(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910326879.1
(22)申请日 2019.04.22
(71)申请人 成都医学院
地址 610000 四川省成都市金牛区蓉都大
道天回路601号
(72)发明人 邓珊珊 贾旭 刘超
(74)专利代理机构 成都高远知识产权代理事务
所(普通合伙) 51222
代理人 李高峡 张娟
(51)Int.Cl.
C12Q 1/689(2018.01)
C12Q 1/686(2018.01)
C12Q 1/04(2006.01)
C12N 15/11(2006.01)
C12R 1/01(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明提供了一种检测鲍曼不动杆菌的PCR
试剂盒，所述试剂盒包括多重PCR引物，其序列分
别如SEQ ID NO.1～2、SEQ ID NO.3～4、SEQ ID
NO.5～6所示。本发明通过合理的引物搭配，能排
除大肠埃希菌、金黄葡萄球菌、铜绿假单胞菌
和肺炎克雷伯菌的干扰，实现鲍曼不动杆菌的特
异性检测。本发明还具有很高的检测灵敏度，当
样品中的鲍曼不动杆菌DNA浓度低至1pg/μL时，
仍能检测到鲍曼不动杆菌。权利要求书1页 说明书5页序列表2页 附图3页CN 110004241 A 2019.07.12
C N 110004241
A
1.一种检测鲍曼不动杆菌的PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括多重PCR引物，其序列分别如SEQ ID NO.1～2、SEQ ID NO.3～4、SEQ ID NO.5～6所示。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述检测鲍曼不动杆菌的PCR试剂盒还包括Taq聚合酶、dNTP、MgCl 2、PCR缓冲液、去离子水。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测鲍曼不动杆菌的PCR试剂盒还包括鲍曼不动杆菌DNA阳性对照品。
4.如权利要求1～3任一所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)DNA提取；
2)PCR反应；
3)电泳检测PCR产物；
若步骤3)检测到3个条带，即判断为检测到鲍曼不动杆菌。
5.如权利要求4所述的使用方法，其特征在于，所述PCR反应的条件为：在94℃下预变性5min后，进行一下扩增循环：在94℃下变性30s，在55℃下退火30s，在72℃延伸30s，反应30个循环，最后在72℃延伸5min。
6.如权利要求4所述的使用方法，其特征在于，所述电泳是在1.5％的琼脂糖胶中进行的电泳。
7.如权利要求4所述的使用方法，其特征在于，所述3个条带的大小分别为191、347、524bp。
权 利 要 求 书1/1页CN 110004241 A
一种检测鲍曼不动杆菌的PCR试剂盒
技术领域
[0001]本发明涉及分子检测领域，尤其涉及一种检测鲍曼不动杆菌的PCR试剂盒。
背景技术
[0002]不动杆菌属(Acinetobacter)为一严格需氧型革兰氏阴性球杆菌，目前该菌属至少包含33个基因种，其中，最主要的感染菌种是鲍曼不动杆菌，约占72.9％。鲍曼不动杆菌广泛分布于自然界中，是引起多种院内感染的重要致病菌。其危险因素包括呼吸机依赖、机械通气、气管插管、侵入性操作、ICU环境、医务工作者手的交叉感染等。鲍曼不动杆菌患者死亡率高，预后差，可引起院内众多感染包括医院获得性肺炎尤其是呼吸机相关性肺炎，血液，泌尿道，伤口感染脑膜炎等，常有较高的死亡率和发病率。由于医院重症监护室里患者的免疫力与抵抗力低下，极易引发多重耐药鲍曼不动杆菌的感染与流行，甚至可能爆发院内感染，给临床带来相当大的困难。
[0003]目前，大量的临床资料表明，快速准确确诊病原菌，给予合理而规范的抗生素，对于节省时间和确定最佳方案是非常重要的。
[0004]传统的药敏性实验通常会耗费2、3天时间，会严重耽搁的进程和效果。
发明内容
[0005]为了解决上述问题，本发明提供了一种检测鲍曼不动杆菌的PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括多重PCR引物，其序列分别如SEQ ID NO.1～2、SEQ ID NO.3～4、SEQ ID NO.5～6所示。
[0006]如前所述检测鲍曼不动杆菌的PCR试剂盒，它还包括Taq聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR 缓冲液、去离子水。
[0007]如前所述的试剂盒，所述检测鲍曼不动杆菌的PCR试剂盒还包括鲍曼不动杆菌DNA 阳性对照品。
