拉帕替尼-癌细胞干性抑制剂偶联物、制法、药物组合物和应用

1.本发明涉及一类拉帕替尼-癌细胞干性抑制剂偶联物、制法、药物组合物和应用，尤其涉及一类可制备为癌症物的拉帕替尼-癌细胞干性抑制剂偶联物、制法、药物组合物和应用。

背景技术：

2.据世界卫生组织国际癌症研究机构发布的全球最新癌症统计数据，2020年全球新发乳腺癌患者226万例，首次超过肺癌(221万例)成为全球第一大癌症。中国是乳腺癌大国，当年新发乳腺癌约42万例，近12万患者死亡。其中，转移性三阴乳腺癌(tnbc)因缺乏有效的靶点，具有易复发、转移和对激素疗法与靶向不敏感的特点，表现出较高的死亡率。通常针对tnbc早期能用的方法一般只有化疗，不过大多数患者很快会产生耐药，导致愈后不佳。随着科学技术的不断进步和医疗水平的不断提高，针对乳腺癌临床病理的个体化特点，医药研究者已研发出一些新的方法。尽管这些新的方法已被广泛应用，但是许多tnbc患者治愈后仍会复发，长期死亡率居高不下，这表明目前对tnbc的仍具有高度的不确定性。现在普遍接受的观点是乳腺癌的瘤内异质性导致了肿瘤耐药、转移、复发和高死亡率。
3.tnbc瘤内异质性是由被称为乳腺癌干细胞(bcscs)的肿瘤细胞亚所驱动的。与一般的癌细胞不同，bcscs是一种具有持续自我更新、分化和高致瘤的肿瘤细胞亚，在肿瘤发生、耐药、复发、侵袭、转移等过程中发挥关键作用。更糟糕的是，大多数临床化疗药物bcscs时，不仅会增加已有的bcscs标志物的表达，而且还会促进非干细胞向bcscs的转化。
4.表皮生长因子受体(egfr)，是一种参与细胞生长和生存的酪氨酸激酶受体，它参与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移和细胞凋亡等过程。据统计，有大约50％的tnbc患者过度表达egfr，导致患者体内雌激素减少和不良愈后。前期研究已经证实，由于基因突变和某些蛋白的过度表达，能够导致癌细胞中egfr异常激活，特别是tnbc细胞不受控制的增殖、转移、侵袭和耐药。然而，仅基于激酶抑制剂或单克隆抗体的egfr在tnbc中难以起到有效的效果。拉帕替尼(lapatinib)是一种靶向her2和egfr的小分子酪氨酸激酶抑制剂，被用于晚期或转移性乳腺癌。最新研究表明，拉帕替尼具有一定的抑制癌细胞干性的能力，但是抑制活性较弱，单独给药难以起到疗效。

技术实现要素：

5.发明目的：本发明的第一目的是提供一类拉帕替尼-癌细胞干性抑制剂偶联物或其药学上可接受的盐，第二目的是提供所述偶联物或其药学上可接受的盐的制备方法，第三目的是提供一类包含所述偶联物和/或其药学上可接受的盐的药物组合物，第四目的是提供所述偶联物或其药物组合物在制备癌症或逆转耐药物中的应用。
6.技术方案：本发明的拉帕替尼-癌细胞干性抑制剂偶联物具有式(i)的结构，所述衍生物为所述化合物的异构体、非对映异构体、对映异构体、互变异构体、溶剂化物、溶剂化物的盐、药学上可接受的盐或它们的混合物：
[0007][0008]
其中：
[0009]
为
[0010]
r为氯或三氟甲基；
[0011]
n为1或2。
[0012]
本发明通过在已知乳腺癌靶向药物拉帕提尼的母体结构中经酰胺键和酯键引入具有抑制癌细胞干物的衍生物，提供一类拉帕替尼与癌细胞干性抑制剂的偶联物。该类化合物具有明显的抗癌活性，且被发现可以有效抑制癌细胞干性，实现了优异的协同增效作用。
[0013]
优选，所述偶联物结构中：
[0014]
r为氯。
[0015]
更具体地，所述偶联剂为以下任一化合物：
[0016][0017]
进一步地，所述偶联物与酸或碱形成药学上可接受的盐，其中所述酸为盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、马来酸、琥珀酸、富马酸、水杨酸、苯基乙酸或杏仁酸，所述碱为含有碱性金属阳离子、碱土金属阳离子或铵阳离子盐的无机碱。
[0018]
本发明的偶联物或其药学上可接受的盐的制备方法为：
[0019]
化合物1～2中的任一化合物与化合物3～5中的任一化合物，经酯化反应得到偶联
物(i)；
[0020][0021]
将相应的酸或碱加入到以上方法制备的偶联物(i)的溶液中，成盐完全后除去溶剂，即得所述偶联物的药学上可接受的盐。
[0022]
其中，所述化合物5的制备方法为：
[0023]
3-丁烯-2-酮经溴代反应得到1,2-二溴丁酮，接着与2-羟基-1,4-萘醌进行亲核取代反应，然后经环合、氧化和还原反应得到化合物5。
[0024][0025]
化合物3～4的制备方法为：
[0026]
以2-氯吩噻嗪(奋乃静)和2-(三氟甲基)吩噻嗪(氟奋乃静)为原料分别与1-溴-3-氯丙烷发生取代反应得到中间体，然后再和1-(2-羟乙基)哌嗪发生取代反应得到产物。
[0027][0028]
其中，当r＝cl时，所得产物为化合物3；当r＝cf3时，所得产物为化合物4。
[0029]
本发明的药物组合物包含所述偶联物和/或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。
[0030]
所述偶联物和/或其药学上可接受的盐可以添加药学上可接受的载体制成常见的药用制剂，如片剂、胶囊、糖浆、悬浮剂或注射剂，制剂可以加入香料、甜味剂、液体/固体填料、稀释剂等常用药用辅料。
[0031]
本发明的偶联物或其药学上可接受的盐以及本发明的药物组合物在制备癌症或逆转耐药物中的应用；所述癌症为乳腺癌，尤其是三阴性乳腺癌。
[0032]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
[0033]
(1)该类偶联物在分子水平和细胞水平均具有显著的抗癌活性，最优达到纳摩尔浓度酶抑制级别；可以有效提升母体化合物拉帕替尼的细胞毒性，并且可以有效抑制癌细胞干性；而且还可以逆转拉帕替尼介导的细胞耐药，降低对正常细胞的毒性，具有制备为乳腺癌药物的潜力；
[0034]
(2)该类偶联物和药物组合物应用广泛，可制备为癌症或逆转耐药性的药物；所述药物在分子水平和细胞水平均可以发挥药效，并且效果更优异；
[0035]
(3)该类偶联物合成方法简便，易操作。
附图说明
[0036]
图1为蛋白质印迹法分析细胞内egfr及下游信号通路相关蛋白的表达水平；
[0037]
