耐药。
[0005]其中，以20号外显子上的T790M突变最为常见。针对EGFR基因T790M突变的定量检测可更精准指导临床，T790M的突变丰度与EGFR-TKI与预后有关，因此EGFR基因T790M 突变检测已成为NSCLC患者明确耐药机制和调整方案必须参考的重要指标。
[0006]目前基因突变的检测技术主要有sanger测序、高通量测序、ARMS-PCR检测、数字PCR检测。sanger测序、高通量测序、ARMS-PCR检测这三种技术均为定性检测，灵敏度比较差。数字PCR采用绝对定量的方式，不依赖于标准曲线和参照样本，直接检测目标序列的拷贝数，这种检测方式具有更高的灵敏度和特异性、准确性。
发明内容
[0007]本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种特异性和灵敏度均较高的人EGFR基因T790M位点检测的引物、探针、PCR反应液和试剂盒。
[0008]为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
[0009]第一方面，本发明提供了人EGFR基因T790M位点检测的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
[0010]上述引物是针对人EGFR基因T790M位点设计的对目的区域进行特异扩增的特异引物。根据引物设计原理，针对人EGFR基因T790M位点所设计出的能对目的区域扩增的引物可有多组，并不限于本发明所述特定的引物。但发明人发现在众多引物中，本发明的引物扩增特异性和灵敏度度均较高，故从众多引物中选择出该特定引物。
[0011]第二方面，本发明提供了人EGFR基因T790M位点检测的探针，其包括针对人EGFR基因T790M位点的突变型探针和野生型探针，所述突变型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述野生型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述突变型探针和野生型探针的5’端标记有不同的荧光报告基团，3’端均标记有非荧光淬灭基团并连接有MGB修饰基团；所述突变型探针和野生型探针的至少一个碱基还进行锁核酸(LNA)修饰。
[0012]本发明探针采用的淬灭基团是非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，其本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。
[0013]本发明的探针是锁核酸(LNA)修饰的TaqMan MGB特异探针。锁核酸(LNA)是一种特殊的双环状核苷酸衍生物，结构中含有一个或多个2'-O，4'-C-亚甲基--D-呋喃核糖核酸单体，核糖的2'-O位和4'-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3'-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性，提高了PCR反应中DNA分子的稳定性和亲和力，增加特异性和灵敏度。
[0014]小沟结合物(minor groove binder，简称MGB)是源于某些抗菌素分子的化学基团，其能嵌入DNA双螺旋结构中的小沟形成非共价结合，一般可以将寡核普酸的Tm值提高10℃左右，可以缩短引物或探针的长度，提高特异性和给设计带来方便。MGB使得探针设计的成功率大为提高，还降低了成本。
[0015]作为本发明所述人EGFR基因T790M位点检测的探针的优选实施方式，所述荧光报告基团为FAM、TET、VIC或HEX；所述非荧光淬灭基团为NFQ。
[0016]作为本发明所述人EGFR基因T790M位点检测的探针的优选实施方式，所述突变型探针的第7和第11个碱基进行锁核酸修饰，所述野生型探针的第7个碱基进行锁核酸修饰。[0017]第三方面，本发明还提供了上述引物和/或上述探针在制备用于检测人EGFR基因T790M位点的试剂盒或PCR反应液中的应用。
[0018]第四方面，本发明提供了人EGFR基因T790M位点检测的PCR反应液，其包括上述探针以及如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物。
[0019]作为本发明所述人EGFR基因T790M位点检测的PCR反应液的优选实施方式，所述PCR反应液还包括用于微滴数字PCR的PCR预混液Master Mix。
[0020]作为本发明所述人EGFR基因T790M位点检测的PCR反应液的更优选实施方式，所述PCR反应液中，如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物的浓度均为20μm/L，所述突变型探针和野生型探针的浓度均为10μm/L。
[0021]第五方面，本发明提供了人EGFR基因T790M位点检测的试剂盒，其包括上述PCR反应液。
[0022]作为本发明所述人EGFR基因T790M位点检测的试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括DNA提取试剂。
[0023]作为本发明所述人EGFR基因T790M位点检测的试剂盒的优选实施方式，所述DNA提取试剂为Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit。
[0024]人EGFR基因T790M位点可通过微滴数字PCR的方法进行检测，本发明人EGFR基因T790M位点微滴数字PCR检测的方法为：
[0025](1)从待测样品中提取DNA作为模板，模板浓度20ng/μl～50ng/μl；
[0026](2)配制上述人EGFR基因T790M位点检测的PCR反应液；
[0027](3)以步骤(1)提取的DNA为模板，配制人EGFR基因T790M位点微滴数字PCR检测的PCR特异扩增反应体系；
[0028](4)通过Creator微滴生成仪将PCR特异扩增反应体系生成微滴；
[0029](5)进行数字PCR扩增，扩增的反应程序为：95℃，10分钟1个循环；94℃，30秒变性，60℃，60秒退火、延伸共进行40个循环；98℃，10分钟1个循环；4℃保持；
[0030](6)使用Detector微滴检测仪检测荧光信号，采用MicroDrop TM数字PCR仪配套数据分析软件(MD Plotter数据分析软件)计算给出带检靶分子的拷贝数。
[0031]微滴数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术，其原理为：标准PCR反应体系经过微滴发生后，每个微滴包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，实现“单分子模板PCR扩增”，经过PCR循环后之后，含有核酸分子模板的微滴会给出荧光信号，没有模板的微滴就没有荧光信号产生。最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，采用MicroDrop TM 数字PCR仪配套数据分析软件(MD Plotter数据分析软件)可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。数字PCR可以直接计算目标序列的拷贝数，因此无需
依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测；此外，由于数字PCR在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态，因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，因此数字PCR的反应受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高；数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度。计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。
[0032]与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0033](1)本发明使用锁核酸(LNA)修饰的TaqMan MGB探针，探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度；同时探针上还连接有MGB修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右，使得探针设计的成功率大为提高，降低成本；并且，锁核酸(LNA)修饰探针，提高了PCR反应中DNA分子的稳定性和亲和力，增加特异性和灵敏度。总之，采用本发明特定的探针，可提高特异性和灵敏度。[0034](2)与同有的技术相比，微滴数字PCR采用绝对定量的方式，不依赖于标准曲线和参照样本，直接检测目标序列的拷贝数，这种检测方式具有更高的灵敏度和特异性、准确性，为肺癌个体化精准用药指导、药效评估以及疗效检测提供了重要的参考依据。[0035](3)本发明适用于肿瘤新鲜冰冻组织、石蜡包埋组织及低浓度的血液循环游离核酸中的EGFR基因T790M突变的检测；为NSCLC晚期患者明确耐药机制和调整方案提供参
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