[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101256186A [43]公开日2008年9月3日
[21]申请号200810060570.4[22]申请日2008.03.28
[21]申请号200810060570.4
[71]申请人杭州浙大生科生物技术有限公司
地址310013浙江省杭州市西湖区玉古路116号2
楼204室
[72]发明人吴善东 [74]专利代理机构杭州求是专利事务所有限公司代理人韩介梅
[51]Int.CI.G01N 33/543 (2006.01)G01N 33/535 (2006.01)
权利要求书 2 页 说明书 9 页
[54]发明名称
其制备方法
[57]摘要
本发明公开了食物过敏原特异性IgG4抗体ELIS
A 检测试剂盒及其制备方法，应用纯化的食物过敏
敏原蛋白的酶标板、人IgG4标准液、酶标记抗体、
TMB底物显液、样品稀释液、浓缩洗涤液和终止
反应液。样品血清中的特异性IgG4抗体结合固定在
酶标板微孔表面上的相应抗原，酶标记抗体识别Ig
G4并与之结合，形成抗原-IgG4-抗体-酶的复合物，
酶与底物反应显后测出吸光度，由标准曲线计算
出样本血清中的特异性IgG4抗体浓度。使用样品血
清中过敏原特异性IgG4抗体浓度作为食物过敏原暴
露状况的生物指标，判断患者的免疫偏差和免疫耐
受性，也可用于患者选择特定食物进行免疫疗
效的监控。
200810060570.4权 利 要 求 书第1/2页 1、食物过敏原特异性IgG4抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于该试剂盒组成包括已包被的奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、水产类、豆类食物过敏原蛋白酶标板、人IgG4标准液、酶标记抗体、TMB底物显液、样品稀释液、浓缩洗涤液和终止
反应液；
其中：
已包被的奶类食物过敏原蛋白的酶标板包括：牛奶、羊奶； 已包被的蛋类食物过敏原蛋白的酶标板包括：家禽蛋白、家禽蛋黄； 已包被的肉类食物过敏原蛋白的酶标板包括：猪肉、牛肉、羊肉、鸭肉、鸡肉、鹅肉；
已包被的谷物类食物过敏原蛋白的酶标板包括：玉米、小麦、燕麦、大麦、荞麦、大米、小米；
已包被的坚果类食物过敏原蛋白的酶标板包括：杏仁、花生、榛子、腰果、核桃、开心果、巴西坚果、芝麻；
已包被的水果类食物过敏原蛋白的酶标板包括：西瓜、菠萝、橙子、芒果、香蕉、柑桔、胡柚、柠檬、苹果、葡萄、梨、草莓、桃；
已包被的蔬菜类食物过敏原蛋白的酶标板包括：芹菜、菠菜、洋葱、茄子、大蒜、辣椒、土豆、西红柿；
已包被的水产类食物过敏原蛋白的酶标板包括：带鱼、黄鱼、比目鱼、三文鱼；鲤鱼、鲫鱼、草鱼、鲢
鱼、虾、蟹、蚌、贻贝、牡蛎、黄鳝、鳗鱼； 已包被的豆类食物过敏原蛋白的酶标板包括：扁豆、蚕豆、黄豆、豌豆； 酶标记抗体：辣根过氧化物酶标记的抗人I g G4单克隆抗体； TMB底物显液：2.08mmol/L 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，12mmol/L 过氧化氢，10m m o l/L β-环糊精，0.1m o l/L p H5.0的醋酸缓冲液。 样品稀释液：10mmol/L pH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液中含1％BSA，0.05％Tween-20和1mg/L庆大霉素；
浓缩洗涤液：0.1mol/L pH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液中含1％胎牛血清，0.5％Tween-20和20mg/L庆大霉素；
终止反应液：1.0mol/L H2SO4。
2、根据权利要求1所述的食物过敏原特异性IgG4抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于所说的酶标板为96孔。
3.权利要求1所述的食物过敏原特异性IgG4抗体ELISA检测试剂盒的
200810060570.4权 利 要 求 书 第2/2页
制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)食物过敏原蛋白的制备：将含过敏原蛋白的食物材料经粉碎、脱脂、提取、SDS-PAGE电泳确证、洗脱、干燥；
(2)酶标记抗体的制备：用辣根过氧化物酶标记纯化的抗人IgG4抗体；
(3)配制人IgG4标准液、TMB底物显液、浓缩洗涤液和终止反应液；
(4)酶标板包被：用抗人IgG4抗体和食物过敏原蛋白包被酶标板，并封闭。
200810060570.4说 明 书第1/9页食物过敏原特异性IgG4抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及了一种半定量检测人血清中食物过敏原特异性I g G4抗体的酶联免疫吸附分析(ELISA)检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
几十年来，医学界一直在密切关注和研究食物过敏反应和诱发过敏性疾病的天然食物、转基因改良食物、食物添加剂及防腐剂。食物过敏反应分I g E免疫介导的过敏反应和非I g E免疫介导的过敏反应。在I
