(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201410576871.8
(22)申请日 2014.10.24
A61K 48/00(2006.01)
A61P 29/00(2006.01)
A61P 11/00(2006.01)
(71)申请人杭州师范大学
地址310018 浙江省杭州市余杭区仓前街道
海曙路58号
(72)发明人史丽云 应航洁 卢哲
(74)专利代理机构杭州求是专利事务所有限公
司 33200
代理人
杜军
(54)发明名称
的应用
(57)摘要
本发明公开miR-127抑制剂在制备抗炎和肺
损伤保护药物的应用。抑制miR-127能够有效预
减少炎症细胞的浸润。本发明揭露了miR-127抑
制剂可用于制备预防急性肺损伤及其并发症药
物，以及miR-127抑制剂用于预防急性肺损伤及
其并发症的作用机制。miR-127抑制剂以Bcl6为
靶标，通过调节Bcl6/Dusp1/JNK 通路而抑制LPS
诱导的炎症反应。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书1页 说明书12页序列表6页 附图6页
(10)申请公布号CN 104548132 A (43)申请公布日2015.04.29
C N 104548132
A
1. miR-127抑制剂在制备抗炎和肺损伤保护药物的应用。
2.如权利要求1所述的miR-127抑制剂在制备抗炎和肺损伤保护药物的应用，其特征在于所述的miR-127抑制剂为anti-miR-127。
miR-127抑制剂在制抗炎和肺损伤保护药物的应用
技术领域
[0001] 本发明属生物医学类技术领域，涉及miR-127抑制剂在制备抗炎和肺损伤保护药物的应用。
背景技术
[0002] 急性肺损伤以肺间质中大量炎症因子的释放，炎症细胞的聚集，纤维素沉积和肺水肿为病理生理特征。失调的炎症反应引起组织的严重损伤和肺功能的持续恶化。现在科学界对于急性肺损伤及其并发症的起因还未有深入研究，也没有开发出有效的方法。因此，急性肺损伤的死亡率至今高达40％。
[0003] microRNAs(miRNAs，小RNA)是一类长度在18-25个核甘酸的单链小RNA分子，它主要通过与相
关蛋白质形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)，抑制其靶基因的翻译或者促进靶基因mRNA的降解，以实现对目标基因的转录后调控。这类小RNA分子的表达具有空间和时间上的特异性，对于细胞的增殖，凋亡，分化以及器官的形成具有重要的调控意义。目前，miRNA的研究发展十分迅速，随着研究手段和方法的不断进步，已有成百上千种miRNA被发现(Murray PJ,Wynn TA.Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.Nat Rev Immunol 2011；11:723-737；Wynn TA,Chawla A,Pollard JW.Macrophage biology in development,homeostasis and disease.Nature 2013；496:445-455；Sindrilaru A,Peters T,Wieschalka S et al.An unrestrained proinflammatory M1 macrophage population induced by iron impairs wound healing in humans and mice.J Clin Invest 2011；121:985-997)。miR-127是一具有重叠基因结构的非编码小RNA。研究显示，miR-127在肺部发育、胚胎形成等方面具有一定的调控作用(Martinez FO,Helming L,Gordon S.Alternative activation of macrophages:an immunologic functional perspective.Annu Rev Immunol 2009；27:451-483)，抑制miR-127的表达能促进肝癌发生(Gautier EL,Shay T,Miller J et al.Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.Nat Immunol 2012；13:1118-1128)，并与弥漫性大B细胞淋巴瘤发生密切相关(Foster SL,Hargreaves DC,Medzhitov R.Gene-specific control of inflammation by TLR-induced chromatin modifications.Nature 2007；447:972-978)。
