(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810913872.5
(22)申请日 2018.08.10
(71)申请人 杭州艾乐吉生物科技有限公司
地址 310000 浙江省杭州市滨江区长河街
道滨安路1180号7号楼一楼141室
(72)发明人 高中山 付婉艺 高毕远
(74)专利代理机构 杭州天勤知识产权代理有限
公司 33224
代理人 沈金龙
(51)Int.Cl.
G01N 33/68(2006.01)
(54)发明名称
盒
(57)摘要
本发明公开了一种用于预测蒿过敏患者哮
喘发生风险的蒿属植物花粉过敏原组合、应用及
试剂盒。所述蒿属植物花粉过敏原组合，包括Art
v 1、Art ar 2、Art v 3和Art an 7。本发明通过
对240例蒿花粉过敏病例研究发现，当蒿花粉过
敏病例检测结果中，Art v 1、Art ar 2、Art v 3 和Art an 7中的至少三种过敏原特异性IgE为阳
阳性数少于3个时，过敏性哮喘发病率为24％，前
者是后者的2.4倍。通过对过敏患者进行检测，经
检测判断具有高过敏性哮喘发生风险的病人，需
要药物控制以及脱敏才有可能根除，从而避
免过敏性哮喘的发生。权利要求书1页 说明书10页 附图5页CN 109061184 A 2018.12.21
C N 109061184
A
1.一种用于预测蒿过敏患者哮喘发生风险的蒿属植物花粉过敏原组合，其特征在于，包括Art v 1、Art ar 2、Art v 3和Art an 7。
2.如权利要求1所述蒿属植物花粉过敏原组合在预测蒿过敏患者哮喘发生风险中的应用。
3.一种用于预测蒿过敏患者哮喘发生风险的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的蒿属植物花粉过敏原组合。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，过敏原Art v 1、Art ar 2、Art v 3和Art an 7均偶联有生物素，所述试剂盒还包括偶联链霉素的ImmunoCAP。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，过敏原Art v 1、Art ar 2、Art v 3和Art an 7均为天然过敏原提取纯化所得。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，检测方法为：
(1)使用ImmunoCAP检测方法分别检测蒿过敏患者血清中各过敏原Art v 1、Art ar 2、Art v 3和Art an 7的特异性IgE含量；
(2)IgE≥0.35kUA/L判定为阳性，若待检测蒿过敏患者血清中至少三种过敏原特异性IgE为阳性，则该蒿过敏患者具有过敏性哮喘高发风险。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，步骤(1)中，将偶联有生物素的各过敏原分别与蒿过敏患者血清样品混合后，加入偶联链霉素的ImmunoCAP孵育后进行检测。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，检测使用ImmunoCAP -100仪器检测。
权 利 要 求 书1/1页CN 109061184 A
一种蒿属植物花粉过敏原组合、应用及试剂盒
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术相关技术领域，特别是涉及一种用于预测蒿过敏患者哮喘发生风险的蒿属植物花粉过敏原组合、应用及试剂盒。
背景技术
[0002]Ⅰ型过敏症也称Ⅰ型超敏反应性疾病，有关的疾病包括特应性疾病、变应性鼻炎、过敏性结膜炎、特应性皮炎和过敏性哮喘(外源性)和一些荨麻疹、胃肠道食物反应和全身性过敏反应等。Ⅰ型过敏症在世界范围内普遍存在，患特应性疾病的患者对吸入或摄入的物质(过敏原)产生由IgE抗体介导的超敏反应，而这些物质对无特应性疾病的人是无害的。除特应性皮炎外，通常IgE抗体会介导超敏反应。
[0003]引发Ⅰ型过敏症的物质称为过敏原，是蛋白、糖蛋白或多肽。从粘膜摄入后，这些过敏原与结合在致敏个体的肥大细胞表面上的IgE抗体反应。如果两个IgE抗体通过过敏原彼此交联，就会导致效应细胞释放介质(如组胺、前列腺素)和细胞因子，从而产生相应的临床症状。