图2中：(a)所测化合物对外源性aldh1a1酶活性的抑制曲线；(b)qrt-pcr定量分析mda-mb-231/lapatinib细胞内aldh1a1基因的转录水平；
[0038]
图3为免疫蛋白印迹分析mda-mb-231/lapatinib细胞内干性相关蛋白表达水平；
[0039]
图4为qrt-pcr分析mda-mb-231/lapatinib
cd44+
细胞内cscs表面抗原转录水平；
[0040]
图5中：(a)mda-mb-231/lapatinib
cd44+
细胞来源的肿瘤球体积；(b)mda-mb-231/lapatinib
cd44+
细胞来源的肿瘤球数量。
具体实施方式
[0041]
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
[0042]
所有试剂均为分析纯，化合物结构表征所用的核磁数据由bruker arx-600核磁共振仪测定，内标为tms；高分辨质谱采用agilent6224 tof lc/ms仪测定。
[0043]
实施例1：中间体的合成
[0044]
(1)化合物1～2的合成
[0045][0046]
化合物1的合成：称取0.6g(1.0mmol)拉帕替尼、0.2g(1.5mmol)丁二酸酐、0.2g(2.0mmol)三乙胺和15ml二氯甲烷置于50ml茄形瓶内，室温搅拌过夜，tlc检测至反应完全。减压浓缩除去多余溶剂，再加入30ml水，60℃下搅拌2h，抽滤，滤饼用水冲洗三次(10ml
×
3)，得到化合物1的粗产物，用10ml甲醇重结晶，得到亮黄固体产物0.64g,产率94.0％。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ12.24(s,1h),10.01(d,j＝23.4hz,1h),8.77(d,j＝23.3hz,1h),8.57(s,1h),8.21-8.13(m,1h),8.04(dd,j＝12.2,2.0hz,1h),7.80(dd,j＝8.6,4.4hz,1h),7.76(dd,j＝8.6,2.4hz,1h),7.48(dd,j＝14.2,7.8hz,1h),7.34(t,j＝9.2hz,2h),7.30-7.27(m,1h),7.21-7.18(m,1h),7.12-7.06(m,1h),6.60-6.50(m,1h),5.27(s,2h),
4.76(s,1h),4.69(s,1h),3.87(t,j＝6.2hz,1h),3.74(t,j＝4.6hz,1h),3.59(s,2h),3.07(s,1h),3.03(s,2h),2.86-2.81(m,2h),2.47(dd,j＝6.8,4.8hz,2h)ppm.hr-ms(m/z)(esi):calcd for c
33h30
clfn4o7s[m+h]
+
:681.1581；found:681.1582.
[0047]
化合物2的合成：以0.6g(1.0mmol)拉帕替尼和0.2g(1.5mmol)戊二酸酐为原料，参考化合物1的合成方法，最终得到黄固体产物0.63g,产率91.2％。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ12.06(s,1h),9.88(s,1h),8.74(d,j＝4.8hz,1h),8.57(d,j＝5.5hz,1h),8.14(t,j＝8.0hz,1h),8.04(dd,j＝7.1,2.1hz,1h),7.82(t,j＝8.9hz,1h),7.75(d,j＝8.8hz,1h),7.48(dd,j＝14.1,7.7hz,1h),7.34(t,j＝9.9hz,2h),7.30(d,j＝9.0hz,1h),7.22-7.17(m,1h),7.08(dd,j＝15.4,3.1hz,1h),6.58(dd,j＝59.3,2.9hz,1h),5.27(s,2h),4.72(d,j＝21.1hz,2h),3.85-3.74(m,2h),3.59-3.54(m,1h),3.37(dd,j＝14.5,7.4hz,2h),3.05(d,j＝10.5hz,3h),2.60(t,j＝7.2hz,1h),2.35-2.28(m,2h),1.86-1.77(m,2h)ppm.hr-ms(m/z)(esi):calcd for c
34h32
clfn4o7s[m+h]
+
:695.1737；found:695.1734.
[0048]
(2)化合物3～4的合成
[0049][0050]
化合物3的合成：称取0.4g(10.1mmol)60％nah和10ml dmf置于50ml茄形瓶内，将溶解在6ml dmf中的1.2g(5.0mmol)2-氯吩噻嗪溶液缓慢滴加到含nah的dmf溶液中，室温搅拌1h，再将溶解在8ml dmf中的1.6g(10.0mmol)1-溴-3-氯丙烷溶液在0℃下缓慢滴加到上述反应液中，然后缓慢升至室温，继续反应4-6h，tlc检测至2-氯吩噻嗪反应完全。将反应液倒入适量的饱和食盐水中，二氯甲烷萃取(10ml
×
3)，收集有机层，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到2-氯-10-(3-氯丙基)吩噻嗪的粗产物，无需进一步纯化。称取0.3g(1.1mmol)2-氯-10-(3-氯丙基)吩噻嗪和5ml dmf置于50ml茄形瓶内，在搅拌下缓慢加入0.2g(1.1mmol)1-(2-羟乙基)哌嗪、0.3g(3.2mmol)三乙胺和0.4g(2.1mmol)碘化钾，然后缓慢升温至80℃，搅拌反应2h。反应结束后，加入30ml饱和食盐水，二氯甲烷萃取(20ml
×
3)，收集有机层，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，柱层析纯化，洗脱剂为dcm:meoh＝100:1-50:1，最终得到白固体产物0.41g，产率82.2％。1h nmr(600mhz,cdcl3)δ7.16-7.13(m,1h),7.11(dd,j＝7.6,1.4hz,1h),7.00(d,j＝8.1hz,1h),6.92(td,j＝7.5,1.0hz,1h),6.90-6.86(m,2h),6.84(d,j＝2.0hz,1h),3.89(t,j＝6.9hz,2h),3.61-3.57(m,2h),2.79(s,1h),2.62-2.35(m,12h),1.96-1.90(m,2h)ppm.