g E介导的过敏反应中，食物中的过敏原成分刺激产生的食物过敏原特异性I g E抗体与在肥大细胞，嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和血小板等细胞膜表面的F CεR1和F CεR2受体结合，释放组胺、肿瘤坏死因子(T N Fα)等炎症介质，引起过敏反应的病症。在非I g E免疫介导的食物过敏反应中，食物过敏原诱导人肥大细胞和嗜碱性粒细胞膜上的I g G抗体高亲和受体F cγR1活化，与I g G 结合后集聚、脱颗粒、释放组胺和花生四烯酸代谢物等炎症介质，触发恶心、腹泻、腹痛等胃肠道症状和其他典型的过敏性鼻炎，过敏性皮炎及风疹等过敏性疾病(Tkaczy c et al，2002，Mol Immunol，38：1289-1296)。IgG抗体是多态形的，有I g G1、I g G2、I g G3及I g G4等4种亚类。H a l p e r n S R e t a l建议I g G致敏抗体实际上是IgG4(Halpern SR et al，2001，Hematology(Oxford)，40：1175-1179)。O k a y a m a Y e t a l证实，人肥大细胞上的F cγR1受体活化释放的炎性介质与I g E 抗体高亲和受体F CεR1受体激发释放的炎性介质定性上是无法区分的
(Okayama Y et al，2001，J Immunal，166；4705-4712)。Ruiter B et al的研究发现，与非过敏体质的个体相比，无牛奶过敏史的过敏体质儿童和成人的牛奶致敏蛋白特异性I g G4水平较高；对牛奶耐受的过敏体质和非过敏体质个体都发现有卵类粘蛋白特异性I g G4抗体，但没有发现有尘螨的特异性I g G4抗体。由此得出对牛奶耐受的过敏体质儿童和无牛奶过敏反应成人与提高特异性I g G4水平，同时降低特异性I g E抗体水平相一致。牛奶耐受过敏体质个体特异性I g G4水平上调可能与过敏原的类型及其暴露的剂量相关(Ruiter B et al，2007，Clin EXP Allergy，37：1103-1110)。Greenberger PA认为：过敏性
疾病的免疫减轻过敏性疾病的症状，特别是对过敏性鼻炎和过敏性哮喘的免疫，反映了细胞因子和免疫球蛋白受过敏原刺激而改变，抗抗原的I g G抗体水平升高2-10倍，I g G4升高10-100倍，而抗抗原的I g E抗体水平则明显下降，鼻腔或支气
200810060570.4说 明 书 第2/9页管的肥大细胞和嗜碱性粒细胞的数目减少，下调淋巴细胞和I L-4，而干扰素γ(IFNγ)的增高不足(Greenberger PA，2002，Immunotherapy update：Mechanism ofaction，Allergy Asthma Proc，23：373-376)。这些研究清楚的说明了IgG4在免疫中的封闭抗体作用是抑制过敏原诱导从碱性粒细胞和肥大细胞释放炎性介质，同时将过敏原展示于T细胞、抑制T细胞活性。I g G4作为致敏抗体或封闭抗体的双重作用是I g G4抗体有二种亚型：I g G4a和I g G4b；I g G4a与I g G1、I g G3的结构上有一定程度相似，而I g G4b与I g G2结构上相似(V a n D e r Z e e JS，Aalberse RC，1988，N Engl Reg Allergy Proc，9：31-33)。
I g G(主要是I g G4)介导的免疫食物过敏反应发病迟缓，通常在摄入食物24-120小时之后，临床表现为多个系统的慢性症状，患者很难做出自我诊断，且检测手段不普及，造成临床诊断的困难。免疫过敏性疾病的过程中，患者血清中特异性I g E浓度逐渐下降至某一范围，而特异性I g G4却逐渐上升至某一水平，成为免疫的疗效的评估指标，酶免疫分析体外检测过敏患者血清中食物过敏原特异性IgG4抗体浓度的优越性就突出了。
酶免疫分析中有多种检测结合酶的方法，如荧光法、化学发光法和T M B 比法等。其中T M B比法的酶联免疫吸附分析(E L I S A)方法只需使用普通普及型的酶标议，经济快速、简单安全、适合我国多级医院使用。
E L I S A方法检测血液样本中食物过敏原特异性I g G4抗体(s I g G4)是利用固相载体固定的过敏原蛋白识别样品液中的s I g G4并与s I g G4结合，洗去未结合的其他蛋白，再加入酶标记的抗人I g G4抗体与已经结合在固定抗原上的s I g G4抗体结合，形成过敏原-s I g G4-抗体-酶的复合物，通过与酶底物显液反应，检测结合的酶量，间接地测定出样品液中的s I g G4浓度及特定的过敏原。
E L I S A方法应用的多种技术，如过敏原蛋白的提取纯化方法，人I g G4抗体和抗人I g G4抗体的制备、纯化，酶标记抗体的制取纯化等均已成熟(T，k i e s s i g ST，1992，Enzyme immunoassay techniques，An overview，J Immunol Methods，150：5-21)，且可按美国临床实验室标准化委员会的文件(I/L A20-A)评价质量，为食物过敏原特异性I g G4抗体E L I S A检测试剂盒的商品化生产奠定了技术基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强、使用方便、快速地半定量检测人血清中的食物过敏原特异性I g G4抗体E L I S A检测试剂盒及其制备方法。使用试剂盒检测样品血清中食物过敏原特异性I g
G4抗体浓度，用以判
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