[0004]过敏原的命名是根据物种的属和种国际免疫学会联合会(I.U.I.S)下属的过敏原命名专门委员会(Allergen Nomenclature Sub-committee)()制定了系统的命名规则。命名主要根据过敏原来源物种的拉丁名，所在属名的前三个字母加种的1-2个字母，然后加过敏原代号，如北艾(Artemesia vugaris)的过敏原为Art v 1～Art v 7，黄花蒿(Artemesia annua)类似的过敏原为Art an 1～Art an 7。
[0005]蒿花粉是中国北方和西部主要的吸入类致敏原，引起夏秋季过敏人的鼻炎，结膜炎、皮疹、哮喘等过敏性疾病。如果不进行早期免疫，约有50％蒿花粉过敏患者发展为较为严重的哮喘。由于环境中花粉数量增加和人们生活方式的改变，我国近20年蒿花粉过敏发病率呈现上升和低龄化倾向。
[0006]目前在蒿属花粉上已经鉴定出7种过敏原蛋白(Art v 1～Art v 6，Art an 7)。体外诊断主要是用花粉的提取物。我国蒿属(Artemisia)过敏源的主要种类为黄花蒿(A.annua)，艾蒿(A.arygi)，茵陈蒿(A.capillaries)，裂叶莲蒿(A.gmelinii)，野艾蒿(A.lavand ulifolia)，大籽蒿(A.sieversiana)，欧洲蒿属植物种类主要为北艾(A.vulgaris)，仅在我国宁夏等西北部有少量分布，目前进入我国蒿诊断试剂市场的国外品牌赛默飞世尔科技公司的试剂ImmunoCAP所用的材料就是北艾，该方法是一种荧光酶联免疫法，该系统将过敏原吸附在一种被称为ImmunoCAP的新型固体上，后者是装在小胶囊中的亲水性载体聚合物，由溴化氧活化的纤维素衍生物合成，与过敏原有很好的结合能力。该系统灵敏性和特异性较高，临床认可度较好。蛋白组分在国外有科研应用性两种(Art v 1和Art v 3)。
[0007]发明人前期研究发现两种新的组分，其一是：公开号为CN106967696A的中国发明专利公开了一种蒿属植物花粉的过敏原，为蒿属植物的半乳糖氧化酶(Art an 7)，在我国7种蒿属植物中，氨基酸序列相似性(Identity)达到94.1％，各物种来源的半乳糖氧化酶均
具有相似的致敏性。其二是：Art ar 2，已列入世界卫生组织过敏原名录。
[0008]目前并没有很好的分析过敏性哮喘发生风险的方法，而以蒿花粉提取物作为检测IgE抗体水平不足以分析过敏性哮喘发生的风险。
发明内容
[0009]本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种用于预测蒿过敏患者哮喘发生风险的蒿属植物花粉过敏原组合、应用及试剂盒。
[0010]一种用于预测蒿过敏患者哮喘发生风险的蒿属植物花粉过敏原组合，包括Art v 1、Art ar 2、Art v 3和Art an 7。
[0011]本发明又提供了所述蒿属植物花粉过敏原组合在预测蒿过敏患者哮喘发生风险中的应用。
[0012]本发明还提供了一种用于预测蒿过敏患者哮喘发生风险的试剂盒，包含如权利要求1所述的蒿属植物花粉过敏原组合。
[0013]优选的，所述试剂盒为使用ImmunoCAP检测方法进行检测，所以过敏原Art v 1、Art ar 2、Art v 3和Art an 7均偶联有生物素，所述试剂盒还包括偶联链霉素的ImmunoCAP。
[0014]优选的，过敏原Art v 1、Art ar 2、Art v 3和Art an 7均为天然过敏原提取纯化所得。天然过敏原最能代表过敏原真实的情况，检测结果更加准确。
[0015]所述的试剂盒，检测方法为：
[0016](1)使用ImmunoCAP检测方法分别检测蒿过敏患者血清中各过敏原Art v1、Art ar 2、Art v 3和Art an 7的特异性IgE含量；
[0017](2)IgE≥0.35kUA/L判定为阳性，若待检测蒿过敏患者血清中至少三种过敏原特异性IgE为阳性，则该蒿过敏患者具有过敏性哮喘高发风险。
[0018]其中，步骤(1)中，将偶联有生物素的各过敏原分别与蒿过敏患者血清样品混合后，加入偶联链霉素的ImmunoCAP孵育后进行检测。
[0019]检测使用ImmunoCAP-100仪器检测。该仪器为瑞典赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)购买，与该公司销售的ImmunoCAP方法相关试剂配套使用。
[0020]本发明通过对240例蒿花粉过敏病例研究发现使用Art v 1、Art ar 2、Art v 3和Art an 7四个过敏原组分所测得的特异性IgE值总和与欧洲蒿花粉提取物特异性IgE值之间具有很高的相关性，相关系数r＝0.92，只有少数血清缺失相应的组分，但这些病例多是过敏症状较轻，因此这四个组分有充分的代表性。