[0051]
化合物4的合成：以2-(三氟甲基)吩噻嗪、1-溴-3-氯丙烷和1-(2-羟乙基)哌嗪为原料，参考化合物3的合成方法，最终得到白固体产物0.45g，产率75.4％。1h nmr(600mhz,cdcl3)δ7.20-7.15(m,2h),7.14(d,j＝8.1hz,1h),7.11(dd,j＝7.6,1.3hz,1h),7.04(s,1h),6.95(t,j＝7.5hz,1h),6.91(d,j＝8.1hz,1h),3.97(t,j＝6.7hz,2h),3.65(t,j＝5.3hz,2h),3.27(s,1h),2.56(ddd,j＝20.5,12.4,6.3hz,12h),1.95(p,j＝6.9hz,2h)ppm.
[0052]
(3)化合物5的合成
[0053][0054]
bbi608的合成：称取23.0g(0.14mol)液溴和20ml无水二氯甲烷置于100ml茄形瓶内，冷却到-10℃。将10g(0.14mol)3-丁烯-2-酮溶解在20ml无水二氯甲烷中，将其缓慢滴加到液溴的二氯甲烷溶液中，滴加完毕后缓慢升温至0℃，继续反应20min。反应结束后，加入50ml饱和硫代硫酸钠水溶液，分离出有机层，将有机层用水洗一次，饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到1,2-二溴-3-丁酮粗产物，无需进一步纯化，直接用于下一步反应。
[0055]
称取31.6g(0.14mol)1,2-二溴-3-丁酮和30ml dmf置于250ml茄形瓶内，冷却到-10℃。将21.9g(0.14mol)1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(dbu)，溶解在20ml dmf中，将其缓慢滴加到1,2-二溴-3-丁酮dmf溶液中，控制温度在0℃以下。滴加完毕后继续搅拌30min，加入20.2g(0.12mol)2-羟基-1,4-萘醌，然后将升温到30℃，滴加含有27.1g(0.16mol)dbu的dmf溶液(10ml)，控制反应温度不超过50℃。滴加完毕后，50℃下反应3h。反应结束后，将反应液缓慢倒入1.5l的冰水混合物中，控制反应温度在0℃以下，继续搅拌反应2h。抽滤，滤饼用水冲洗一次(50ml)，5％碳酸氢钠水溶液冲洗一次(50ml)，2％的冰乙酸水溶液冲洗一次(50ml)，冰乙醇冲洗一次(50ml)，真空干燥，得12.75g的褐固体，用乙酸乙酯重结晶，得7.8g黄固体产物，收率27.0％。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.16-8.11(m,2h),8.03(s,1h),7.93-7.89(m,2h),2.60(s,3h).
[0056]
化合物5的合成：将5.0g(20.83mmol)bbi608、40ml dmf和2ml水置于100ml茄形瓶内，分批缓慢加入0.8g(21.1mmol)硼氢化钠，控制反应温度在30℃以下，加完后室温反应3h。将反应液倒入200ml含2％盐酸的水溶液中，继续搅拌反应2h。用乙酸乙酯萃取(20ml
×
3)，收集有机层，用30ml水和30ml饱和食盐水各洗一次，减压浓缩有机层，得到粗产物，用乙酸乙酯重结晶，得到黄固体产物4.6g，产率90.8％。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.10-8.05(m,2h),7.89-7.84(m,2h),6.90(s,1h),5.82(d,j＝5.5hz,1h),4.88(p,j＝6.4hz,1h),1.48(d,j＝6.6hz,3h)ppm.
[0057]
实施例2：化合物6的制备
[0058]
[0059]
称取0.3g(0.5mmol)化合物1、0.2g(0.6mmol)tbtu和10mldmf置于25ml茄形瓶内，45℃下搅拌10min，加入0.1g(1.0mmol)tea，继续搅拌10min，再加入0.2g(0.5mmol)化合物3，45℃下搅拌反应12-16h，tlc检测至反应完全。然后加入少量200-300目硅胶拌样，柱层析纯化，洗脱剂dcm:meoh＝100:1-50:1，最终得到黄固体产物0.34g，产率63.2％。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ9.98(d,j＝17.5hz,1h),8.85(d,j＝13.2hz,1h),8.57(d,j＝5.2hz,1h),8.16(dd,j＝26.9,8.7hz,1h),8.07(dd,j＝6.4,2.3hz,1h),7.81(d,j＝8.7hz,2h),7.47(dd,j＝14.4,7.4hz,1h),7.34(t,j＝9.3hz,2h),7.28(d,j＝9.0hz,1h),7.18(dd,j＝8.0,4.9hz,3h),7.12(t,j＝8.4hz,2h),7.05-7.01(m,2h),6.98-6.93(m,2h),6.59(dd,j＝79.9,3.0hz,1h),5.76(s,1h),5.27(s,2h),4.72(d,j＝40.7hz,2h),4.06(d,j＝36.4hz,2h),3.93-3.83(m,3h),3.77-3.73(m,1h),3.61-3.55(m,1h),3.39-3.32(m,3h),3.07(s,1h),3.03(s,2h),2.90(t,j＝6.1hz,1h),2.80-2.75(m,1h),2.61-2.57(m,2h),2.44(s,2h),2.34(s,6h),1.75(s,2h),1.22(s,1h)ppm.