[0008]本发明还提供了前述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
[0009]1)DNA提取；
[0010]2)PCR反应；
[0011]3)电泳检测PCR产物；
[0012]若步骤3)检测到3个条带，即判断为检测到鲍曼不动杆菌。
[0013]如前述的使用方法，所述PCR反应的条件为：在94℃下预变性5min后，进行一下扩增循环：在94℃下变性30s，在55℃下退火30s，在72℃延伸30s，反应30个循环，最后在72℃延伸5min。
[0014]如前述的使用方法，所述电泳是在1.5％的琼脂糖胶中进行的电泳。
[0015]如前述的使用方法，所述3个条带的大小分别为191、347、524bp。
[0016]本发明通过合理的引物搭配，能排除大肠埃希菌、金黄葡萄球菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌的干扰，实现鲍曼不动杆菌的特异性检测。
[0017]本发明还具有很高的检测灵敏度。当样品中的鲍曼不动杆菌DNA浓度低至1pg/μL 时，仍能检测到鲍曼不动杆菌。
[0018]显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。[0019]以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0020]图1为本发明实施1中多重PCR产物16S-23S rRNA(大小为191bp)基因测序和BLAST 比对结果。
[0021]图2为本发明实施1中多重PCR产物recA(大小为347bp)基因测序和BLAST比对结果。
[0022]图3为本发明实施1中多重PCR产物gyrB(大小为524bp)基因测序和BLAST比对结果。
[0023]图4是本发明引物的特异性检测和多重体系的特异性检测电泳图：其中泳道M为DNA标准分子量标记；泳道1为扩增出191bp16S-23S rRNA产物；泳道2为扩增出的347bp recA产物；泳道3为扩增出的524bp gyrB产物；泳道4同时扩增出191bp、347bp和524bp产物。[0024]图5为本发明中多重PCR法的特异性检测结果：其中泳道M为DNA标准分子量标记；泳道1的模板为鲍曼不动杆菌，泳道2的模板为金黄葡萄球菌，泳道3的模板为铜绿假单胞菌，泳道4的模板为肺炎克雷伯菌，泳道5的模板为大肠埃希菌。 [0025]图6为本发明中多重PCR对鲍曼不动杆菌的最低检出限试验结果：其中泳道M为DNA 标准分子量标记；泳道1的模板为鲍曼不动杆菌的DNA，即含细菌基因组DNA10ng/μL，泳道2的模板含细菌基因组DNA lng/μL，泳道3的模板含细菌基因组DNA100pg/μL，泳道4的模板含细菌基因组DNA10pg/μL，泳道5的模板含细菌基因组DNA 1pg/μL，泳道6的模板含细菌基因组DNA 100fg/μL。
具体实施方式
[0026]实施例1多重PCR检测鲍曼不动杆菌
[0027] 1.方法
[0028] 1.1待检样品制备
[0029]随机选取鲍曼不动杆菌200株。所有菌株的种类均采用法国生物梅里埃公司VITEK2-Compact全自动细菌鉴定及姚敏仪再次鉴定，鉴定结果与所取菌株类型一致。[0030]将鉴定后的细菌培养于血平板，待生长至单个菌落后，用takara的MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0抽提细菌基因组，作为多重PCR的模板。[0031] 1.2检测
[0032]使用3对引物(如表1所示)对鲍曼不动杆菌进行PCR检测(包括单引物对扩增和多重PCR扩增)，具体方法如下：2×Taq Master Mix10μL，dd H2O 6μL，3对正反方向引物各0.5μL(10umol/L)，模板1μL；PCR扩增条件为：95℃预变性5min95℃变性30sec，55℃退火30sec，
72℃延伸30sec，共30个循环；72℃再延伸5min。然后通过1.5％琼脂糖凝胶电泳分析反应结果。同时将PCR产物送生物公司测序。
[0033]表1参考引物
[0034]
[0035] 2.结果
[0036]多重PCR反应产物进行琼脂糖电泳检测发现，多重耐药鲍曼不动杆菌同时含有191bp(16S-23S rRNA间隔区间)，347bp(recA)和524bp(gyrB)三个条带；单引物对的扩增分别出现前述条带中的一个(图4)。
[0037]多重PCR反应191bp大小产物基因测序结果如SEQ.NO.ID.7所示：
[0038]
[0039]多重PCR反应347bp大小产物基因测序结果如SEQ.NO.ID.8所示：
[0040]
[0041]多重PCR反应524bp大小产物基因测序结果如SEQ.NO.ID.9所示：
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