[0004] 固有免疫是物种进化和个体发育过程中形成的一系列防御体系，它作用无针对性，与生俱来，因此又被称为非特异性免疫应答。天然免疫应答是由能够识别病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular Patterns,PAMPs)的受体所介导的，这些受体统称为模式识别受体(Pattern recognition receptors，PRRs)。主要表达于树突状细胞(dendritic cells，DC)和巨噬细胞表面的Toll样受体(toll-like receptors，TLRs)正是这一类重要的PRRs。此类受体最早是从果蝇体内分离得到的，主要是与果蝇胚胎背、腹侧的发育和非特异性免疫反应有关(Ivashkiv LB.Epigenetic regulation of macrophage
polarization and function.Trends Immunol 2013；34:216-223)。所有的TLRs均属于I型跨膜蛋白，胞外区由18-31个氨基酸组成的富含亮氨酸的重复序列LRR(leucine rich repeats)组成，胞内区约有200个氨基酸，与白介素-1(interleukin-1,IL-1)受体胞内区相似，称为TIR(Toll/IL-1 receptor)区。它们可直接识别某些病原体或其产物所共有的PAMPs，包括细菌细胞壁脂质组分如脂多糖、脂肽，病原微生物蛋白组分如鞭毛蛋白，核酸如单链或双链RNA(核糖核苷酸)以及非甲基化CpG(胞嘧啶磷酸鸟苷)DNA(脱氧核糖核苷酸)基序等。然后，激活下游髓样分化因子(myeloid differentiation factor88,MyD88)和Toll样受体相关的干扰素活化子(Toll/IL-1R homology domain-containing adaptor inducing interferon-β,TRIF)依赖信号通路，进而激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和核转录因子κB抑制蛋白(IκB,inhibitor of NF-κB)等信号，最终激活免疫细胞并产生炎症因子和I型干扰素，成为机体免疫系统中抵御病原体入侵的首道屏障(Bartel DP.MicroRNAs:target recognition and regulatory functions.Cell2009；136:215-233)。
[0005] 目前大量的研究已经显示，miRNA在免疫反应中发挥极其重要的作用。miRNA不仅参与了免疫细胞的发育和分化，而且还对免疫反应的起着调控作用。例如miR-181a 在造血干细胞的异位表达可增加B淋巴细胞的生成，减少T淋巴细胞的生成，miR-181a 调节着T、B淋巴细胞的分化(O'Connell RM,Rao DS,Chaudhuri AA,Baltimore D.Physiological and pathological roles for microRNAs in the immune system. Nat Rev Immunol 2010；10:111-122)。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可诱导上调人类单核细胞中miR-146的表达，而表达升高的miR-146可通过其靶基因白介素-1受体相关激酶1(interleukin-1 receptor-associated kinase,IRAK-1)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor-associated factor 6,TRAF6)负调节 TLR4诱导的炎症反应(Lodish HF,Zhou B,Liu G,Chen CZ.Micromanagement of the immune system by microRNAs.Nat Rev Immunol 2008；8:120-130)。miR-147与miR-146相似，可诱导表达于小鼠的巨噬细胞中，对TLRs诱导的炎症反应起着负调节作用(Chaudhuri AA,So AY,Sinha N et al.MicroRNA-125b potentiates macrophage activation.J Immunol2011；187:5062-5068)。miR-155作为一个重要的诱导性miRNA，能够作用于其靶基因SHIP1(SH2-containing phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate5-phosphatase 1,SH2结构域的I型肌醇5磷酸酶)，从而抑制LPS诱导的MAPK信号通路的活化(O'Connell RM,Taganov KD,Boldin MP,Cheng G,Baltimore D.MicroRNA-155 is induced during the macrophage inflammatory response.Proc Natl Acad Sci U S A 2007；104:1604-1609)。虽然目前已经发现不少miRNA与免疫反应相关，但是miRNA对免疫反应的调节机制的研究很多并不明确，也不够完善，有关miR-127在炎症反应中的调控作用更是未见报道。在本专利中我们首次发现了miR-127参与调