13
c nmr(150mhz,dmso-d6)δ172.83,172.00,163.49,161.88,158.01,154.87,153.03,151.56,150.18,149.48,146.65,144.34,δ140.13(d,j＝7.5hz),133.63,132.90,131.05,131.00,128.95,128.47,128.22,127.63,124.74,124.58,123.78,123.41,122.93,122.74,122.49,121.53,117.61,116.69,116.14,115.83,115.23,115.10,114.73,114.56,114.42,111.42,108.38,69.88,61.82,56.30,55.39,54.92,52.08,51.74,44.93,41.87,41.26,41.11,29.42,28.30,27.78ppm.c
54h54
cl2fn7o7s2[m+h]
+
:1066.2960；found:1066.2960.
[0060]
实施例3：化合物7的制备
[0061]
参考化合物6的合成方法，最终得到黄固体产物，产率57.8％。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ10.41(d,j＝18.5hz,1h),9.20(d,j＝34.5hz,1h),8.56(s,1h),8.22-8.17(m,1h),8.12(t,j＝9.0hz,1h),7.93(t,j＝9.7hz,1h),7.80(d,j＝8.6hz,1h),7.48(dd,j＝14.5,7.4hz,1h),7.39(d,j＝2.6hz,1h),7.34(t,j＝8.8hz,2h),7.27(d,j＝9.1hz,1h),7.19(t,j＝8.0hz,2h),7.14-7.10(m,2h),7.05-7.01(m,2h),6.95(dd,j＝9.2,7.9hz,2h),6.63-6.50(m,1h),5.27(s,2h),4.70(d,j＝20.0hz,2h),4.08(d,j＝15.2hz,2h),3.88(dd,j＝14.4,8.3hz,2h),3.83-3.79(m,1h),3.78-3.75(m,1h),3.60-3.55(m,1h),3.37(d,j＝8.5hz,2h),3.06(s,1h),3.04(s,2h),2.61(t,j＝7.2hz,2h),2.54(d,j＝6.7hz,1h),2.47(d,j＝17.1hz,3h),2.41-2.38(m,3h),2.36(d,j＝7.4hz,3h),2.21-2.16(m,1h),1.83(td,j＝13.9,7.1hz,2h),1.75(s,2h),1.22(s,2h)ppm.
13
c nmr(150mhz,dmso-d6)δ173.12,172.65,163.48,161.87,158.10,154.82,153.03,151.46,150.03,149.40,146.65,144.32,140.18(d,j＝7.6hz),133.85,132.89,131.05,131.00,128.82,128.56,128.46,128.38,128.22,127.61,124.59,123.78,123.40,122.85,122.48,121.36,118.46,116.69,116.13,115.99,115.19,115.08,114.62,114.56,114.41,111.40,108.79,69.87,61.57,56.37,55.42,54.87,52.02,51.71,44.94,41.29,41.11,33.27,31.91,31.45,29.48,20.63ppm.c
55h56
cl2fn7o7s2[m+h]
+
:1080.3116；found:1080.3118.
[0062]
实施例4：化合物8的制备
[0063]
参考化合物6的合成方法，最终得到黄固体产物，产率62.8％。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ9.91(d,j＝17.7hz,1h),8.78(d,j＝11.5hz,1h),8.56(d,j＝6.6hz,1h),8.16(ddd,j＝29.4,8.7,1.3hz,1h),8.04(dd,j＝5.8,2.5hz,1h),7.80(dd,j＝8.7,3.5hz,1h),
7.76(dd,j＝8.8,2.0hz,2h),7.47(dd,j＝14.0,7.9hz,1h),7.33(t,j＝9.8hz,2h),7.29(d,j＝9.0hz,2h),7.19(dd,j＝8.8,2.2hz,2h),7.17(d,j＝2.5hz,3h),7.14(d,j＝3.2hz,1h),7.09(d,j＝3.2hz,1h),6.58(dd,j＝80.0,3.2hz,1h),5.27(s,2h),4.72(d,j＝25.5hz,2h),4.18-4.11(m,2h)，3.87-3.82(m,2h),3.75-3.71(m,2h),3.60-3.55(m,2h),3.57-3.53(m,2h),3.40-3.34(m,2h),3.04(d,j＝12.2hz,3h),2.83(dt,j＝64.6,6.2hz,4h),2.59(dd,j＝14.0,7.8hz,2h),1.94-1.86(m,4h),1.85-1.80(m,2h),1.38-1.32(m,2h)ppm.
13
c nmr(150mhz,dmso-d6)δ173.43,172.03,163.49,161.88,158.02,154.86,152.02,151.57,150.19,149.47,146.05,144.62,143.15,140.16,133.61,131.05,129.96,128.95,128.56,128.36,127.98,127.40,124.75,124.62,123.81,122.79,121.53,119.96,117.57,115.82,115.23,115.09,114.75,114.58,114.43,112.53,111.39,111.18,108.38,69.87,61.11,55.67,54.12,52.05,51.72,44.87,41.87,41.26,41.10,29.30,29.15,28.27,27.80ppm.c
55h54
clf4n7o7s2[m+h]
+
:1100.3224；found:1100.3221.
[0064]
实施例5：化合物9的制备
[0065]
参考化合物6的合成方法，最终得到黄固体产物，产率59.4％。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ10.03(s,1h),8.86(m,dd,j＝12.4,8.2hz,1h),8.57(s,1h),8.13(t,j＝8.9hz,1h),8.09-8.04(d,j＝9.8hz,1h),7.95(d,j＝5.5hz,1h),7.85-7.77(m,2h),7.67(d,j＝5.5hz,1h),7.48(dd,j＝10.3,5.3hz,2h),7.38-7.31(m,2h),7.31-7.23(m,2h),7.18(t,j＝5.2hz,3h),7.10-7.06(m,1h),7.00(t,j＝4.9hz,1h),6.65-6.50(m,1h),5.27(s,2h),4.71(d,j＝13.9hz,2h),4.15-4.08(m,2h),3.99(dd,j＝8.6,4.2hz,2h),3.84-3.74(m,2h),3.61-3.53(m,1h),3.41-3.31(m,2h),3.04(d,j＝6.5hz,3h),2.70(s,4h),2.60(dd,j＝8.8,4.1hz,6h),2.38(dt,j＝9.7,4.8hz,2h),1.94-1.87(m,2h),1.87-1.77(m,2h),1.39(s,1h),1.31-1.17(m,2h)ppm.