[0021]进一步分析发现，当蒿花粉过敏病例检测结果中，Art v 1、Art ar 2、Art v 3和Art an 7中的三个或者四个全部过敏原均为阳性的情况下，过敏性哮喘发生率为57％，而这四个过敏原阳性数少于3个时，过敏性哮喘发病率为24％，前者是后者的2.4倍。所以若待检测蒿过敏患者血清中三种或者四种过敏原特异性IgE均为阳性，则该蒿过敏患者具有过敏性哮喘高发风险。
[0022]蒿花粉过敏季节性哮喘严重影响生活质量，因此正确评判过敏症状的严重程度风险有重要临床诊断价值。通过对过敏患者进行检测，经检测判断具有高过敏性哮喘发生风险的病人，需要药物控制以及脱敏才有可能根除，从而避免过敏性哮喘的发生。
附图说明
[0023]图1为过敏原Art ar 2的电泳检测结果图。
[0024]图2为过敏原Art ar 2的胰蛋白酶处理后多肽片段LC-MS质谱检测结果图。[0025]图3为ImmunoCAP检测的流程图。
[0026]图4为蒿花粉提取物特异性IgE值与四个组分相加之和的线性关系图，其中SX、SD、YN分别代表来至山西、山东和云南。
[0027]图5为不同年龄段非哮喘(灰柱)与哮喘(黑柱)发生比例分布图。
[0028]图6为蒿花粉过敏性哮喘和非哮喘病人的蒿花粉提取物以及四种组分IgE值比较，其中，实心点为哮喘组，空心为非哮喘组。
[0029]图7为蒿花粉过敏原组分阳性数量与病症发生比率的关系，其中，0-4代表测试的4个过敏原(Art v 1、Art ar 2、Art v 3、Art an 7)有几个为阳性IgE(≥0.35kUA/L视为阳性)，过敏性哮喘(Asthma)、结膜炎(Conjunctivitis)、鼻炎(Rhinitis)、皮疹(Eczema)。[0030]图8为四种组分检测阳性率与哮喘发生的关系图。
具体实施方式
[0031]北艾(w6)及其组分Art v 1(w231)和Art v 3(w233)ImmnuoCAP：购自瑞典赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)(货号分别为14-4103-1；14-4970-01；14-4938-01)。
[0032]Art ar 2(GenBank号为MF326217)为使用特异单抗免疫纯化所得。
[0033]Art an 7(GenBank号为KY428925)来源于黄花蒿花粉提取纯化(具体见公开号为CN106967696A的中国发明专利)。
[0034]Art ar 2和Art an 7特异性IgE测试需要应用购自瑞典赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)的链霉亲和素CAP(Streptavidin CAP，代码o202，货号14-5320-01)。以0.5μg天然纯化的Art ar 2或Art an 7加入streptavidin-conjugated ImmunoCAP(O212)中37℃温育1小时。
[0035]蒿花粉过敏病例来至山西(SX1～178)，山东(SD1～30)和云南(YN1～32)。本研究经各伦理委员会批准：浙江大学附属第二医院(授权号2011-R-1，2013-67-087)、山西省大同市第三人民医院(授权号2015-001)和山东省烟台毓璜顶医院(授权号2015-164)。过敏性症状诊断分为四种，鼻炎，眼结膜炎，皮疹，过敏性哮喘。
[0036]实施例1
[0037]Art ar 2分离纯化，应用一个鼠单抗C9-C1免疫亲和分离。
[0038]单抗的来源是用100μg艾蒿花粉蛋白提取物各免疫5只小鼠(SCXK(HU)2012-002，中国)，每隔7-14日即注射50μg蒿蛋白提取物，共六次。根据免疫印迹和ELISA筛选获得3个单克隆抗体，其中2个结合Art v 3，一个结合一个分子量大小约为16kDa的蛋白。取适量CNBr-activated Sepharose 4Fast Flow(G
E healthcare)加入4倍体积冷1mM HCl，搅拌并除去液体，ddH2O清洗后与透析至偶联缓冲液的C9-C1单抗混匀，4℃过夜偶联，测定溶液中未偶联蛋白浓度以确定偶联效率，并用至少5倍体积的偶联缓冲液洗去多余配体，将介质转至0.1M Tris-HCl溶液(pH 8.0)中，4℃过夜封闭未结合位点，然后用3倍体积洗液A-3倍体积洗液B的顺序清洗，重复3-6次，装入C column(GE healthcare)配合AKTA系统(GE
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