控LPS诱导的炎症应答，揭示了miR-127对TLR介导的天然免疫应答的调控功能及其作用机制，证明了抑制miR-127在抗炎和抑制肺损伤中的作用。
发明内容
[0006] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供miR-127抑制剂在制备抗炎和肺损伤
保护药物的应用。
[0007] 所述的miR-127的核苷酸序列如下：
[0008] CCAGCCTGCTGAAGCTCAGAGGGCTCTGATTCAGAAAGATCATCGGATCCGTCTGAGCTTGGCTGGTC GG，如SEQ ID NO.1所示。
[0009] 作为优选，所述的miR-127抑制剂为anti-miR-127，可通过购买取得。
[0010] 抑制miR-127的anti-miR-127的有效用量为2 mg/kg，药物配成溶剂，以气道灌注方式给药。
[0011] miR-127在不同TLR配体的刺激下呈现出不同的时间依赖性，但都在16个小时表达最高；miR-12
7随LPS刺激表达上调主要是受到NF-κB(核因子κB，Nuclear Factor-κB)的调控，同时，miR-127能够增强由LPS诱导的NF-κB和JNK(c-Jun氨基末端激酶，c-Jun N-terminal kinase)信号通路的活化。在巨噬细胞中过表达miR-127后，IL-6(白介素6，interleukin-6)、TNF-α(肿瘤坏死因子α，tumor necrosis factorα)、IL-1β(白介素1β，interleukin-1β)等M1型炎症因子表达显著上调，IL-10(白介素10，interleukin-10)等M2型炎症因子表达显著下调。通过小鼠气道灌注LPS建立小鼠急性肺损伤模型，通过对炎症因子表达、组织病理学切片等多项指 标检测，证明符合小鼠急性肺损伤表现，造模成功。我们发现通过气道灌注anti-miR-127来抑制miR-127可以显著减少促炎因子的产生，减弱气道的炎症反应，减少炎症细胞的浸润。除此之外，我们发现miR-127对Bcl6(B细胞淋巴瘤6，B-cell lymphoma 6 protein)具有靶向作用，通过调节Bcl6/Dusp1(双特异性磷酸酶1，Dual specificity protein phosphatase 1)/JNK通路来增强巨噬细胞向M1型的极化和炎症反应。以上实验结果揭示了miR-127在肺部炎症疾病中的作用及机理，证明了通过抑制miR-127的表达可以有效控制炎症和肺部损伤。[0012] 本发明的有益效果是抑制miR-127能够有效预防肺损伤导致的肺部炎症和损伤。miR-127抑制剂可减少促炎因子的产生，减弱气道的炎症反应，减少炎症细胞的浸润。本发明揭露了miR-127抑制剂可用于制备预防急性肺损伤及其并发症药物，以及miR-127抑制剂用于预防急性肺损伤及其并发症的作用机制。miR-127抑制剂以Bcl6为靶标，通过调节Bcl6/Dusp1/JNK通路而抑制LPS诱导的炎症反应。
附图说明
[0013] 图1为miR-127在不同TLR配体刺激下的表达；其中(a)为LPS，(b)为Pam3CSK，(c)为S.aureus,(d)为poly(I:C)，(e)为CpG；
[0014] 图2为LPS诱导的miR-127的上调表达依赖于NF-κB途径；其中(a)为PDTC处理，(b)为U0126处理，(c)为Wortmannin处理；
[0015] 图3为miR-127对LPS活化的巨噬细胞IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-10产生的影响；其中(a)为miR-127过表达细胞中IL-6的表达，(b)为miR-127过表达细胞中TNF-α的表达，(c)为miR-127过表达细胞中IL-1β的表达，(d)为miR-127过表达细胞中IL-10的表达，(e)为miR-127抑制细胞中IL-6的表达，(f)为miR-127抑制细胞中TNF-α的表达，(g)为miR-127抑制细胞中IL-1β的表达，(h)为miR-127抑制细胞中IL-10的表达；[0016] 图4为miR-127对LPS诱导的巨噬细胞中炎症因子分泌的影响；其中(a)为miR-127过表达细胞中IL-6的分泌，(b)为miR-127过表达细胞中TNF-α的分泌，(c)
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