13
c nmr(150mhz,dmso-d6)δ173.08,172.65,163.50,161.88,158.07,154.87,152.98,151.70,150.23,149.36,145.91,144.08,143.30,140.12,133.62,131.00,129.88,128.92,128.49,128.23,127.82,127.24,124.71,123.79,123.33,122.85,121.56,119.45,116.97,115.86,115.23,115.09,114.80,114.56,114.42,112.46,111.32,110.29,108.46,69.93,61.19,55.80,54.28,52.07,51.75,45.01,44.73,41.13,33.26,31.91,31.41,26.81,22.52,20.58ppm.c
56h56
clf4n7o7s2[m+h]
+
:1144.3380；found:1114.3381.
[0066]
实施例6：化合物10的制备
[0067][0068]
参考化合物6的合成方法，最终得到黄固体产物，产率69.1％。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ10.18(d,j＝28.6hz,1h),8.98(s,1h),8.51(d,j＝23.8hz,1h),8.13(t,j＝2.6hz,1h),8.09-8.05(m,1h),8.02(dd,j＝6.5,2.2hz,1h),8.01-7.98(m,1h),7.86(d,j＝
8.9hz,1h),7.84-7.80(m,2h),7.71(dd,j＝31.1,8.7hz,1h),7.48(dd,j＝14.3,7.5hz,1h),7.33(t,j＝9.6hz,2h),7.27(dd,j＝8.9,5.6hz,2h),7.22-7.17(m,1h),7.02(s,1h),6.58(dd,j＝85.2,3.1hz,1h),6.01(dq,j＝27.9,6.6hz,1h),5.26(d,j＝5.3hz,2h),4.76(s,1h),4.70(dd,j＝25.6,15.8hz,1h),3.90-3.85(m,1h),3.83-3.73(m,2h),3.61-3.55(m,1h),3.07(s,1h),3.05(s,2h),3.00-2.96(m,1h),2.87-2.83(m,1h),2.73-2.66(m,2h),1.60(d,j＝6.7hz,1h),1.55(d,j＝6.7hz,2h)ppm.
13
c nmr(150mhz,dmso-d6)δ180.37,173.08,171.98,163.48,161.86,160.75,157.92,154.74,153.02,152.05,151.33,150.02,149.31,140.19,134.61,134.45,133.75,132.95,132.47,131.00,130.83,128.73,128.25,126.83,126.71,124.50,123.79,122.73,121.37,118.06,115.80,115.22,115.08,114.63,114.41,111.56,108.54,106.25,69.83,65.02,51.69,44.75,41.24,41.09,29.58,28.46,18.53ppm.hr-ms(m/z)(esi):calcd for c
47h38
clfn4o
10
s[m+h]
+
:905.2054；found:905.2057.
[0069]
实施例7：化合物11的制备
[0070]
参考化合物6的合成方法，最终得到黄固体产物，产率67.6％。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ10.36(d,j＝18.0hz,1h),9.12(d,j＝18.2hz,1h),8.47(d,j＝7.5hz,1h),8.17(s,1h),8.05(dd,j＝11.1,5.5hz,1h),8.01(ddd,j＝9.1,5.1,2.7hz,2h),7.91(d,j＝8.6hz,1h),7.86-7.79(m,2h),7.70(dd,j＝20.7,8.7hz,1h),7.47(dd,j＝14.0,7.8hz,1h),7.36-7.30(m,3h),7.26(d,j＝9.0hz,1h),7.18(td,j＝8.7,2.2hz,1h),7.06(s,1h),6.55(dd,j＝46.4,3.1hz,1h),6.03(p,j＝6.7hz,1h),5.26(s,2h),4.69(d,j＝16.3hz,2h),3.82-3.71(m,2h),3.57(t,j＝8.7hz,1h),3.04(d,j＝9.2hz,3h),2.64(t,j＝7.2hz,1h),2.58-2.54(m,1h),2.47(t,j＝7.5hz,1h),1.91-1.82(m,2h),1.60(d,j＝6.7hz,1h),1.57(d,j＝6.7hz,2h),1.22(s,2h)ppm.
13
c nmr(150mhz,dmso-d6)δ180.36,173.15,172.40,163.48,161.86,160.75,158.00,154.72,152.97,152.09,151.32,149.99,149.29,140.22,134.62,134.48,133.82,132.98,132.49,131.07,130.83,128.68,128.24,126.84,126.69,124.57,123.81,122.85,121.30,118.42,115.88,115.22,115.08,114.60,114.43,111.49,108.74,106.29,69.84,64.94,51.65,44.88,41.08,33.24,31.80,29.45,20.58,18.66ppm.hr-ms(m/z)(esi):calcd for c
48h40
clfn4o
10
s[m+h]
+
:919.2210；found:919.2212.
[0071]
实施例8：化合物的细胞毒活性测试
[0072]
1、实验方法
[0073]
采用mtt方法对本发明的化合物6～11进行了细胞毒活性测试。取对数生长期的细胞计数，接种于96孔培养板内，每孔约8000-10000个细胞。培养过夜，待细胞贴壁后进行给药，分别设给药组和对照组。待测的化合物用dmso溶液配制成贮液，临用前用细胞培养基稀释成一系列浓度，其中dmso的终浓度不超过4
‰
(下面实验类同)。每个浓度设3个复孔。加药后培养72小时，加20μl浓度为5mg/ml的mtt，37℃孵育4小时，去上清，加入150μl的dmso溶解。用酶标仪在490nm波长下测定每孔的od值，并计算抑制率，做浓度-抑制率曲线计算ic
50
值。
[0074]
2、实验结果
[0075]
测试了目标化合物对人乳腺癌细胞mcf-7、人三阴乳腺癌细胞mda-mb-231、拉帕替
尼介导的mda-mb-231耐药细胞、人脐静脉内皮细胞huvec的细胞毒活性，以拉帕替尼及其分别与化合物3、4和bbi608的等摩尔物理混合物(mix-1、mix-2和mix-3)作为阳性对照。观察化合物在不同浓度下对肿瘤细胞生长的抑制情况，计算ic
50
值来评价药物的细胞毒活性，结果见表1。
[0076]
表1.化合物的体外细胞毒性
[0077][0078]
[a]
rf(耐药因子)＝ic
50
(mda-mb-231/lapatinib)/ic
50
(mda-mb-231)。
[0079]
由表1数据可知，相比于拉帕替尼，所有设计合成的拉帕替尼和癌细胞干性抑制剂的偶联物均可有效提高对mcf-7和mda-mb-231的细胞毒性，且对mda-mb-231的细胞毒性要普遍高于对mcf-7细胞。更为重要的是，所有目标化合物均可有效逆转mda-mb-231/lapatinib细胞的耐药性，特别是化合物6，其对mda-mb-231/lapatinib细胞的ic
50
值为1.03μm,较拉帕替尼的细胞毒性高28.5倍，同时较mix-1的细胞毒性高6.95倍。此外，拉帕替尼与bbi608衍生物的偶联物化合物11，对mda-mb-231/lapatinib细胞的细胞毒性仅次于化合物6，其ic
50
值1.69μm，较拉帕替尼和mix-3的细胞毒性分别高17.69倍和3.07倍。而化合物6对huvec细胞的ic
50
值为89.23μm，明显低于拉帕替尼(47.31μm)和mix-1(40.54μm)。化合物7对huvec细胞的细胞毒性最低，其ic
50
值为100.17μm。拉帕替尼与bbi608的物理混合物对huvec细胞的细胞毒性高于拉帕替尼，但是化合物11却明显降低了母体化合物对huvec的细胞毒性，其ic
50
值为63.31μm。根据以上，拉帕替尼和癌细胞干性抑制剂偶联既可以增强拉帕替尼对癌细胞的毒性，逆转拉帕替尼介导的mda-mb-231细胞耐药，还可以有效降低母体化合物对正常细胞的毒性。
[0080]
实施例9：化合物6和11对egfr及下游akt/erk信号通路的影响测试
[0081]
1、实验方法
[0082]
采用免疫蛋白质印迹法测定经20μm的化合物6和11分别作用于mda-mb-231和mda-mb-231/lapatinib细胞24h后，细胞内pegfr(y1068)蛋白和下游pakt1/2/3(s473)和perk1/2(t202/y204)蛋白的表达水平，以及不同浓度的化合物6对两种癌细胞内pegfr(y1068)和egfr蛋白表达水平的影响。实验步骤如下：
[0083]
(a)蛋白提取：在6孔板的各孔中加入1ml浓度为2
×
105cells/ml的细胞悬浮液，并置于含5％co2的37℃细胞培养箱中孵育12h。之后在6孔板的各孔中分别加入20μm的拉帕替
尼、化合物6和11以及相同体积的dmso，放入细胞培养箱中继续孵育24h。孵育结束后，将细胞收集至15ml离心管中，1500转离心5min，去除培养基，用2ml pbs缓慢清洗两次。将收集有细胞的15ml离心管置于碎冰上并加入80μl细胞裂解液，裂解30min，裂解结束后将其转入2ml离心管中，放入冷冻离心机(4℃)，15000转离心15min，取出上清液并保存在-20℃冰箱中。
[0084]
(b)蛋白定量及其制样：采用考马斯亮蓝g250法在varioskan多模微板分光光度计上测定蛋白质含量，然后在提取的蛋白中加入loading buffer,100℃煮样15min。
[0085]
(c)sds-page凝胶的制备与上样：将提前配置好的12％的分离胶中加入temed并吹打均匀，转入电泳仪的凹凸玻璃板内，并立即用水密封。待胶完全凝固后，去除水分，加入6％的浓缩胶，插入槽齿。待胶完全凝固后缓慢拔掉槽齿，并在凝胶的槽齿中加入用sds稀释的上述样品10μl，并加入标记物作为参考。将电泳仪电压调制100v跑胶30min，再调制150v，待标记物完全分开，loading buffer跑到凝胶最下方时停止。
[0086]
(d)转膜：将pvdf膜用甲醇完全浸湿，和滤纸一起完全浸泡在转膜液中。取出上述凝胶，将含有目标蛋白的部分完全置于转膜液中浸泡10min，然后和pvdf膜一起放入半干转膜仪上，350ma电流下转膜45-60min。结束后将pvdf膜放入5％脱脂奶粉中，置于摇床上封闭90min。
[0087]
(e)免疫与曝光：将上述封闭好的pvdf膜放在摇床上用tbst清洗。孵育一抗4℃下过夜，结束后在摇床上用tbst清洗，重复五次，每次30min。在37℃下摇晃孵育二抗1h，结束后在摇床上用tbst清洗，重复五次，每次10min。最后用odyssey扫描系统进行成像。
[0088]
2、实验结果
[0089]
具体实验结果见图1。
[0090]
如图1所示，相比对照组，化合物6和11均可以显著抑制mda-mb-231和mda-mb-231/lapatinib细胞内egfr(y1068)以及下游蛋白akt1/2/3(s473)和erk1/2(t202/y204)的磷酸化，其中化合物6的抑制能力最强，并且在这两种癌细胞内均能以剂量依赖方式抑制pegfr(y1068)蛋白的表达。相比之下，拉帕替尼仅在mda-mb-231细胞中表展现出较强的抑制pegfr(y1068)、pakt1/2/3(s473)和perk1/2(t202/y204)蛋白表达的能力，而在mda-mb-231/lapatinib细胞中的抑制活性较弱。这些结果表明，化合物6和11均保留了母体化合物对egfr的抑制活性，并且可以通过akt/erk信号通路逆转拉帕替尼介导的mda-mb-231细胞的耐药性。
[0091]
实施例10：化合物6和11对aldh1a1酶活性的抑制测试
[0092]
1、实验方法
[0093]
乳腺癌干细胞(bcscs)分化必须经历一个循环的遗传过程，即上皮细胞-间充质转化(emt)和间充质细胞-上皮转化(met)，在这个过程中bcscs首先迁移到周围组织，然后再重新粘附到基底膜基质上，导致肿瘤发生。因此，bcscs具有可塑性，在emt期间表达cd24、cd44、cd133、sox2等组织特异性和细胞增殖标志物，而在met状态下表达aldh。首先测试化合物6、11、奋乃静和bbi608对外源性aldh1a1酶活性的抑制；其次用qrt-pcr定量分析经20μm的拉帕替尼、化合物6和11分别作用24h后，mda-mb-231/lapatinib细胞内aldh1a1基因的转录水平；最后用免疫蛋白印迹法测试经20μm的拉帕替尼、化合物6和11分别作用24h后，mda-mb-231/lapatinib细胞内aldh1a1、cd44和sox2蛋白的表达水平。
[0094]
实验步骤如下：
[0095]
(1)aldh1a1酶抑制活性检测：选用上海抚生实业有限公司提供的商业化aldh1a1激酶(人源)elisa检测/抑制剂筛选分析试剂盒。从试剂盒中取出96孔板，放入37℃细胞培养箱中解冻，之后并将96孔板划分为三块区域，分别为待测组，阳性对照组和空白组。在96孔板各孔中加入50μl 60u/l的aldh1a1酶反应液，在待测组和阳性对照组各孔中分别加入5个梯度浓度(500.0、100.0、20.0、4.0和0.8nm)新鲜配制的化合物6、11、拉帕替尼和bbi608溶液，空白组各孔中只需加入等体积的溶剂。密封后放入37℃孵箱中孵育2h。结束后除空白组外，其余组各孔中分别加入50μl aldh1a1酶连物，继续孵育30min，之后在各孔中分别加入50μl显剂a和50μl显剂b，轻轻摇晃均匀后避光孵育15min，结束后在各孔中再加入50μl终止液，室温下孵育10min，最后在酶标仪450nm波长下测定吸光度值(od值)，每个化合物平行三次独立实验，结果取三次实验平均值
±
sd，计算抑制率，并利用spss 16.0软件计算各个化合物对alhd1a1的半数抑制浓度(ic
50
)。
[0096]
(2)定量分析aldh1a1基因的转录水平：在6孔板的各孔中加入1ml浓度为2
×
105cells/ml的细胞悬浮液，并置于含5％co2的37℃细胞培养箱中孵育12h。之后在6孔板的各孔中分别加入20μm的拉帕替尼、化合物6和11以及相同体积的dmso，放入细胞培养箱中继续孵育24h。孵育结束后，将细胞收集至15ml离心管中，1500转离心5min，去除培养基，用2ml pbs缓慢清洗两次。通过trizol试剂提取mda-mb-231/lapatinib细胞内的rna，然后利用反转录试剂盒将rna反转录为浓度相同的cdna(geneamp 9600,perkinelmer)，随后以cdna为模板进行实时荧光定量pcr实验(abi stepone plus,abi)。循环步骤为：95℃预变性3min，95℃变性10s,60℃延伸30s，共39个热循环。实验中，以括熔解曲线分析确认特定的单一产品扩增，β-actin为内参。基因的相对表达以2-δδct
的倍数表示。aldh1a1的引物序列为：fwd:tccacattccagtttggccc,rev:ttcgaaggagtgttgagcg；β-actin的引物序列为：fwd:cttagttgcgttacaccctttcttg,rev:ctgtcaccttcaccgttccagttt。
[0097]
(3)免疫蛋白印迹分析：参考上述免疫蛋白印迹法探究20μm的拉帕替尼、化合物6和11分别作用24h后，对mda-mb-231/lapatinib细胞内aldh1a1、cd44和sox2蛋白的表达水平的影响。
[0098]
2、实验结果
[0099]
具体实验结果如图2和图3所示。
[0100]
醛脱氢酶(aldh)是cscs在met过程的特异性表达标志之一，尤其是醛脱氢酶1家族成员a1(aldh1a1)亚型，被认为是cscs最强的标志之一，在维持乳腺癌细胞的干性方面起着关键性作用。以化合物3和bbi608为阳性对照，采用aldh1a1酶联免疫试剂盒，检测化合物6和11对外源性aldh1a1酶活性的抑制。如图2a所示，所测化合物均能以剂量依赖方式抑制aldh1a1酶活性，其中化合物6的抑制能力最强，其ic
50
值为86.42nm，是化合物3的4.92倍。化合物11对aldh1a1酶活性只表现出中度抑制能力，其ic
50
值为134.58nm，是bbi608的3.16倍。与拉帕替尼组相比，化合物6和11还可以显著降低mda-mb-231/lapatinib细胞中aldh1a1基因的转录水平(图2b)。
[0101]
免疫蛋白印迹分析(western blot)分析结果表明，经化合物6和11处理后，相较对照组，mda-mb-231/lapatinib细胞内的aldh1a1蛋白以及cd44和sox2蛋白表达水平都显著下降，特别是化合物6的抑制能力最强。相比之下，拉帕替尼对mda-mb-231/lapatinib细胞
内的aldh1a1、cd44和sox2蛋白表达抑制能力较弱(图3)。这些结果表明，化合物6和11对细胞内的aldh1a1基因转录以及aldh1a1蛋白表达也表现出较强的抑制作用。
[0102]
实施例11：化合物6和11对癌细胞干性的抑制测试
[0103]
1、实验方法
[0104]
首先通过流式细胞仪分选mda-mb-231/lapatinib细胞内cd44
+
细胞亚，命名为mda-mb-231/lapatinib
cd44+
细胞，之后通过qrt-pcr定量分析，经20μm的拉帕替尼、化合物6和11分别作用24h后，mda-mb-231/lapatinib
cd44+
细胞内干细胞转录因子nanog、oct4、sox2和kif4基因的转录水平；最后测试经5μm的拉帕替尼、化合物6和11分别作用10天后，mda-mb-231/lapatinib
cd44+
细胞来源的肿瘤球形成体积和数量。
[0105]
实验步骤如下：
[0106]
(1)mda-mb-231/lapatinib
cd44+
细胞分选：取2
×
105个mda-mb-231/lapatinib细胞，加入5ml无菌pbs，缓慢吹散细胞，室温下2000转离心5min，弃去上清，加入500μl无菌pbs重悬细胞和2.5μl的fitc-cd44抗体，4℃下孵育30min，2000转离心5min，去除上清液。将染好的细胞用0.5％的bsa-pbs重悬，用流式细胞仪检测mda-mb-231/lapatinib细胞内cd44+细胞亚，并将其分选。
[0107]
(2)定量分析干细胞转录因子转录水平：参考上述定量分析实验方法，探究20μm的拉帕替尼、化合物6和11分别作用24h后，对mda-mb-231/lapatinib
cd44+
细胞内nanog、oct4、sox2和kif4基因的转录水平的影响。
[0108]
(3)mda-mb-231/lapatinib
cd44+
细胞来源的肿瘤球形成实验：将mda-mb-231/lapatinib
cd44+
细胞接种于含b27(1:50,17504044,invitrogen)、egf(20ng/ml,af-100-15,peprotech)和β-fgf(10ng/ml,100-18b,peprotech)的无血清的dmem培养基中，密度为每孔800个细胞。之后分别用5μm的拉帕替尼、化合物6和11以及等体积的dmso处理细胞10天。结束后在显微镜上测量肿瘤球的数目和形态。
[0109]
2、实验结果
[0110]
具体实验结果如图4和图5所示。
[0111]
cscs表面抗原的表达在促进肿瘤侵袭性和复发方面起着关键性作用，在实体癌中，cscs被定义为cd44
+
细胞。首先采用流式细胞仪对mda-mb-231/lapatinib细胞中的cd44
+
细胞落进行分选，并命名为mda-mb-231/lapatinib
cd44+
细胞。为了进一步评价所测化合物对癌细胞干性的抑制能力，定量分析了mda-mb-231/lapatinib
cd44+
细胞内干细胞转录因子的转录水平。如图4所示，经所测化合物处理之后，细胞内的转录因子表达水平存在明显差异。拉帕替尼优先攻击非干细胞，因此，对mda-mb-231/lapatinib
cd44+
细胞内cscs转录因子抑制活性较低。而化合物6和11对mda-mb-231/lapatinib
cd44+
细胞内的nanog、sox-2、oct4和kif4基因转录水平呈现出较强抑制能力，其中化合物6抑制作用最强。此外，评估了拉帕替尼、化合物6和11对来源于mda-mb-231/lapatinib
cd44+
细胞的肿瘤球的形成能力。如图5所示，相比于对照组，给药组中来源于mda-mb-231/lapatinib
cd44+
细胞的肿瘤球均有明显表型变化，其中化合物6处理后的肿瘤球体积最小，数量也最少。化合物11处理后的肿瘤球体积和数量仅次于化合物6，而拉帕替尼抑制作用较弱，处理后的肿瘤球体积较大，数量也较多。以上结果表明，化合物6和11可以强效抑制mda-mb-231/lapatinib细胞内的癌细胞干性。
[0112]
基于拉帕替尼和三种不同的癌细胞干性抑制剂，本发明设计合成了一类拉帕替尼与癌细胞干性抑制剂的偶联物，探究了它们对逆转耐药和抑制三阴乳腺癌细胞干性的能力。体外生物活性研究结果表明，这些偶联物可有效提高母体化合物的细胞毒性，能有效逆转拉帕替尼介导的mda-mb-231细胞耐药，其中化合物6和11表现最好。有关机制研究表明，化合物6和11不仅保留了母体化合物拉帕替尼对egfr的抑制活性，而且还可以强效抑制乳腺癌干细胞在emt和met过程中过度表达的aldh1a1酶活性以及乳腺癌干细胞基因nanog、oct4、sox2和kif4。综上，本发明设计的化合物具有制备为三阴乳腺癌药物的潜力。

技术特征：

1.一种拉帕替尼-癌细胞干性抑制剂偶联物，其特征在于，所述偶联物具有式(i)的结构：其中：r为氯或三氟甲基；n为1或2。2.根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述偶联物结构中：r为氯。3.根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述偶联物为以下任一化合物：
4.根据权利要求1～3任一所述的偶联物，其特征在于，所述偶联物与酸或碱形成药学上可接受的盐，其中所述酸为盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、马来酸、琥珀酸、富马酸、水杨酸、苯基乙酸或杏仁酸，所述碱为含有碱性金属阳离子、碱土金属阳离子或铵阳离子盐的无机碱。5.一种权利要求1～4任一所述的偶联物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：化合物1～2中的任一化合物与化合物3～5中的任一化合物，经酯化反应得到偶联物(i)；
将相应的酸或碱加入到以上方法制备的偶联物(i)的溶液中，成盐完全后除去溶剂，即得所述偶联物的药学上可接受的盐。6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1～4任一所述偶联物和/或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。7.一种权利要求1～4任一所述的偶联物或其药学上可接受的盐在制备癌症或逆转耐药物中的应用。8.一种权利要求6所述的药物组合物在制备癌症或逆转耐药物中的应用。9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述癌症为乳腺癌。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。

技术总结

本发明公开了一类拉帕替尼-癌细胞干性抑制剂偶联物、制法、药物组合物和应用。该类偶联物结构如式(I)，该类偶联物在分子水平和细胞水平均具有显著的抗癌活性，可以有效提升母体化合物拉帕替尼的细胞毒性，并且可以有效抑制癌细胞干性，而且还可以逆转拉帕替尼介导的细胞耐药，降低对正常细胞的毒性，具有制备为乳腺癌药物的潜力，并且该类偶联物合成方法简便，易操作。易操作。易操作。易操作。